小儿巨细胞病毒感染的研究进展摘要：巨细胞病毒（cytomegaIovirus，CMV）感染是婴幼儿最常见感染之一，可导致生殖泌尿、中枢神经、肝脏等各系统感染，从无症状感染直到严重缺陷或死亡。
本文主要对CMV的临床表现，发病机制，检测方法，动物模型以及疫苗的研发等方面进行综合阐述。
关键词：巨细胞病毒；pp65抗原检测；动物模型；巨细胞病毒疫苗巨细胞病毒（cytomegaIovirus，CMV）感染又称巨细胞包涵体病，是由人巨细胞病毒（human cytomegalovirus ，HCMV）感染所导致的一种先天性或后天性全身感染性疾病。
CMV是一种疱疹病毒，为双链DNA病毒，引起以生殖泌尿系统，中枢神经系统和肝脏疾患为主的各系统感染，从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。
巨细胞感染可发生于先天，产后或任何年龄，但大多数是发生在幼年时期。
我国是巨细胞病毒感染高发区，有报道，我国成人CMV-IgG阳性率为90%，儿童至12岁时已高达80%。
所以，要控制和降低CMV感染率，婴幼儿时期的监测与防范就显得尤为重要。
本文就近年来有关小儿巨细胞病毒感染的研究状况进行归纳总结，为临床合理的诊疗提供科学依据。
1 传播途径和发病机制CMV通过血液、体液和移植器官传播，感染可发生于移植时或出生时。
感染时CMV能经吞噬细胞在体内扩散，同时与内皮生长因子受体结合进入宿主细胞。
病毒的DNA 片段组合到人体血管细胞的DNA中，改变其基因功能和脂质代谢，并激活凝血系统以及细胞因子和生长因子基因，促进血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）的表达，促使白细胞和血小板黏附，损伤内皮细胞[1]。
巨细胞病毒侵入人体后，大多表现为亚临床感染，主要潜伏于血管平滑肌细胞和内皮细胞中。
CMV基因组含有其他辅助基因，可以参与免疫逃避或者抑制细胞死亡，致使病毒和宿主共生。
机体中T细胞、NK细胞等介导的细胞免疫起到重要的预防和控制作用，可是也不能完全清除病毒，使大部分人成为隐性或潜伏感染[2]。
CD34+祖细胞被认为是CMV潜伏之处，但其分子机制仍不明确[3]。
2流行病学CMV在人群中感染广泛，发达国家成人血清CMV抗体阳性率约55%[4]，中国是CMV感染高发区，孕妇抗体阳性率高达90.0%～97.7%[5]。
先天性CMV感染发病率在世界范围内为0.2%～2.5%[6]。
有报道上海地区1～3岁儿童CMV 感染血清阳性率为60.37%[7]，南京地区8岁内儿童血清总阳性率为82.4%[8]。
3临床表现CMV感染可累及全身多个系统及脏器，儿童感染巨细胞病毒多表现为黄疽、肝脾肿大、皮下出血点或红斑等，并可引发听力、视觉、运动等多种后遗症。
CMV可长期甚至终身存在于机体内，在机体免疫力强时，可表现为潜伏性感染，对于机体免疫不成熟或免疫抑制个体，就可以表现出明显的症状，这主要是因为巨细胞病毒感染的靶器官与宿主的年龄有关，因此，儿童感染巨细胞的阳性率高于成人，尤其是婴幼儿。
我国1岁婴儿中66%～80%都曾感染过CMV[6]。
婴儿感染CMV 后，肝炎是CMV感染的主要临床表现形式，可以表现为黄疸消退延迟、直接胆红素水平升高、大便颜色变浅、肝功能异常和肝脾肿大[9]。
CMV除了可以引起呼吸系统和消化系统方面的常见症状外，血液系统疾病所占比例也在上升。
有报道受CMV感染的新生儿50%以上有血小板减少和紫癜[10]。
也有文章指出ITP患儿CMV一IgM阳性率为41.5%，而CMV一IgG阳性率也高达75.5%[11]。
Sheng[12]等的研究显示CMV感染可能是ITP的发病机制之一。
CMV致I T P的机制尚未完全阐明，其可能机制包括自身免疫反应及对骨髓的抑制作用。
4实验室诊断方法4.1 CMV包涵体检测检测标本（血清、尿液、唾液等）经离心沉淀后，将沉淀物染色镜检，观察有无CMV包涵体。
该法成本低廉，操作简单。
但是患者体液中的病毒含量少，检出率低，需多次连续采集标本，且包涵体不易分辨，所以此法阳性率低，不适合早期诊断。
4.2病毒分离培养病毒分离被认为是CMV实验室诊断的金标准。
常规分离法中，将检测标本（血、体液等）接种在人纤维母细胞中，但增殖速度非常缓慢，检测周期需2～6w，现主要用于科研[13]；快速分离法中，将低速离心后的标本接种于人纤维母细胞中，在36℃下培养16～36h，用荧光标记物或酶免疫法单克抗体直接检测CMV感染后表达的α、β蛋白[14]，但是敏感性较低。
4.3抗原检测通过荧光免疫组化法技术进行血磷酸基质蛋白65（pp65）抗原血症测定。
CMV- pp65抗原是CMV-UL83基因编码的早期即刻蛋白，位于衣壳与包膜之间，在CMV-DNA复制早期就有合成，调控随后的病毒基因的表达及DNA合成，是体内活动性CMV早期复制的标志。
在CMV 活动期时，pp65持续高水平表达，潜伏期时表达极低，一般检测不到[15]。
有论著表明pp65阳性可作为治疗CMV感染的主要指标，可以不参考其他检测指标[16]。
此法的缺点为在使用过抗病毒药物后，pp65的阳性率会明显下降。
4.4 抗体检测实验室常用法为酶联免疫吸附试验（ELISA）检测CMV的IgM、IgG、IgA。
CMV的IgM阳性也是CMV活动期的重要指标之一。
IgM阳性提示患者为原发性感染或者再次感染后的持续阳性状态。
但是CMV-IgM 检测存在一定的局限性：①当患者处于免疫抑制状态时，可能不出现IgM抗体；②体内的类风湿因子可以引起假阳性；③某些疱疹病毒可以发生交叉反应；④部分患者再次感染时，IgM可能为假阴性；⑤血清反应的滞后性，当血清学反应出现时病毒血症可能已经消失，使临床难以获得病毒活动的直接证据。
CMV的IgG阳性表明为既往感染，在IgG两次检测中，滴度呈四倍升高，提示有活动性感染。
国外研究显示，68.3%的妊娠期妇女血清CMV IgG阳性，其中约0.8%存在活动性CMV感染[17]。
在我国约有95.3%CMV IgG阳性的孕妇，其中3.5%存在急性或活动性CMV感染[18]。
所以实验室常进行CMV的IgM和IgG的联合检测，有助于提高检测率。
4.5荧光定量聚合酶链反应（polymerase chainreaction，PCR）检测目前，采用荧光定量PCR技术在小于2w的新生儿体液标本中检出CMV-DNA可用于快速诊断先天性CMV感染，其特异性及敏感性与病毒分离法相近[19]。
与普通原位探针相比，荧光定量PCR 多添加了一对特异性的探针，荧光发光基团位于5'端，在PCR 扩增时对信号单位进行计算并与标准曲线进行比照，可得精确样品DNA 含量[20]。
PCR方法监测CMV能真实地反映病毒的存在与复制的情况，可减少血清学试验所致的假阴性。
方法可采集患儿的血液、尿液、唾液[21]进行监测，还可以对患儿母亲的乳汁进行分析，便于临床医生分析病情，做出判断。
在许多医院，通常先进行血清学试验初筛出阳性标本后，再做荧光定量PCR确诊。
但是PCR确诊CMV-IgG 阳性的新生儿为先天性CMV感染的成本效益比远高于CMV-IgM阳性的患儿，对于CMV-IgG阳性新生儿，该法不适合于大规模流行病学诊断性研究[22]。
4.6基因芯片技术检测标本先经PCR扩增后获得病原基因片段，再与基因芯片上特异性核酸探针杂交以区分感染是否存在和感染的病原，最后通过生物传感器的生物信号原位放大原理，实现高灵敏度的检测。
与传统基因诊断技术相比，基因芯片的明显优势在于更快速高效、成本大大降低，自动化程度显著提高等。
5建立巨细胞感染动物模型为了进一步了解CMV的感染机制，国内外学者们建立了不同的动物感染模型。
常见CMV感染动物的模型有以下几种[23]：①鼠模型，其中又分为鼠巨细胞病毒（Murine Cytomegalovirus，MCMV）感染鼠模型和人巨细胞病毒感染鼠模型；②猴模型；③兔模型。
常用的接种途径有[23]：腹腔注射接种、静脉注射接种、脑内注射接种、皮下接种等。
在对新生儿先天性CMV感染致畸机制的研究中，陈莉[24]等模拟HCMV经胎盘垂直传播的感染途径，在国内首次通过显微注射方式经胎盘接种MCMV建立MCMV宫内感染模型，为胎儿宫内感染机制提供了一个良好的实验模型。
CMV 感染动物模型最大的优势在于通过建立科学性、实用性、重现性良好的感染动物模型，对人感染CMV的药物治疗、预防及引起其他临床疾病的病因学进行确切评估。
6 HCMV疫苗的研发HCMV疫苗研究可以追溯到20世纪70年代，第一代疫苗主要是Towne减毒株和成纤维细胞传代培养ADl69株活病毒疫苗，这些疫苗虽然有免疫原性，但临床预防效果差[25]。
近年来，对HCMV候选疫苗的研制已进入第三代，目前正在进行临床试验。
主要有以下四种[26]：①由重组HCMV包膜糖蛋白B（gB）/MF59佐剂组成的亚单位疫苗；②表达gB 和pp65的DNA疫苗；③表达gB和pp65一IEl的甲病毒属复制子颗粒；④pp65多肽疫苗。
，当前的HCMV候选疫苗已经在高危人群、移植患者、育龄妇女和青少年群体中预防HCMV相关疾病和感染方面取得了令人鼓舞的成绩。
7结论综上所述，人们对CMV感染导致的小儿疾病或畸形已非常重视，目前应用一些手段可以早期发现和治疗，但其明确的影响机制仍需要进一步的研究和探讨。
随着分子生物学技术的不断发展，更加快速、准确、方便的检测方法将逐步应用于小儿CMV感染的临床检测中。
另外，现有的研究表明HCMV疫苗是有效可行的。
相信随着对巨细胞研究的不断深入和技术的不断完善，最终有望成功开发HCMV疫苗用于HCMV感染的防治。
参考文献：[1]张冬娜，赵军.人巨细胞病毒感染及作用机制研究[J].中国生物品学杂志，2008，21（2）：158-161.[2]侯安存.儿童CMV感染的中西医结合诊疗[J].现代中西医结合杂志，2012，21（35）：3973-3976.[3]Kosugi I.Cytomegalovirus[J].Uirusu，2010，60（2）：209-220.[4]Bate SL，Dollard SC，Cannon MJ.Cytomegalovirus seroprevalence in the United States：the national health and nutrition examination surveys，1988-2004[J].Clin Infect Dis，2010，50（11）：1439-1447.[5]龚波，张昕明，李俊，等.妇女风疹病毒，弓形虫、巨细胞病毒感染调查分析[J].中国实验诊断学，2011，15（3）：468-472.[6]徐放生.更昔洛韦治疗新生儿和婴儿巨细胞病毒感染的国内外现状及建议[J].中国新生儿科杂志，2009，24（5）：266-269.[7]Fang FQ，Fan QS，Yang ZJ，et a1.Incidence of cytomegalovirus infection in Shanghai，China[J].Clin Vaccine Immunol，2009，16（11）：1700-1703.[8]吴美玲，陈洁，等.南京市0～8岁儿童巨细胞病毒感染流行病学调查[J].中华实用儿科临床杂志，2013，28（4）：298-299.[9] Tian CX，Ali SA，Weitkamp JH.Congenital infections，Part I：cytomegalovirus，toxoplasma，rubella，and herpes simplex[J].NeoReviews，2010.11：e436-446.[10]李光艳.巨细胞病毒感染与急性特发性血小板减少性紫癜相关性探讨[J].中外健康文摘，2013，10（14）：234-235.[11]林雯，肖燕，刘勤，等.血小板减少性紫癜患儿巨细胞病毒感染的研究[J] .中国小儿血液，2002，7（2）：49-51.[12]Sheng Yu Z，Tang LF，Zou CC，et al.Cytomegalovirus 一associated idiopathic thrombocytopenic purpura in Chinese children[J].Scand J Infect Dis，2008，40：922-927.[13]Yoshida A. Laboratory diagnosis of cytomegalovirus infections and disease[J].Rinsho Byori，2008，56（11）：1034-1042.[14]张书红.人巨细胞病毒感染检测方法的研究进展[J].医学综述，2009，15 （22）：3495-3497.[15]许增华，杨文萍，等.血PP65抗原检测在诊断巨细胞病毒感染上的应用[J].中外健康文摘，2013，10（18）：63-64.[16]Saitoh A，Sakamoto S，Fukuda A.Auniversal preemptive therapy for cytomegalovirus infections in childrenafter live-donor liver transplantation[J] .Transplantation，2011，92（8）：930-935.[17] De Paschale M，Agrappi C，Manco MT，eta1.Incidence and risk of cytomegalovirus infection during pregnancy in an urban area of Northern Italy[J].Infect Dis Obstet Gynecol，2009：206 505.[18] 饶美兰，郑英，张畅斌，等.孕妇巨细胞病毒感染及其母婴垂直传播[J].中国生育健康杂志，2008，19：9l一94.[19] Lazzarotto T，Guerra B，Gabrielli L.et a1.Update on the prevention，diagnosis and management of cytomegalovirus infection during pregnancy[J].Clin Microbial Infect，2011，17：1285-1293.[20] Vincent E，Gu ZM，Gibson C，et al. Detection of cytomegalovirus in whole blood using three different real-time PCR chemistries[J].Journal of Molecular Diagnostics，2009，11（1）：54-59.[21] 王淮燕，张琳，等.利用唾液标本筛查先天性巨细胞病毒感染[J].中国围产医学杂志，2013，16（8）：485-488.[22]李禄全，余加林，谭俊杰.FQ-PCR检测法诊断先天性巨细胞病毒感染的卫生经济学评价[J].中国当代儿科杂志，2010，12：796-798.[23] 吴建贤，汪国宏，洪永锋，等.人巨细胞病毒感染相关动物模型的研究进展.安徽医学，2009，30（4）：484-487.[24] 陈莉，陈素华，刘海智，等.经胎盘接种小鼠巨细胞病毒宫内感染模型建立[J].中国优生与遗传杂志，2006，14（3）：55-56.[25] Schleiss MR，Heineman TC.Progress toward an elusive goal：eurrgnt status of cytomegalovimsvaccines[J].Expert Rev Vaccines，2005，4（3）：381-406.[26]唐光美，刘菊.重组人巨细胞病毒疫苗研究进展[J].国际生物制品学杂志，2013，36（4）201-206.编辑/王海静。
