6动物组织细胞基因组DNA的提取和定量

动物组织细胞基因组DNA提取一、实验原理真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。

真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。

提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。

在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。

二、仪器及试剂1. 仪器：恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液：Tris (pH8.0) 100 mmol/LEDTA (pH 8.0) 500 mmol/LNaCL 20 mmol/LSDS 10%胰RNA酶20ug/ml（2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。

（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。

（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

三、操作步骤1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。

置于玻璃匀浆器中，加入1ml 的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入 1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μｌ，混匀。

在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。

于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

动物基因组DNA的提取1.切取组织5g 左右，用组织粉碎机或研钵将细胞分离。

注：1）少量结缔组织并不影响最后得到的DNA勺质量；2）若标本为血液，则只需肝素抗凝、离心后取白细胞层；3）若为培养的贴壁细胞，则用胰酶消化后收集，PBS洗涤即可。

2.加入5ml DNA提取缓冲液，（10mmol/L Tris-CI ,0.1 mol/L EDTA 0.5% SDS）, 混匀。

注：1）最好先加入Tris-Cl、EDTA再加入SDS 2）最好一边匀浆，一边加入液体，使之充分混匀。

3.加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml，混匀，37C温浴过夜。

注：1）致密组织（如小鼠尾巴）可以适当延长蛋白酶的作用时间；2）若组织量很大且组织比较疏松（如动物脾脏），或对所提取的DNA完整性要求不高时，可以不用蛋白酶K,而是剧烈振荡20分钟，将组蛋白与DNA分离。

此法可能会使部分DNA链断裂，但足以达到一般实验要求，并不影响后续处理；3）也可同时加入RNase。

4.加入等体积的酚－氯仿－异戊醇混合物（25:24:1），剧烈振荡10分钟，冰浴10 分钟，2500rpm 10 分钟离心收集水相。

注：不要混带中间蛋白层。

5.加1/10 体积3mol/L NaAc 及 2 倍体积冰预冷的无水乙醇，颠倒混匀。

冰浴1小时，沉淀DNA注：冰浴时间从10分钟到2小时均可，只是时间太短会影响到最后的产量，但不影响质量。

6.用玻棒轻搅钩出DNA沉淀，置于另一离心管中。

注：如果确信没有混入蛋白，也可用离心的方法去除液体，但应在加入蛋白酶K的同时加入RNaseA7.70%^醇洗涤，晾干，加适量TE或灭菌水溶解，-20 C保存。

注：若要长久保存DNA（数年以上），最好将其沉淀以无水乙醇封闭后，置于-80 °C。

动物基因组DNA的提取[实验原理]在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。

通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。

[仪器、材料与试剂](一)仪器1.台式离心机2.玻璃匀浆器3．高压灭菌锅4．恒温水浴(二)材料1．1.5mL微量离心管2．微量取样器和吸头3．无菌过滤器(一次性)4．10 mL注射器5．鼠肝6．三羟甲基氨基甲烷(Tris)7.十二烷基硫酸钠(SDS)8．乙二胺四乙酸(EDTA)9．蛋白酶K10．RNA酶11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物(三)试剂1、1.5 mol／L NaCl2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.03．0.5 mol／L EDTA pH8.04．3 mol／L NaAc pH5.2以上均高压灭菌。

5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制)6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0)7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0)10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比)11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比)12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液14．λDNA／EcoRI+／HindⅢ相对分于质量标准物片段(bP)21 227，5148，4 973，4 268，3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125[实验步骤]本实验在无液氮的条件下，铡备鼠肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。

动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定郝春霖（武汉大学药学院，2009302590232）摘要：采用盐溶法和有机溶剂抽提分离纯化猪肝基因组DNA，并利用紫外吸收和二苯胺显色法进行核酸定量和纯度测定。

制备的样品A260/ A280值在1.8附近，纯度较高。

但由紫外吸收法数据计算出样品DNA浓度远大于二苯胺显色法的计算结果，本文对数据差异做了相关讨论。

Abstract：The genomic DNA of poker liver were isolated and purified by salting-in and organic agent extraction method. In order to determine the quantitative and to test the fineness of our sample, it has been reacted with diphenylamine to produce the color product and exposed to the UV to find its O.D value. The A260/ A280 value of the sample is about 1.8, which indicates itself highly purified. However, the data of the two different methods are so different that it confuses us. This essay discusses the differences deeply and analyzes the reasons for the results.关键词：猪肝盐溶法抽提基因组DNA 紫外吸收法二苯胺Key words:poker liver salting-in method extract genomic DNA UVpcx diphenylamine引言：制备组织基因组DNA在基因结构和功能的研究中扮演着重要角色，是分子生物学研究中最重要的实验操作技术之一，样品分离纯化的程度对后续实验结构起到决定性作用；而不同种类生物的基因组DNA提取方法各异，同一生物的不同组织或器官也因其细胞结构及成分差异，而需采用不同的提取方法。

实验一动物组织基因组DNA的提取一、实验目的掌握从动物组织中提取总DNA的方法。

二、实验原理DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等实验，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提，因此基因组DNA的提取也是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作之一。

染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。

从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。

整个实验可分为细胞裂解、DNA分离与纯化和DNA 的洗脱收集。

1.细胞裂解：酶法（蛋白酶K）。

2. DNA 分离与纯化：细胞破碎后，常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化DNA，主要有硅基质材料、阴离子交换树脂和磁珠等。

本实验采用TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒中的硅基质材料的离心吸附柱。

硅基质材料吸附核酸的原理，主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合，在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征，高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。

三、材料、试剂和设备1.材料：动物组织2.试剂：TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，无水乙醇等3.设备：离心机，微量移液器等四、实验步骤1.处理材料：取动物组织10mg，尽量切碎，加200μl 缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

2.加入20μl蛋白酶K溶液，混匀后56℃水浴，直至组织溶解（不同组织裂解时间不同，通常需1-3小时即可完成）。

简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。

（细胞裂解）3.加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。

（溶解DNA）注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。

如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA 量少和提取出的DNA不纯。

动物组织DNA提取1样品预处理取新鲜组织25-50mg（组织不宜过多，否则裂解不完全堵塞离心柱），组织剪碎或者切成小块，放入预冷研钵，快速加入液氮用力研磨，或直接放入匀浆器中匀浆。

冻存组织同样使用研钵研磨或匀浆器快速用力研磨或匀浆（冻存组织避免反复冻融，使细胞破碎，内源酶外泄影响基因组DNA提取）2.加入100ulPBS到研磨好的样品中，样品均匀悬浮于PBS3.加600ul的Lysis Buffer，颠倒混匀，如需消化RNA，可加入20ulRNase A，颠倒混匀，室温放置5min4.加入10ul ProteinaseK，混匀，56度水浴45-60min，（颠倒混匀数次，裂解完全液体则清亮粘稠，此步骤可过夜）5 .12000rpm 离心10min，上清转入新的离心管，加800ul无水乙醇，混匀6.液体分次转入离心柱（一次加不完可分次加入），12000rpm 离心1min，弃废液。

7.加入700ulWash bufferA（用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30s-1min，弃废液。

8. 加入700ulWash bufferB（用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30s-1min，弃废液。

9.加入500ulWash bufferB，12000rpm 离心30s-1min，弃废液。

10.再次12000rpm 离心2min，将离心柱置于心得离心管中，打开离心柱盖，于室温或37度恒温箱放置5-10min，直至无明显乙醇味。

11.在硅基质膜中央加入50-200ulTEbuffer（事先预热55-65度）置于室温2-5min，12000rpm 离心30s。

12. 离心得到的溶液再次加入离心柱中，室温放置2min，12000rpm 离心2min，所得溶液为纯化后的基因组DNA.纯化效果检测：取2-5ulDNA产物，0.7%agarose电泳检测DNA分子的完整性和紫外分光光度计检测浓度和纯度。

动物组织细胞基因组DNA提取一、实验原理真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。

真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。

提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。

在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。

二、仪器及试剂1. 仪器：恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液：Tris (pH8.0) 100 mmol/LEDTA (pH 8.0) 500 mmol/LNaCL 20 mmol/LSDS 10%胰RNA酶20ug/ml（2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。

（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。

（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

三、操作步骤1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。

置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。

在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。

于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

基因组DNA的提取一、从哺乳动物组织提取基因组DNA实验材料：液氮、消化缓冲液、PBS（冰冷）、25:24:1酚/氯仿/异戊醇、7.5M乙酸铵、无水乙醇及70%乙醇、0.1%SDS、RNA酶、TE缓冲液（pH8.0）、离心管、研钵、冷冻离心机。

实验步骤：1.取新鲜或冰冻动物组织块，剪成小块。

置于液氮中冻结。

2.将500mg的组织用预冷的研钵和研杵研碎，或用小锤子将其捣为细粉末，每100mg组织用1.2 mL消化缓冲液悬浮。

3.将6ml样品在盖紧的离心管中于50℃摇荡下温育12～18 h。

4.用6ml酚/氯仿/异戊醇抽提样品，1700g离心10 min。

如果样品溶解得不好，再加6ml不含蛋白酶K的消化缓冲液，并重复离心。

如果在界面上有一层厚的白色物质，重复有机抽提，将上层(水溶液)转移至一个新管中。

5.加入6ml 7.5M乙酸铵和24ml 100%乙醇，1700g离心2 min。

6.用70%乙醇洗涤，晾干，沉淀用TE缓冲液重新溶解，使终浓度在约1mg/mL左右。

7.加入0.1%的SDS和1pg/mL无DNA酶的RNA酶，37℃温育1h,以除去残留的RNA.重复步骤 4～5。

二、从植物组织提取基因组DNA实验材料：液氮/干冰、2-巯基乙醇(2-ME)、 CTAB抽提液、CTAB/NaCl溶液、24:1(v/v)氯仿/异戊醇、CTAB沉淀液、高盐TE缓冲液、80%乙醇、TE缓冲液、抗有机溶剂的试管和烧杯、研钵和研杵、粉碎器/匀浆器、捣碎机、恒温金属浴、冷冻离心机。

实验步骤：1.取1g的鲜叶组织，在3.2ml CTAB抽提液中加入0.8ml 2-巯基乙醇，使终浓度达2%(v/v)。

将此溶液及1ml CTAB/NaCl溶液加热至65℃。

2.用液氮(-196℃)或干冰(一78℃)冷却粉碎器/匀浆器，将植物组织粉碎成为细粉，然后将冷冻的组织转移到一个抗有机溶剂的试管或烧杯中。

3.往粉碎的组织中加入预热的2-ME/CTAB,混合使之充分湿润，65℃温育10～60min,不时混匀：4.用4ml的24:1氯仿/异戊醇抽提匀浆液，颠倒使充分混合，于4℃, 7500g离心5 min(对于小样品，在离心机上以10000 r/min离心),回收上(水)相。

小白鼠6种组织部位总DNA不同提取方法的比较DNA是生物体的基本遗传物质。

基因组DNA的提取是分子生物学的基础试验操作，其提取效率和质量的好坏直接决定了后面一系列基因工程试验的成败，如基因分离、AFLP、RAPD、SSR等。

因此•学习、掌握DNA提取方法并对其迸行比较、总结，有利于后续试验的顺利开展。

国内外研究人员已经发现并使用了许多种DNA提取方法［2-7］，并且针对不同生物体的具体特点，对许多方法逬行了改良，摸索出适用于具体物种的高效方法［8-15］。

目前，传统的SDS法和CTAB 法由于其成本低廉、提取的DNA质量相对较好，在实际应用中仍占有主要地位。

随着生物技术的普及和应用，使用试剂盒提取基因组DNA逐渐增多［16-19］。

基因组提取试剂盒具有操作简便、节省时间等独特优势，但是对于一般的实验室、特别是普通高等学校来说，由于价格较为昂贵，在很大程度上限制了其使用范围；尤其对刚接触分子生物学试验的初学者，只知道按照说明书流程操作，不了解试剂的化学成分、具体配制方法及作用，不利于理解、掌握试验的基本原理，动手能力差、试验技能得不到提高，最终出现一旦离开试剂盒，什么试验也不会做的情况。

本试验以普通试验动物小白鼠作为提取基因组DNA的材料，选取小白鼠的6个组织部位，分别是肝、脾、肾、尾、肺和心脏，采用提取基因组DNA的经典方法SDS法和CTAB法，提取小白鼠的基因组DNA，并对其质量、浓度、纯度进行检测，从中筛选出经济、简便、易于操作、质量良好的基因组DNA，这对于今后的试验教学和科研工作具有重要的指导作用。

1材料和方法1.1材料1.1.1试验材料小白鼠购自沈阳医学院实验中心。

1.1.2试剂dNTP 'DNA Marker 高保真酶均购自宝生物工程（大连）有限公司‘引物于Invitrogen北京分公司合成» CTAB和SDS法提取液配制所需药品购自Sigma，其余所用的化学试剂（氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等）均为国产分析纯试剂。

从动物组织中提取基因组DNA（一）实验目的通过实践操作与实验实践掌握从动物组织中提取DNA的基本原理和基本方法。

(二) 实验原理在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K笑话细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA，用此法得到的DNA长度为100-150kb，适用于噬菌体构建基因组文库和DNA 印迹分析。

（三）试剂、材料、仪器与器材1. 试剂与材料1)Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml配制方法：40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转移到50ml 容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

2)生理盐水: 0.85%NaCL 100ml配制方法：在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

3)EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml配制方法：将9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入）调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA·Na2·2H2O。

4)TES缓冲液（释放DNA） 100ml配制方法：将0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl (pH=8.0)，加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4℃保存备用。

5)10% SDS（变性剂破细胞壁）100ml配制方法：将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68℃加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4℃保存备用。