高效毛细管振荡流液滴PCR

利用毛细作用形成液滴序列的进样方法的研究摘要:本文提出一种利用毛细作用在微流控芯片或毛细管内形成液滴序列的新方法,利用毛细作用在微通道内形成有机相间隔的水相液滴。

本方法操作简便,不需其他复杂或者昂贵的驱动方法,极大地降低了操作难度和使用成本,对于基于液滴的分析和检测具有显著的意义。

关键词:微流控芯片毛细管毛细作用液滴进样微流控芯片自从Manz首次提出以来[1],已得到快速发展并应用到各个领域[2,3],实现分析设备的微型化和便携化。

近期在微流控芯片内进行液滴序列的形成、操纵和分析已引起了广泛的关注,单个液滴作为一个微小的反应器,具有高通量和高内涵分析的能力,但较难形成含有不同组成的液滴序列。

方群等提出一种利用毛细管作为接口形成液滴序列的新方法,可以形成任意组成的液滴序列[4],但需要高精密的注射泵进行驱动。

本文提出一种产生液滴序列的简单方法,利用毛细作用进行液流的驱动,实现有机相间隔的水相液滴序列的形成。

1 实验部分1．1 试剂与仪器二氯二甲基硅烷购自国药集团化学试剂有限公司,丙醇、丁醇、戊醇和己醇购自汕头市西陇化工厂有限公司,点样毛细管购自上海欣鹏玻璃仪器有限公司。

XTL－165型体式显微镜(江西凤凰光学),步进电极及其控制系统(东莞航宇数控自动化设备有限公司)和DHG－9075A型鼓风干燥箱(上海齐鹏科学仪器有限公司)。

1．2 实验过程(1)点样毛细管的表面处理。

先将毛细管依次使用10％的NaOH 溶液和Piranha溶液(此溶液危险,使用时注意安全)进行清洗;然后将清洗后的毛细管浸泡在20％的二氯二甲基硅烷的己醇溶液中1个小时,对毛细管的内外壁进行表面处理;清洗干净后将毛细管放置在110℃的烘箱中1个小时,完成表面处理过程。

(2)基于毛细作用的液滴进样。

如图1所示搭建进样平台,在步进电机转轴上安装一圆形盘片,在盘片表面粘贴末端开口的小试管。

将毛细管安装在一水平平台上,并插入到小试管的末端开口内。

pcr液滴微流控生物芯片制备
PCR液滴微流控生物芯片制备（Polymerase Chain Reaction， PCR）是一种用于识别特定 DNA 或RNA 序列的快速、灵活的分子生物学技术。

通过改变定量的DNA或RNA序列，PCR技术可用于测定具有不同基因调控功能的特定基因或特定基因表达产物的量。

PCR液滴微流控生物芯片制备是一种新型的微流控系统，用于快速、精确地定量分析DNA序列和特定基因测定。

此系统采用反应量微小的Pico Reaction Volumes（PRV）处理
完成PCR反应，在保护和收集特定的DNA片段的同时，以最小的实验时间、成本和空间满
足测序要求。

液滴微流控生物芯片是由底片、硅基底、反应传感技术和芯片组成的一体化的芯片体
系结构。

首先，将事先设计好的空白生物芯片安装在底片上（通常由硅基材料构成）；
其次，在芯片上分别精确地添加水合物（如反切靶片或假手工片）和DNA模板；
然后，在微液滴反应器中完成PCR条件下的反应，当DNA 被扩增后，用微流控技术将反应体中的扩增产物收集为液滴；
最后，用微传感技术检测收集到的DNA液滴，一旦检测到特定结果，即可反应结束。

PCR液滴微流控生物芯片制备是一种具有极大潜力的新型体系，可以精准测定特定
DNA序列和特定基因表达产物，可以在最小的实验时间和成本及小的实验室空间范围内实现，是一种灵活而高效的技术手段。

B-raf基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法)标准化操作流程1、预期用途该产品用于定性检测确诊的结直肠癌患者石蜡包埋病理组织切片DNA的B-rafV600E 基因突变。

B-raf 基因是一种癌基因，编码一种丝/ 苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。

B-raf 基因位于7p34，长约190kb，转录mRNA 长2.5kb，编码783 氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000-95000 Da。

研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf 突变，B-raf 突变主要发生在Exon15 上的激活区的第1799 氨基酸上(T 突变为A)，导致编码的氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸(V600E)，该突变能使B-raf 激酶活性提高，V600E 突变能模拟T598 和S601 两个位点磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活。

近来研究表明，对于野生型Kras、但存在B-raf 基因V600E 突变患者，抗EGFR 单抗治疗无效。

2010 年版《NCCN 结直肠癌临床实践指南》中已明确指出“如K-ras 基因无突变时，需检测B-raf 基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR 单抗治疗。

”2、仪器配置要求移液器，振荡器，微型离心机，生物安全柜，高速冷冻离心机，定性PCR仪，荧光定量PCR仪（ABI7500，LightCycler® 480，MX3000P，CFX-96等），微量紫外分光光度计，基因分析仪（ABI3130，ABI3500DX）。

3、耗材要求无菌带滤芯吸头、吸水纸，离心管（1.5ml，0.5ml，0.2ml）、PCR反应管（配套荧光定量PCR仪型号）及无粉一次性乳胶手套，基因分析板。

4、责任人基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。

毛细管PCR芯片电泳快速检测NDM-1耐药菌方法的建立王秋平【摘要】目的建立一种毛细管聚合酶链反应(PCR)芯片电泳方法,实现快速、准确地检测新德里金属-β-内酰胺酶(NDM-1)耐药菌.方法根据NDM-1基因设计1对特异引物,对临床微生物检测的80株耐药肠道杆菌和60株鲍曼不动杆菌的细菌培养液进行毛细管振荡流PCR扩增,芯片电泳快速检测PCR产物.将NDM-1阳性标本进行测序验证,同时对NDM-1阳性菌细菌悬液定量梯度稀释进行PCR,考察免核酸提取PCR的敏感度.结果毛细管PCR芯片电泳方法检测出2例阳性标本,其产物经测序验证,确定携带NDM-1基因,阳性率为100％.该方法在40 min内实现产NDM-1耐药菌扩增产物的快速分离检测,细菌检测线为1.15×101 CFU/mL.结论毛细管PCR芯片电泳方法检测NDM-1基因准确性高、特异性强,具有快速、廉价等特点,适合NDM-1阳性菌的早期快速现场诊断.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2018(015)024【总页数】5页(P3674-3677,3681)【关键词】新德里金属-β-内酰胺酶;芯片电泳;聚合酶链反应【作者】王秋平【作者单位】南华大学附属第一医院检验科,湖南衡阳421001【正文语种】中文【中图分类】R446滥用抗生素的问题由来已久，2000年出现了多重耐药假单胞菌和肺炎克雷伯菌。

2010年8月The Lancet Infectious Diseases杂志报道了抗生素抗新德里金属-β-内酰胺酶(NDM-1)超级细菌。

NDM-1是一种新鉴定的对β-内酰胺类抗生素具有广谱水解作用的酶，是编码碳青霉烯类酶基因家族成员之一。

NDM-l可以水解碳青霉烯类抗生素，以及头孢菌素和青霉素。

携带该基因的细菌对几乎所有一线治疗重症感染的广谱抗生素，如青霉素类、头孢菌素类、头霉素类等β-内酰胺和碳青霉烯类抗生素均耐药，仅对多黏菌素E及米诺环素衍生物——替加环素敏感，被称为“超级细菌”[1-2]。

专利名称：一种用于微滴式数字PCR的油包水液滴及其应用专利类型：发明专利
发明人：刘斌剑,刘杰,钟要齐,王海,吴林涛,丁亚操
申请号：CN202111669494.9
申请日：20211231
公开号：CN114369647A
公开日：
20220419
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种用于微滴式数字PCR的油包水液滴及其应用，其中所述液滴的水相中包括DSPE‑PEG‑BSA改性蛋白、质粒模板、探针引物对组合、PCR反应缓冲液，所述液滴的油相中含有氟碳油、硅油和/或矿物油。

本发明的DSPE‑PEG‑BSA改性蛋白作为表面活性剂的应用，有效降低了水相体系的表面张力，DSPE‑PEG‑BSA改性蛋白同时还可以作为稳定剂，提高了液滴的稳定性。

此外，本发明的液滴还兼容氟油、硅油和矿物油等微滴式数字PCR体系。

申请人：深圳麦科田生物医疗技术股份有限公司
地址：518000 广东省深圳市南山区西丽沙河西路5158号百旺研发大厦1栋第12层
国籍：CN
代理机构：杭州宇信联合知识产权代理有限公司
代理人：王健
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利用微流控技术制备液滴的方法1.微流控制备液滴的原理在微流控芯片上产生液滴，是一相流体在另一相不互溶或部分互溶流体中分散的过程。

两种互不相溶的液体，以其中的一种作为连续相，另一种作为分散相，分散相以微小体积(10-15 ~ 10-9L)单元的形式分散于连续相中，形成液滴。

在微流控领域，主要采用被动法来制备液滴，常用的三种方法如下：（1）T 型通道法被动法主要包括T 型通道法、流动聚焦法和共轴流聚焦法。

图1 T 型通道微流控芯片液滴发生方法T 型通道法是产生微流控液滴最常用的方法之一,由 Thorsen 等[29]最先提出。

在T型通道法中，两相不相溶的流体在垂直的T型管道交叉口处相遇，在压力和剪切力的作用之下，流动相截断分散相，从而形成液滴。

流动聚焦法由Anna等和Dreyfus等最先提出。

（2）流动聚焦法图2 流动聚焦微流控芯片液滴发生方法在流动聚焦法中，三条流路聚焦一个管道中，分散相和流动相汇合于十字交叉管处，上下对称的流动相同时挤压分散相使其断裂，从而形成液滴。

（3）共轴流聚焦法图3 共轴流微流控芯片液滴发生方法共轴流聚焦法是Cramer等最早用来制备微液滴的。

在共轴流聚焦法中，孔道中心轴内插入尖嘴的毛细管，分散相和连续相处在管道内平行流动，分散相在进入连续相管道时，在连续相流体的剪切力作用下，被挤压断裂形成液滴。

2.液滴微流控技术在生物医学中的应用液滴微流控在取代笨重的生化实验室进行分析检测方面已展现出其独特的优势。

它可以精确地对反应中的微液滴进行操控，并能够减少反应试剂的用量。

液滴微流控技术广泛应用于液滴PCR也叫数字PCR（dPCR）、荧光偏振免疫分析、蛋白质标记物分析、DNA基因检测、基因芯片、蛋白质芯片、药物递送、药物释放、病毒检测、颗粒合成、催化剂研究、微胶囊、单细胞和多细胞分析、以及成像分析、激光光谱学、电化学、毛细管电泳、质谱、核磁共振谱、化学发光法检测等。

文章来源：闫嘉航、赵磊、申少斐、马超、王进义；液滴微流控技术在生物医学中的应用进展；分析化学评述与进展；2016年；第44卷[第4期]；562~568。

pcr微流控液滴生物芯片加工
PCR微流控液滴生物芯片技术（Digital Microfluidic Biochip, DMFB）是一种新颖的微
流控芯片技术，它可以用来实现多种生物应用，其中包括PCR（聚合酶链反应）。

DMFB可
以被用来在胶体、粉末或是液体中控制和测量复杂的生物学反应，使得在一个芯片上多个
细胞或多个样本可以进行实验操作。

此外，DMFB具有微量液体量更加精确，容量更小，实验时间更短，以及重复性较高的优势。

PCR微流控液滴生物芯片的操作流程大致如下：首先，将需要分析的样品（细胞）放置在
芯片表面上，然后通过指令控制芯片，小液滴中注入不同溶液，将样品分子（如DNA或RNA）在芯片上定位，可以采用不同的注液协调机制设计实验，控制空间，释放溶剂以及
按一定的时间流程运行。

PCR微流控液滴生物芯片的使用不仅能实现数量更快、质量更高的生物反应，而且还改进
了风险管理、溶剂控制和检测细节的过程。

由于DMFB中的样品在芯片的固定位置上进行
反应，因此芯片可以快速调节模式，可以快速调节模式，可以消除模式不一致，比如：修
改模式运行时间、改变模式运行步骤和改变模式运行量。

此外，DMFB具有减少试剂消耗量、简化工作步骤和减少实验错误的优势。

通过使用PCR微流控液滴生物芯片，可以在芯片的有限空间内模拟复杂的生物学反应，实
现多个生物学反应的联合控制，简化传统实验的操作步骤，对比分析细胞系的表型。

总的
来说，DMFB是一种高效率的芯片技术，在短时间内可以构建不同种类、不同机制的生物测试平台，实现自动化实验中的杂交、扩增和检测。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110028633.3(22)申请日 2021.01.08(71)申请人 中国科学院半导体研究所地址 100083 北京市海淀区清华东路甲35号(72)发明人 黄义征　刘文文　胡诗铭　魏清泉　俞育德　(74)专利代理机构 中科专利商标代理有限责任公司 11021代理人 王江选(51)Int.Cl.C12Q 1/686(2018.01)(54)发明名称一种基于液滴PCR快速检测单细胞的方法(57)摘要一种基于液滴PCR快速检测单细胞的方法。

该方法包括如下步骤：对经培养、富集的细胞进行固定后，加水重悬得到细胞悬液；将所述细胞悬液与含细胞裂解剂的PCR反应试剂直接混合作为分散相，将油相作为连续相，分别注入微流控芯片生成含单细胞的液滴；对得到的液滴进行PCR反应；对PCR反应后的液滴进行荧光信号检测及分析。

本发明极大地简化了液滴制备和操作过程，降低了液滴生成芯片和试剂成本，提高了液滴PCR检测单细胞的速度、通量、灵敏度和特异性。

权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图3页CN 112592967 A 2021.04.02C N 112592967A1.一种基于液滴PCR检测单细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤(1)对经培养、富集的细胞进行固定后，加水重悬得到细胞悬液；步骤(2)将所述细胞悬液与含细胞裂解剂的PCR反应试剂直接混合作为分散相，将油相作为连续相，分别注入微流控芯片生成含单细胞的液滴；步骤(3)对得到的液滴进行PCR反应；步骤(4)对PCR反应后的液滴进行荧光信号检测及分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中固定细胞的试剂为4％多聚甲醛溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR反应试剂还包括含Mg 2+、dNTPs、Tris ‑HCl、DNA聚合酶的预混液，特异性引物，探针。

基于毛细管液滴技术的血液乙型肝炎病毒DNA提取梁广铁;王秋平;王维;刘大渔;周小棉【摘要】A novel in-capillary droplet-based DNA extraction method was developed, using the principle of water-in-oil droplet formation in the highly hydrophobic polytetrafluoroethylene capillary.By sequentially introducing droplets containing sample or reagents, all the steps related to blood hepatitis B virus (HBV) DNA extraction, including sample injection, DNA binding, magnetic beads rinsing and DNA elution were continuously implemented in the capillary. Experimental results showed that proteinase K lysis and elevated elution temperature facilitated higher extraction efficiency. With optimized conditions, an extraction was completed in 25 min with microliter level sample/reagent consumption. The droplet-based method achieved an extraction efficiency of ～60％that is comparable to that of a commercial method. However, the RSD of extraction efficiency was relatively higher. In summary, the droplet-based DNA extraction developed is simple, fast and low-cost. It has the potential to be integrated into a micro-total nucleic acid analysis system.%基于毛细管液滴技术,建立了提取血液中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的方法.方法的基本原理是向聚四氟乙烯毛细管中连续引人油相和水相溶液时,由于表面张力作用,可以形成稳定的油包水型液滴.依次引人含有不同试样的液滴,在毛细管中完成进样、DNA结合、洗涤以及洗脱等过程.实验表明,采用蛋白酶K裂解和提高洗脱温度有利于提高DNA回收率.优化后的血清HBV DNA提取操作在25 min内完成,回收率大于60%.本方法的DNA提取量与常规方法相当,而相对标准偏差较大(23.3%vs 12.9%).本方法具有简单、快速和低成本的优势,有望成为一种微全核酸分析系统样品前处理的有效解决方案.【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2011(039)005【总页数】5页(P670-674)【关键词】微全核酸分析系统;DNA提取;液滴;毛细管;乙型肝炎病毒【作者】梁广铁;王秋平;王维;刘大渔;周小棉【作者单位】广州医学院附属广州市第一人民医院检验科临床化学技术研究室,广州,510180;广州医学院附属广州市第一人民医院检验科临床化学技术研究室,广州,510180;广州医学院附属广州市第一人民医院检验科临床化学技术研究室,广州,510180;广州医学院附属广州市第一人民医院检验科临床化学技术研究室,广州,510180;广州医学院附属广州市第一人民医院检验科临床化学技术研究室,广州,510180【正文语种】中文微全分析系统是将分析实验室的全部功能集成于一个微型化装置，应用于包括分子诊断、细胞分析等领域［1～3］。

基于毛细管液滴微阵列的分析检测付广春;瞿祥猛【摘要】通过液滴阵列在毛细管内壁上制作探针阵列,然后将样品引入到毛细管内进行杂交检测.采用这一方法,能够显著减少制作成本、缩短分析时间,并降低对昂贵设备的依赖.【期刊名称】《装备制造技术》【年(卷),期】2012(000)008【总页数】3页(P38-40)【关键词】微阵列技术;微流控芯片;核酸检测【作者】付广春;瞿祥猛【作者单位】厦门大学物理与机电工程学院,福建厦门361005;厦门大学萨本栋微米纳米技术研究院,福建厦门361005;厦门大学物理与机电工程学院,福建厦门361005;厦门大学萨本栋微米纳米技术研究院,福建厦门361005【正文语种】中文【中图分类】TP69;Q819微阵列技术是一项进行核酸检测的有力工具，已被广泛应用于多个领域。

不过微阵列的制作和核酸的杂交过程，均需昂贵的设备和较长的时间。

在微流控芯片上进行微阵列分析，能够有效地克服这些不足，但是密度低，探针数目少，严重限制了基于微流控芯片的微阵列分析的应用。

微阵列技术广泛应用于核酸、细菌、结肠直肠癌等的检测及临床诊断[1]。

从广义上讲，一切以微芯片为基础的生物分析过程，均可称为微阵列技术。

1 微芯片技术简介微芯片，是近年来迅速发展的新技术，是一个跨学科的新领域，涉及生命科学、物理学、光学和微机电加工等技术。

根据结构特点和工作原理，可将微芯片分为微阵列芯片和微流控芯片两大类。

其中，微阵列芯片，也称基因芯片，相对发展较早，技术已经比较成熟，主要以生物技术为基础。

在芯片表面，高密度地固定一系列可寻址的识别分子阵列，可以用来进行高通量的生物样品检测，获取大量的相关信息，其检测系统一般为高灵敏的荧光扫描系统[2～3]。

微流控芯片，也被称为“芯片上的实验室（lab-on-a-chip）”[4]，相对于微阵列芯片，起步比较晚，其概念最早是在上世纪80年代末期，由瑞士科学家Widmer 和Manz提出来的[5]。