实验原理
动物的肌肉、心脏、肝、肾、脾等器官组织都是 DNA的良好来源,其中肝脏的DNA虽然产量最大,但肝脏中 丰富的基因组DNA酶对提取的DNA降解比较严重,相对来 说,肌肉组织则由于具有相对少量的DNA酶而使得提取的 DNA质量较好,尤其是新鲜组织的DNA产量高,质量好 。 肌肉DNA的提取一般有两种方法:SDS法和异硫氰酸 胍法,但我们一般采用前一种,即SDS法。 DNA是一切生物细胞的重要组成成分,主要存在于细 胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞;苯酚和氯仿可 使蛋白质变性,用其混合液(酚:氯仿:异戊醇)重复抽 提,使蛋白质变性,然后离心除去变性蛋白质;RNase降 解RNA,从而得到纯净的DNA分子。
器材和试剂
• 1、仪器设备 恒温水浴锅、台式离心机、移液器、玻璃匀浆器、离心管、 吸嘴 • 2、试剂 (1)组织匀浆液:100mM NaCl,10 mM 三羟甲基氨基 甲烷(Tris)-HCl (pH8.0),25mM乙二胺四乙酸( EDTA pH 8.0)。(2) 2×细胞裂解缓冲液:200mM NaCl,20 mM Tris-HCl (pH8.0),50 mM EDTA (pH 8.0),蛋白酶K (200 μg/mL),1%SDS (十二烷基硫酸钠)(3)蛋白酶K:双蒸 水配制10mg/mL,-20℃保存 (4)TE缓冲液:10 mM Tris-HCl (pH8.0),1 mM EDTA (pH 8.0),室温贮存 (5) 平衡酚(pH8.0)/氯仿/异戊醇(25:24:1) (6)3 M NaAc、 冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水、生理盐水 • 3、材料 新鲜动物(兔子)肌肉组织
实验步骤
• 5、加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),缓慢颠倒混匀, 冰上静置10min,12000 rpm离心 10min; • 6、用钝化的黄吸嘴吸取上清水相(含DNA,粘稠)入另 一新1.5mL 离心管中(注意不可 吸取两相间的蛋白质); • 7、估算上清体积,加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),缓慢 颠倒混匀,12000 rpm离心10min;