双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法ppt课件

测序原理及流程图
测序原理
目前关于测序方法主要采用双脱氧链终止法，双脱氧链终止法又称为Sanger法，其原理是DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)存在下进行复制时，在四管反应体系中分别按一定的比例引入四种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。

由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，当ddNTP掺入链的末端时，该链就会停止延伸。

如此每管反应体系中就产生了一系列长度不等的以ddNTP为3’端的DNA片段。

反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳以分离长短不一的DNA片段，相邻的片段长度相差一个碱基。

经放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可获得合成片段的碱基排列顺序。

我们使用的是ABI3730测序仪以及配套的BigDye Terminator Kit，original v3.1我公司目前采用Applied Biosystems 3730XL测序仪是高质量的长片段读取和序列分析的测序平台，应用灵活而广泛。

3730XL可同时分析96个样品，该仪器采用4色荧光同时检测，可不间断24小时运行，自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数据分析。

测序流程图。

[目的]掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法[原理]DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。

由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3’-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。

本实验根据此原理，将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。

实际操作中同时进行，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。

每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物，其中—种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。

但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，这样ddN TP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。

例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。

将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。

其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。

由于：①即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据其电泳距离的差异而加以区分；②A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。

故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。

[操作]1．单链模板与引物退火(1)用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44μg/ml)。

(2)取1.5ml微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2ugDNA/10μl)10μl；稀释通用引物2μl；退火缓冲液2μl,总体积14μl。

2．链延伸/终止反应(1)稀释T7DNA聚合酶：取2μl(或4μl)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5μl(或lμl)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽吸和排出而混匀，置冰浴中待用。

双脱氧终止法的原理(一)双脱氧终止法1. 介绍•双脱氧终止法是一种常用的DNA测序技术，也被称为Sanger测序法。

它是由弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）在20世纪70年代开发的。

•这种技术基于DNA的合成与复制原理，通过测定DNA链上不同位置的碱基序列，从而揭示DNA分子的结构和功能。

2. 原理该方法主要包括以下步骤：DNA复制•首先，需要复制待测DNA片段。

这一步通过PCR（聚合酶链式反应）来实现，PCR能够使DNA在体外被扩增成大量拷贝。

dNTP与ddNTP的标记•在复制的过程中，需要加入一种更特殊的DNA构建块：ddNTP （2’, 3’- 二脱氧核苷三磷酸），与普通的dNTP（2’, 3’-二脱氧内苷三磷酸）有所不同。

•ddNTP会在DNA链的延伸过程中停止进一步延伸，而dNTP可以持续延伸。

反应体系•反应体系中，含有待测DNA片段的DNA模板、引物（合成DNA的起始点），dNTPs（分子内苷三磷酸）、ddNTPs和DNA聚合酶。

•反应体系中含有4种不同的ddNTP，分别对应A、T、C和G四种碱基。

DNA合成与终止•反应进行时，聚合酶从引物延伸模板，向复制链上加入适当碱基，与模板DNA的互补碱基对应。

•当遇到某个ddNTP时，链的延伸被终止，因为ddNTP没有羟基(OH)可以与下一个碱基连接。

•这样，在反应体系中就会产生一系列碱基长度不同的DNA片段。

碱基定序•终止反应后，产生的DNA片段通过电泳分离。

电泳是一种根据DNA片段大小和电荷质量之比进行分离的技术。

•在电泳过程中，DNA片段会根据其长度从短到长依次分离出来。

•最终，可以以碱基对应的顺序来识别不同长度的DNA片段，从而得出DNA的碱基序列。

3. 结论•双脱氧终止法是一种可靠而有效的DNA测序技术，被广泛应用于生物学、医学等领域。

•通过特殊标记的ddNTP与普通的dNTP的结合，可以在延伸过程中终止链的延伸，从而产生一系列长度不同的DNA片段。

双脱氧终止法测序的原理双脱氧终止法测序，听起来是不是有点复杂？其实它就像一场科学界的精彩戏剧，让我们一起看看这个有趣的过程吧！这种测序方法的名字就有点意思，“双脱氧”听上去像是什么魔法药水，其实它是DNA的基本构件之一。

想象一下，DNA就像一条长长的双螺旋楼梯，而我们要做的，就是找出这条楼梯上每一步的秘密。

说白了，就是要弄清楚DNA里面的“字母”是什么。

好了，首先要准备一些小助手，叫做“脱氧核苷酸”，这些小家伙是DNA的拼图块，它们有四种，分别是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。

这个时候，我们的主角“DNA模板”登场了，科学家们会把要测序的DNA分子放进去，然后加上这些脱氧核苷酸。

听到这，你是不是有点兴奋？就是关键时刻，加入了特殊的“终止剂”，就像在比赛中设立了终点线。

这时候有趣的事情发生了！终止剂会和脱氧核苷酸结合，导致DNA合成在某个特定位置停止。

就像我们在聚会上跳舞，忽然DJ放了一首慢歌，大家都停下来了。

这个停下来的点，正好就是我们需要记录的“字母”。

科学家们用各种方法把这些终止的DNA 片段分开，然后再进行分析，最终把每一个“字母”都一一拼凑起来。

可能有些朋友会问了，这种方法有什么特别之处呢？双脱氧终止法是非常准确的，就像精致的钟表，能精确到每一秒。

这种方法的发明者还因此获得了诺贝尔奖，真是值得点赞！这种测序方式的应用可广泛了，比如在医学上帮助我们了解基因病，或者在考古学上让我们找到古老DNA的秘密。

多么令人兴奋的科学探索啊！这一切的背后，都离不开科学家们的努力。

想象一下，他们在实验室里穿着白大褂，手里拿着各种设备，脸上挂着认真又兴奋的神情。

为了一个个数据，他们可谓是绞尽脑汁，有时候甚至会遇到意想不到的挑战。

比如，可能会出现一些干扰因素，影响测序的准确性，这时候就得重新审视整个过程，确保每一步都走得稳稳当当。

双脱氧终止法测序就像是科学界的一场大冒险，既有挑战又有惊喜。

每一个字母的拼凑，都像是解开了一道道谜题，让我们更加了解生命的奥秘。

DNA序列测定：Sanger双脱氧链末端终止法一、测序原理Sanger等于1977年在加减法测序的基础上发明了双脱氧链末端终止法（chain termination method），又称酶法或Sanger法。

其原理是利用DNA聚合酶，以单链或双链DNA为模板，以dNTP为底物，其中一种dNTP带放射性核素标记（或引物末端核素标记），在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的2′，3′-双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成4组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后识读待测DNA的互补序列（图-1）。

DNA聚合酶能催化dNTP的5′磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′，5′-磷酸二酯键。

通过磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA 从5′→3′不断延伸。

ddNTP比dNTP在3′位置缺少一个羟基，可以通过其5′磷酸基团掺入到正在延伸的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′，5′-磷酸二酯键，便发生了特异性的链终止效应。

在4组独立的反应体系中，分别加入不同ddNTP，并通过控制dNTP/ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于模板DNA上的每个可能掺入ddNTP的位置都有可能发生终止，结果产生4组分别终止于互补链的每一个A、G、C和T位置的一系列长度的寡核苷酸链。

在这种测序方式中，每个延伸反应的产物是一系列长短不一的引物延伸链，它们都具有由退火引物所决定的5′端和终止于某一ddNTP的不定的3′端，延伸产物片段长度相差仅一个碱基。

通过高分辨率测序凝胶电泳，从放射自显影胶片上就可直接读出待测DNA的互补链的核苷酸顺序（图-2）。

二、测序体系（一）待测模板单链DNA与双链DNA均可作为Sanger法测序的模板。

1.单链DNA模板按照经典的测序反应，一般是将靶DNA片段克隆于M13mp载体中，从而得到单链的DNA模板进行测序。

DNA测序的方法有很多种. 目前最常见的是双脱氧终止法了. 在测序用的缓冲液中含有四种dNTP及聚合酶. 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后进行聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP会随机地代替dATP参加反应一旦ddATP加入了新合成的DNA链, 由于其3位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸. 所以第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了; 同理第二个反应产生的都是以C结尾的; 第三个反应的都以G结尾, 第四个反应的都以T结尾, 电泳后就可以读出序列了. 也许这样说你不一定明白. 举一个例子, 假如有一个DNA, 互补序列是GATCCGAT, 我们试着做一下:在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP, 所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题, 但遇到A时, 掺入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是ddATP则终止, 产生一个仅有2个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸, 可以产生序列GATCCG, 又到了下一个A了. 同样有两种情况, 如果是ddATP掺入, 则产生的序列是GATCCGA, 延伸终止, 否则可以继续延伸, 产生GATCCGAT. 所以在第一个反应系统中产生的都是以A结尾的片段:GA, GATCCGA,同理在第二个反应中产生的都是以C结尾的片段:GATC, GATCC,在第三个反应中产生的都是以G结尾的片段:G, GATCCG在第四个反应中产生的都是以T结尾的片段:GAT, GATCCGAT,电泳时按分子量大小排列, A反应的片段长度为2, 7; C反应的为4, 5; G反应的为1, 6; T反应的为3, 8, 四个反应的产物分别电泳, 结果为8 7 6 5 4 3 2 1A | |C | |G | |T | |我们可以从右向左读, 为GATCCGAT, 至此, 测序完成。