Sanger双脱氧链终止法课件

双脱氧终止法的原理(一)双脱氧终止法1. 介绍•双脱氧终止法是一种常用的DNA测序技术，也被称为Sanger测序法。

它是由弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）在20世纪70年代开发的。

•这种技术基于DNA的合成与复制原理，通过测定DNA链上不同位置的碱基序列，从而揭示DNA分子的结构和功能。

2. 原理该方法主要包括以下步骤：DNA复制•首先，需要复制待测DNA片段。

这一步通过PCR（聚合酶链式反应）来实现，PCR能够使DNA在体外被扩增成大量拷贝。

dNTP与ddNTP的标记•在复制的过程中，需要加入一种更特殊的DNA构建块：ddNTP （2’, 3’- 二脱氧核苷三磷酸），与普通的dNTP（2’, 3’-二脱氧内苷三磷酸）有所不同。

•ddNTP会在DNA链的延伸过程中停止进一步延伸，而dNTP可以持续延伸。

反应体系•反应体系中，含有待测DNA片段的DNA模板、引物（合成DNA的起始点），dNTPs（分子内苷三磷酸）、ddNTPs和DNA聚合酶。

•反应体系中含有4种不同的ddNTP，分别对应A、T、C和G四种碱基。

DNA合成与终止•反应进行时，聚合酶从引物延伸模板，向复制链上加入适当碱基，与模板DNA的互补碱基对应。

•当遇到某个ddNTP时，链的延伸被终止，因为ddNTP没有羟基(OH)可以与下一个碱基连接。

•这样，在反应体系中就会产生一系列碱基长度不同的DNA片段。

碱基定序•终止反应后，产生的DNA片段通过电泳分离。

电泳是一种根据DNA片段大小和电荷质量之比进行分离的技术。

•在电泳过程中，DNA片段会根据其长度从短到长依次分离出来。

•最终，可以以碱基对应的顺序来识别不同长度的DNA片段，从而得出DNA的碱基序列。

3. 结论•双脱氧终止法是一种可靠而有效的DNA测序技术，被广泛应用于生物学、医学等领域。

•通过特殊标记的ddNTP与普通的dNTP的结合，可以在延伸过程中终止链的延伸，从而产生一系列长度不同的DNA片段。

DNA序列测定：Sanger双脱氧链末端终止法一、测序原理Sanger等于1977年在加减法测序的基础上发明了双脱氧链末端终止法（chain termination method），又称酶法或Sanger法。

其原理是利用DNA聚合酶，以单链或双链DNA为模板，以dNTP为底物，其中一种dNTP带放射性核素标记（或引物末端核素标记），在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的2′，3′-双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成4组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后识读待测DNA的互补序列（图-1）。

DNA聚合酶能催化dNTP的5′磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′，5′-磷酸二酯键。

通过磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA 从5′→3′不断延伸。

ddNTP比dNTP在3′位置缺少一个羟基，可以通过其5′磷酸基团掺入到正在延伸的DNA链中，但由于缺少3′-OH，不能同后续的dNTP形成3′，5′-磷酸二酯键，便发生了特异性的链终止效应。

在4组独立的反应体系中，分别加入不同ddNTP，并通过控制dNTP/ddNTP的比例，使引物的延伸在对应于模板DNA上的每个可能掺入ddNTP的位置都有可能发生终止，结果产生4组分别终止于互补链的每一个A、G、C和T位置的一系列长度的寡核苷酸链。

在这种测序方式中，每个延伸反应的产物是一系列长短不一的引物延伸链，它们都具有由退火引物所决定的5′端和终止于某一ddNTP的不定的3′端，延伸产物片段长度相差仅一个碱基。

通过高分辨率测序凝胶电泳，从放射自显影胶片上就可直接读出待测DNA的互补链的核苷酸顺序（图-2）。

二、测序体系（一）待测模板单链DNA与双链DNA均可作为Sanger法测序的模板。

1.单链DNA模板按照经典的测序反应，一般是将靶DNA片段克隆于M13mp载体中，从而得到单链的DNA模板进行测序。