免疫传感器在牛奶抗生素残留检测中的研究进展
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90 年代以来，以生物传感器技术为基础的各类生物 检测系统迅速兴起，一些快速和采用现代技术的检测方 法不断出现，该技术也逐渐应用于抗生素残留检测领 域。目前针对抗生素残留检测应用最为广泛的就是基于 免疫分析原理的生物传感器，即免疫传感器 (immunosensor)[5-7]。它是将高灵敏的传感器技术与抗 原、抗体特异性反应相结合的一种检测方法。与传统 的免疫分析方法相比，免疫传感器具备了免疫分析的高
1 光学免疫传感器
应用光学免疫传感器检测牛奶中的抗生素残留的报 道主要有表面等离子体共振(surface plasmon resonance， SPR)传感器和化学发光(chemiluminescence，CL)免疫传 感器。 1.1 表面等离子体共振传感器
SPR 传感器是 20 世纪 80 年代出现的一种生物传感技 术，主要有光波导器件、金属薄膜、生物敏感膜 3 个 部分组成[8]。近年来 SPR 技术是应用免疫传感器检测牛 奶中抗生素残留报道最多的一种。
326 2010, Vol. 31, No. 13
食品科学
※专题论述
免疫传感器在牛奶抗生素残留检测中的研究进展
孙 霞，王相友*
(山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东 淄博 255049)
摘 要：乳腺炎是奶牛的常见病，通常需要抗生素治疗，因此不可避免地造成牛奶中的抗生素残留。由于免疫 传感器是将高灵敏的传感器技术与抗原、抗体特异性反应相结合的一种检测方法，易于实现抗生素残留检测仪器的 便携化、微型化和自动化，因而成为近年来研究的热点。本文介绍免疫生物传感器的基本原理、组成与分类，重 点介绍国内外应用免疫传感器检测牛奶中抗生素残留的研究进展，并分析未来免疫生物传感器的发展趋势。 关键词：免疫传感器；牛奶；抗生素残留；检测
Key words：immunosensor；milk；antibiotics residue；detection
中图分类号：S481.8
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2010)13-0326-05
抗生素被广泛用于预防治疗奶牛疾病。由于频繁、 超剂量使用，使得牛奶等动物源食品中存在一定量的抗 生素残留。长期饮用或食用有抗生素残留的牛乳或乳制 品，也就相当于长期低剂量的吸收抗生素，从而使人 体肠道内的正常菌群受到抑制，导致致病菌、条件致 病菌大量繁殖引起全身或局部的感染，严重影响食用者 的身体健康。因此牛奶中的抗生素残留问题一直是各国 政府和食品安全机构关心的重点，我国近年来对牛奶中 存在的抗生素残留问题也逐渐予以关注。目前质检部门 检测抗生素残留主要是使用各种仪器分析。
residues in milk have been introduced in this paper. The research progress of immunosensors at home and abroad has been
comprehensively discussed and the future development trends of immunosensors for antibiotic residues have been proposed.
Abstract：Mastitis is one of the most prevalent diseases and requires the treatment of antibiotics. Therefore, antibiotic residues
will remain in milk. Immunosensor is a novel detection method with the integration of antibody-antigen interaction and high
李莹等[16]应用自行组建的 SPR 生物芯片检测系统对 制备的土霉素(OTC-OVA)抗体芯片进行了免疫反应的检 测，该方法不需要标记样品和纯化样品，操作简单、 成本低、灵敏度高。检测了 OTC-OVA 抗体与 OTC-OVA 抗原的反应，发生免疫反应后，OTC 抗体阵列的共振 角和折射率明显增大，共振曲线有明显位移。由 SPR 检 测系统能准确、直观地检测生物芯片上的探针是否发生 免疫反应，样品中土霉素是否超标。
sensitivity. It is a convenient instrument for detecting antibiotic residues in milk due to the characteristics of portability,
miniaturization and automation. Basic principle, constitution and classification of immunosensors for detecting antibiotic
食品科学
2010, Vol. 31, No. 13 327
选择性又兼有电化学分析的高灵敏性，易于实现残留检 测仪器的便携化、微型化和自动化，因此应用免疫传 感器检测牛奶中的抗生素残留在国内外已有不少研究。
本文着重介绍应用免疫传感器检测牛奶中的抗生素 残留的最新研究进展，分析应用免疫传感器检测牛奶中 抗生素技术的未来发展趋势。国内外用于牛奶抗生素残 留检测的免疫传感器主要有光学免疫传感器、电化学免 疫传感器、磁性微球免疫传感器等类型(图 1)。
化学发光免疫传感器是以化学发光为检测手段，用 化学发光物(化学发光试剂)、电活性物质(酶等)或荧光物 质标记到抗原(抗体)上，利用其免疫反应前后化学发光 信号的改变，对抗原 / 抗体进行定量测定的一种方法， 该法具有高灵敏度和无污染等特点。国内外对于应用此 种方法检测牛奶中的抗生素残留也有不少报道。
328 2010, Vol. 31, No. 13
食品科学
※专题论述
1.3 荧光免疫传感器 荧光免疫传感器报道最多的是逝波荧光免疫传感
器，所使用的换能器通常是平面波导或光纤，因此可 分为平面波导型免疫传感器和光纤免疫传感器。该类传 感器具有特异性强、灵敏度高、检测速度快、费用低、 操作简便等优点。Adrian 等[20-21]采用了逝波荧光免疫传 感器检测牛奶中的磺胺类抗生素，Kim 等[6]报道了采用 光纤式免疫传感器测定牛奶中的磺胺类抗生素残留。 1.4 纳米金显色传感器(金标试纸条)
基于胶体金免疫层析技术(gold immunochromatographic assay，GICA)的快速诊断试纸条(简称金标试纸条)，目 前牛奶抗生素检测商业化应用较广泛的一种检测方法， 与酶联免疫分析(ELISA)试剂盒相比，其优点是更为简 便快速、无需检测仪器，且成本低、无污染。
白特异的免疫原性。因此可以采用基于抗体抗原特异性 识别原理的免疫分析技术检测抗生素残留[1-2]。
免疫分析技术中应用广泛的主要是酶联免疫分析技 术(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，中国 农业大学的沈建忠课题组已经成功开发了多种兽药残留 检测的试剂盒[3-4]。这些研究为免疫分析技术的发展奠定 了很好的基础。ELISA 方法可以满足大部分兽药残留的 检测，但其操作过程繁琐，实验时间长，难以实现自 动化。
Knecht 等[18]结合传感阵列与流动分析技术，构建了 自动化的多组分的免疫传感阵列。他们把 10 种抗生素的 半抗原并把点好样的载玻片固定到流通池 中，通入样品与抗体的混合物并完成温育步骤后，再 通入辣根过氧化物酶标记的二抗进行第二步温育，最后 通入化学发光底物同时检测牛奶中的 10 种抗生素。
收稿日期：2009-07-24 作者简介：孙霞(1972 —)，女，副教授，博士，研究方向为食品安全与质量检测。E-mail：sunxia2151@ ﹡通信作者：王相友(1961 —)，男，教授，博士，研究方向为食品安全与质量检测。E-mail：wxy@
※专题论述
尽管仪器分析具有较高的灵敏度和稳定性，但是其 设备昂贵、前处理繁琐和检测效率低下，限制了其在 常规检测中的应用。抗生素属于小分子物质，且具有 一定复杂性，属于半抗原，其本身不具备刺激机体产 生针对抗生素抗原决定簇的特异性，但是与大分子载体 (一般为蛋白质)偶联后能刺激机体产生抗体，形成半抗 原 - 载体复合物，这种复合物通常具有半抗原和载体蛋
Sternesjo 等[9]早在 1995 年报道采用 SPR 传感器检测 牛奶中的磺胺甲嘧啶(sulfamethazine，SMZ)抗生素残 留，将 SMZ 共价固定在修饰过的羧甲基右旋糖苷金片 上，制备 HBS 缓冲液含有已知浓度 SMZ 样品构建标准 曲线。将能够 SMZ 结合的多克隆抗体加入到样品中， SPR 检测器固定化表面用以测定没有结合的抗体数量。 Sternesjo 课题组后来又陆续报道了采用 SPR 传感器检测 牛奶中的抗生素[10-11]。2001 年 Gaudin 等[12]和 2002 年 Dillon 等[13]采用同样的方法分别检测了牛奶中的青霉素残留和 头孢氨苄残留。
2006 年 Park 等[19]采用化学发光免疫传感器检测氯霉 素残留，将酶标记物辣根过氧化酶(0.030mg/mL)和抗氯 霉素抗体(0.10mg/mL)交联固定在尼龙膜上，尼龙膜放在 不透光的黑盒子里，一端与装有蠕动泵的流动注射系统 相连，一端与光电倍增管相连。每次从注射系统注射 200μL 的底物(含有 0.25mmol/L 的发光氨、13.3mmol/L H2O2 及 0.66mmol/L 对碘酚)。最终检测限达到 1.0 × 10-8mol/L。
2001 年 Baxter 等[14]采用光学生物传感器(Biacore)检 测巴氏杀菌全脂奶中的链霉素残留。Biacore 是基于 SPR 技术来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标
记物。Biacore 系统的 3 个核心部分是传感器芯片、SPR 光学检测系统、微射流卡盘。Baxter 等将链霉素多克隆 抗体固定在传感器芯片上，未经脱脂和离心处理的牛奶 流过芯片，整个检测时间 5min，最低检测限 4.1ng/mL。 Gustavsson 等[15]利用基于 SPR 技术的瑞典 Biacore 公司的 光学生物传感器，通过抑制羧肽酶活性来检测牛奶中的 β- 内酰胺。
1 光学免疫传感器
应用光学免疫传感器检测牛奶中的抗生素残留的报 道主要有表面等离子体共振(surface plasmon resonance， SPR)传感器和化学发光(chemiluminescence，CL)免疫传 感器。 1.1 表面等离子体共振传感器
SPR 传感器是 20 世纪 80 年代出现的一种生物传感技 术，主要有光波导器件、金属薄膜、生物敏感膜 3 个 部分组成[8]。近年来 SPR 技术是应用免疫传感器检测牛 奶中抗生素残留报道最多的一种。
326 2010, Vol. 31, No. 13
食品科学
※专题论述
免疫传感器在牛奶抗生素残留检测中的研究进展
孙 霞，王相友*
(山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东 淄博 255049)
摘 要：乳腺炎是奶牛的常见病，通常需要抗生素治疗，因此不可避免地造成牛奶中的抗生素残留。由于免疫 传感器是将高灵敏的传感器技术与抗原、抗体特异性反应相结合的一种检测方法，易于实现抗生素残留检测仪器的 便携化、微型化和自动化，因而成为近年来研究的热点。本文介绍免疫生物传感器的基本原理、组成与分类，重 点介绍国内外应用免疫传感器检测牛奶中抗生素残留的研究进展，并分析未来免疫生物传感器的发展趋势。 关键词：免疫传感器；牛奶；抗生素残留；检测
Key words：immunosensor；milk；antibiotics residue；detection
中图分类号：S481.8
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2010)13-0326-05
抗生素被广泛用于预防治疗奶牛疾病。由于频繁、 超剂量使用，使得牛奶等动物源食品中存在一定量的抗 生素残留。长期饮用或食用有抗生素残留的牛乳或乳制 品，也就相当于长期低剂量的吸收抗生素，从而使人 体肠道内的正常菌群受到抑制，导致致病菌、条件致 病菌大量繁殖引起全身或局部的感染，严重影响食用者 的身体健康。因此牛奶中的抗生素残留问题一直是各国 政府和食品安全机构关心的重点，我国近年来对牛奶中 存在的抗生素残留问题也逐渐予以关注。目前质检部门 检测抗生素残留主要是使用各种仪器分析。
residues in milk have been introduced in this paper. The research progress of immunosensors at home and abroad has been
comprehensively discussed and the future development trends of immunosensors for antibiotic residues have been proposed.
Abstract：Mastitis is one of the most prevalent diseases and requires the treatment of antibiotics. Therefore, antibiotic residues
will remain in milk. Immunosensor is a novel detection method with the integration of antibody-antigen interaction and high
李莹等[16]应用自行组建的 SPR 生物芯片检测系统对 制备的土霉素(OTC-OVA)抗体芯片进行了免疫反应的检 测，该方法不需要标记样品和纯化样品，操作简单、 成本低、灵敏度高。检测了 OTC-OVA 抗体与 OTC-OVA 抗原的反应，发生免疫反应后，OTC 抗体阵列的共振 角和折射率明显增大，共振曲线有明显位移。由 SPR 检 测系统能准确、直观地检测生物芯片上的探针是否发生 免疫反应，样品中土霉素是否超标。
sensitivity. It is a convenient instrument for detecting antibiotic residues in milk due to the characteristics of portability,
miniaturization and automation. Basic principle, constitution and classification of immunosensors for detecting antibiotic
食品科学
2010, Vol. 31, No. 13 327
选择性又兼有电化学分析的高灵敏性，易于实现残留检 测仪器的便携化、微型化和自动化，因此应用免疫传 感器检测牛奶中的抗生素残留在国内外已有不少研究。
本文着重介绍应用免疫传感器检测牛奶中的抗生素 残留的最新研究进展，分析应用免疫传感器检测牛奶中 抗生素技术的未来发展趋势。国内外用于牛奶抗生素残 留检测的免疫传感器主要有光学免疫传感器、电化学免 疫传感器、磁性微球免疫传感器等类型(图 1)。
化学发光免疫传感器是以化学发光为检测手段，用 化学发光物(化学发光试剂)、电活性物质(酶等)或荧光物 质标记到抗原(抗体)上，利用其免疫反应前后化学发光 信号的改变，对抗原 / 抗体进行定量测定的一种方法， 该法具有高灵敏度和无污染等特点。国内外对于应用此 种方法检测牛奶中的抗生素残留也有不少报道。
328 2010, Vol. 31, No. 13
食品科学
※专题论述
1.3 荧光免疫传感器 荧光免疫传感器报道最多的是逝波荧光免疫传感
器，所使用的换能器通常是平面波导或光纤，因此可 分为平面波导型免疫传感器和光纤免疫传感器。该类传 感器具有特异性强、灵敏度高、检测速度快、费用低、 操作简便等优点。Adrian 等[20-21]采用了逝波荧光免疫传 感器检测牛奶中的磺胺类抗生素，Kim 等[6]报道了采用 光纤式免疫传感器测定牛奶中的磺胺类抗生素残留。 1.4 纳米金显色传感器(金标试纸条)
基于胶体金免疫层析技术(gold immunochromatographic assay，GICA)的快速诊断试纸条(简称金标试纸条)，目 前牛奶抗生素检测商业化应用较广泛的一种检测方法， 与酶联免疫分析(ELISA)试剂盒相比，其优点是更为简 便快速、无需检测仪器，且成本低、无污染。
白特异的免疫原性。因此可以采用基于抗体抗原特异性 识别原理的免疫分析技术检测抗生素残留[1-2]。
免疫分析技术中应用广泛的主要是酶联免疫分析技 术(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，中国 农业大学的沈建忠课题组已经成功开发了多种兽药残留 检测的试剂盒[3-4]。这些研究为免疫分析技术的发展奠定 了很好的基础。ELISA 方法可以满足大部分兽药残留的 检测，但其操作过程繁琐，实验时间长，难以实现自 动化。
Knecht 等[18]结合传感阵列与流动分析技术，构建了 自动化的多组分的免疫传感阵列。他们把 10 种抗生素的 半抗原并把点好样的载玻片固定到流通池 中，通入样品与抗体的混合物并完成温育步骤后，再 通入辣根过氧化物酶标记的二抗进行第二步温育，最后 通入化学发光底物同时检测牛奶中的 10 种抗生素。
收稿日期：2009-07-24 作者简介：孙霞(1972 —)，女，副教授，博士，研究方向为食品安全与质量检测。E-mail：sunxia2151@ ﹡通信作者：王相友(1961 —)，男，教授，博士，研究方向为食品安全与质量检测。E-mail：wxy@
※专题论述
尽管仪器分析具有较高的灵敏度和稳定性，但是其 设备昂贵、前处理繁琐和检测效率低下，限制了其在 常规检测中的应用。抗生素属于小分子物质，且具有 一定复杂性，属于半抗原，其本身不具备刺激机体产 生针对抗生素抗原决定簇的特异性，但是与大分子载体 (一般为蛋白质)偶联后能刺激机体产生抗体，形成半抗 原 - 载体复合物，这种复合物通常具有半抗原和载体蛋
Sternesjo 等[9]早在 1995 年报道采用 SPR 传感器检测 牛奶中的磺胺甲嘧啶(sulfamethazine，SMZ)抗生素残 留，将 SMZ 共价固定在修饰过的羧甲基右旋糖苷金片 上，制备 HBS 缓冲液含有已知浓度 SMZ 样品构建标准 曲线。将能够 SMZ 结合的多克隆抗体加入到样品中， SPR 检测器固定化表面用以测定没有结合的抗体数量。 Sternesjo 课题组后来又陆续报道了采用 SPR 传感器检测 牛奶中的抗生素[10-11]。2001 年 Gaudin 等[12]和 2002 年 Dillon 等[13]采用同样的方法分别检测了牛奶中的青霉素残留和 头孢氨苄残留。
2006 年 Park 等[19]采用化学发光免疫传感器检测氯霉 素残留，将酶标记物辣根过氧化酶(0.030mg/mL)和抗氯 霉素抗体(0.10mg/mL)交联固定在尼龙膜上，尼龙膜放在 不透光的黑盒子里，一端与装有蠕动泵的流动注射系统 相连，一端与光电倍增管相连。每次从注射系统注射 200μL 的底物(含有 0.25mmol/L 的发光氨、13.3mmol/L H2O2 及 0.66mmol/L 对碘酚)。最终检测限达到 1.0 × 10-8mol/L。
2001 年 Baxter 等[14]采用光学生物传感器(Biacore)检 测巴氏杀菌全脂奶中的链霉素残留。Biacore 是基于 SPR 技术来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标
记物。Biacore 系统的 3 个核心部分是传感器芯片、SPR 光学检测系统、微射流卡盘。Baxter 等将链霉素多克隆 抗体固定在传感器芯片上，未经脱脂和离心处理的牛奶 流过芯片，整个检测时间 5min，最低检测限 4.1ng/mL。 Gustavsson 等[15]利用基于 SPR 技术的瑞典 Biacore 公司的 光学生物传感器，通过抑制羧肽酶活性来检测牛奶中的 β- 内酰胺。
