植物组织培养第三章 植物器官和组织培养
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绪论植物组织培养(Tissue culture):是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称,也称之为离体培养或试管培养。
器官:根、茎、叶、花、果实、种子;组织:花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等。
或指将植物的离体器官、组织、细胞以及去除细胞壁的原生质体,放在离体无菌人工控制的环境条件下培养,对其进行克隆,使其生长、分化并成长为完整植株的过程。
组织(tissue)、器官(organ)或细胞培养:指利用生物体各部分组织、器官或细胞进行离体培养,使之形成愈伤组织或完整有机体的技术。
愈伤组织(callus):在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。
原生质体培养指将微生物或植物细胞游离成原生质体,在适宜培养条件下,依据细胞全能性使其再生细胞壁,并进行细胞分裂分化,形成完整个体的技术。
植物组织培养特点:①培养条件可以人为控制;②生长周期短,繁殖率高;③管理方便,利于工厂化生产和自动化控制()。
1、植物组织培养的理论基础—细胞全能性:植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质,在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。
2、植物细胞全能性的表达:①脱分化(dedifferentiation):将已分化的不分裂的静止细胞,放在培养基上培养后,细胞重新进入分裂状态。
一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。
②再分化(redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型,形成完整植株的过程。
离体的植物器官、组织、细胞→脱分化形成愈伤组织→再分化形成根、芽→再生植株。
4、组织培养植株再生的途径:1)、体细胞胚胎发生途径(胚状体发生途径):是指在组织培养中起源于一个非合子细胞,经过胚胎发生和胚胎发育过程(经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期),形成具有双极性的胚状结构,而发育成再生植株的途径。
3.植物细胞培养(植物组织培养)第三章植物细胞培养植物细胞培养:指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞(或⼩细胞团)进⾏培养,形成单细胞⽆性系或再⽣植株的技术。
Haberlandt(1902)⾸次尝试分离和培养植物叶⽚单细胞。
细胞培养的意义有利于进⾏细胞⽣理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。
进⾏细胞培养,通过单细胞的克隆化,即称为“细胞株”(cell line),可以把微⽣物遗传技术⽤于⾼等植物以进⾏农作物的改良。
细胞培养的增殖速度快,适合⼤规模悬浮培养,⽣产⼀些特有的产物,如许多种植物的次⽣代谢产物,包括各种药材的有效成分等,⽤于医药业、酶⼯业及天然⾊素⼯业,这是植物产品⼯业化⽣产的新途径。
由于植物组织培养中细胞之间在遗传和⽣理⽣化上会出现种种变异,这些细胞形成的植株也都表现出⼀定的差异。
这种差异反映在它们的植株的形态、产量、品质、抗病⾍和抗逆性等⽅⾯。
所以由单细胞培养获得的单细胞⽆性繁殖系,并对不同的细胞进⾏研究,在理论上和实践上都有很重要的意义。
细胞培养就是从⾼等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进⾏培养,并诱导其分裂增殖,由细胞分裂形成细胞团,再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体,长成完整植株。
第⼀节植物细胞培养⼀. 单细胞培养(⼀)单细胞分离1.机械法2.酶解法3.从愈伤组织中分离(⼆)单细胞的培养⽅法1、平板培养(细胞的⽣长周期)2、看护培养3、微室培养 4. 条件化培养⼆. 细胞悬浮培养(⼀)悬浮培养的⽅法1、分批培养(细胞的⽣长周期)2、半连续培养3、连续培养——封闭型、开放型(化学、浊度恒定式)4、固定化培养(⼆)培养细胞的同步化1. 化学⽅法(饥饿法、抑制法、有丝分裂抑制法)2. 物理⽅法(分选、低温)(三)培养基振荡⼀、单细胞培养(⼀)单细胞的分离1.机械法: Ball(1965)⾸次由花⽣成熟叶⽚利⽤机械的⽅法使叶⾁细胞得到分离的技术。
⑴⼑⽚刮: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠)→撕去下表⽪(露出叶⾁细胞) →⽤解剖⼑刮下细胞→单细胞悬浮培养⑵研磨离⼼法: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠) →研磨匀浆(10g叶⽚+40ml研磨介质)→匀浆过滤(细纱布) →离⼼(先低速去碎屑) →游离细胞沉降到底部(净化细胞) →植株培养或悬浮培养研磨介质: 20µmol蔗糖+ 10µmol MgCl2 + 20µmol Tris-HCl (pH7.8)机械法的特点:⑴细胞不受酶的伤害;⑵不发⽣质壁分离。
植物器官和组织培养的基本程序离体的植物器官和组织在人工培养条件下,通过不同的器官发生途径,形成体细胞胚或茎芽,进一步再生成完整植株。
因此,植物器官和组织培养的基本程序包括:无菌外植体的获得、初代培养物的建立、形态发生、植株再生以及培养产物的观察记载。
一、无菌外植体的获得从自然界和室内采集的植物器官和组织材料携带有各种微生物,这些污染源一旦进入培养容器中,造成培养基和培养材料污染,实验无法进行。
所以,污染是组织培养的一大障碍。
利用各种灭菌剂可以进行外植体的灭菌,但不同植物或同一植物不同器官和组织的带菌程度不同,所用灭菌剂的种类、浓度及灭菌方法也不尽相同。
(一)茎尖、茎段、叶片的灭菌灭菌前外植体用清水冲洗,茸毛较多的外植体用皂液洗涤后再用清水冲洗、用吸水纸吸干表面水分;将外植体浸泡在0.1%~0.2%的氯化汞溶液中2~10min,或先在70%~75%酒精中浸数秒,然后在10%次氯酸钙溶液中浸泡10~20min。
或先在70%~75%酒精中浸泡数秒,再在2%次氯酸钠溶液中浸泡15~30min进行灭菌;灭菌后倒掉灭菌液,无菌水冲洗外植体3~5次,置外植体于无菌滤纸上吸干表面水分,适当分割后接种。
(二)根、块茎、鳞茎的灭菌这类材料生长在土中,灭菌较困难,且挖取时易受损伤。
所以灭菌前应仔细清洗,对凹凸不平及鳞片缝隙处,需用软刷清洗,并切除损伤部位。
灭菌时应增加灭菌时间或增大灭菌剂浓度,如将外植体浸泡在0.1%~0.2%氯化汞溶液中5~12min,或在70%~75%酒精中浸数秒,然后用6%~10%次氯酸钠溶液浸5~20min进行灭菌。
灭菌后的操作步骤同上。
(三)花蕾的灭菌未开放花蕾中的花药为花被包裹,处于无菌状态,所以采摘后可直接灭菌。
灭菌时先在70%~75%酒精中浸蘸10~30s,然后在0.1%氯化汞溶液中浸泡3~10min或在1%次氯酸钠溶液中浸泡10~20min。
灭菌后的处理同上。
(四)果实、种子的灭菌这类材料有的表皮具有茸毛或蜡质。
绪论植物组织培养(Plant tissue culture)广义上是指无菌条件下,在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。
外植体:愈伤组织:一、植物组织的主要特征:(1)在培养容器中进行;(2)无菌培养环境,排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入;(3)各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下,并可达到最适条件。
(4)通常打破了正常的植物发育过程和格局;(5)随着单细胞和原生质体培养技术的发展,对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型:根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为:(1)完整植株培养(Plant Culture):对幼苗和较大植株等的培养。
(2)胚胎培养(Embryo Culture):包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
(3)器官培养(Organ Culture):包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
(4)组织培养(Tissue Culture):如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
(5)细胞培养(Cell Culture):指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
(6)原生质体培养(Protoplast Culture):指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
三.植物组培的应用1.植物离体快繁。
2.无病毒苗木培养。
3.培育新品种或创制新物种。
4.次生代谢物生产。
5.植物种质资源的离体保存。
6.人工种子。
第一章1.)实验室包括:准备室,无菌操作室,培养室,温室。
2.)器具的灭菌:1、器具灭菌:培养皿、解剖刀、镊子等用品。
(1)干热灭菌:铝箔包好后,放于恒温干燥箱内,150 ℃保温2小时,成本较高。
(2)高压蒸汽灭菌:高压蒸汽灭菌锅内120 ℃15-20分钟。
(3)灼烧灭菌:接种时,解剖刀及镊子等浸入95%乙醇,然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。
2、培养基灭菌:采用高压蒸汽灭菌。