下载文档原格式
doi:10.19369/j. cnki. 2095 — 9737.2021.04.043牛奶中抗生素残留的检测方法范松阳(黑龙江省地质矿产实验测试研究中心，黑龙江哈尔滨150000)摘要：牛奶等乳制品中如果残留抗生素既会导致品质变差，严重时还会对发酵乳制品的生产造成影响，使其产量降低，并导致后期产品风味变差，损害生产者的经济效益，同时人们摄入后会 严重危害健康，如导致人体发生过敏反应（过敏性休克、皮疹等），使肠道中有益菌的生长被抑制，而致病菌、念珠菌等大量增殖，引起局部或者全身感染，还会使人体对抗生素形成抗药性，明显加大临床治疗难度。
现概述奶牛中抗生素残留的检测方法，供参考。
关键词：牛奶；抗生素残留；检测方法中图分类号：T S252. 7 文献标识码：B文章编号2095—9737(2021)04 —0074 —021理化检测法1.1检测原理该法主要是根据抗生素分子的性质，使用相 关实验仪器对其进行分离检测。
分离时常用的实 验技术为电泳检测或者色谱检测等，检测时常用 的实验技术为紫外检测、化学发光检测、荧光检测 或者质谱检测等。
1.2优缺点该法具有精确可靠、重复性好、检测灵敏、分 离效率高、结果稳定的特点，属于检测抗生素残留 的一种精确方法。
2微生物检测法该法是检测牛奶抗生素残留时应用比较广泛 的经典方法，主要有氯化三苯基四氮唑法（T TC 法）、纸片法、管蝶法以及试剂盒法等。
2.1检测原理主要是根据抗生素对微生物的机能、生理代 谢产生的抑制作用来对样品中残留抗微生物药物 进行定性。
2.2优缺点这种检测方法具有费用低、操作简单、结果可 靠、不需使用高级实验设备的优点，可应用于普通 养殖场及实验室。
但由于需要进行微生物培养，因此有相对较长的检测时间，无法实现定量检测，不可检测出某些抗生素的最低限。
2.3常用方法2.3. 1T TC 法将9m L灭菌脱脂乳中接种提前制备好的嗜热链球菌菌种，放人3 6±1C恒温培养箱中经过15 h活化，然后对脱脂乳按1 〇 1比例进行稀释制 成测试菌液。
第１７期 收稿日期：２０２０－０６－１３作者简介：马 娅（１９８７—），女，甘肃定西人，兰州石化职业技术学院讲师，硕士研究生，主要研究方向为化学与生物传感器。
牛奶中抗生素残留检测的研究现状马 娅，马丽娜，史俊杰，焦林宏，王红玉（兰州石化职业技术学院，甘肃兰州 ７３００６０）摘要：牛奶在人们饮食中占有重要地位，但是种种原因使得抗生素残留于牛奶中，严重影响奶品品质及人体安全，乳品中抗生素残留的检测和管理尤为重要。
本文主要介绍牛奶中抗生素残留的三种检测方法：微生物检测法、理化检测法和免疫法。
而我国在生产管理上常用的筛查检测方法有ＴＴＣ法和ＳＮＡＰ法，两种方法各有优劣，而基于ＴＴＣ法的试纸检测法是一种正在研发的有潜力的筛查分析方法。
关键词：牛乳；抗生素；残留；检测方法中图分类号：Ｏ６５７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－０２１Ｘ（２０２０）１７－００８３－０２ 牛奶因其营养成分齐全、营养价值高、易消化吸收等特点，被誉为“食品之王”，逐渐成为人们生活中不可或缺的一种食品。
然而，奶牛饲养中为预防疾病常在饲料中添加抗生素，服用大剂量抗生素药物，获得的奶品中添加抗生素防止其腐坏［１］，这些因素均会导致抗生素在牛奶中残留，长期饮用含抗生素残留的牛奶不仅危害人类的健康，同时由于抗生素对发酵乳中发酵菌种的繁殖产生抑制作用使其发酵异常从而影响奶制品的品质［２］。
世界卫生组织（ＷＨＯ）在１９７９年就已经将抗生素列为污染物，之后各个国家都开始关注牛奶中抗生素残留检测，提出了不应检出抗生素的要求。
２００１年中华人民共和国农业行业标准也规定了无公害食品－生鲜牛乳中不能检出抗生素。
我国农业部在２００１年１０月发布实施了《无公害食品生鲜牛乳行业标准》，明确规定“新鲜牛乳中抗生素不得检出”。
２００２年发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定，奶中最高允许残留量（单位ｎｇ／Ｌ）标准是：新霉素为５００；庆大霉素为２００；林可霉素为１５０；四环素、土霉素、磺胺类等均为１００［３］。
南京林业大学乳品中抗生素残留检测方法研究进展Review on the Methods for Determination of Antibiotic Residues in Milk Products侯雯食品科学与工程森林资源与环境学院指导老师：石瑞2011/12/22乳品中抗生素残留检测方法研究进展侯雯南京林业大学森林资源与环境学院江苏南京 210037摘要随着我国奶牛饲养业的日益发展，多种抗生素被越来越多地被应用于饲料添加剂和预防奶牛疾病中,不可避免地产生了乳品抗生素的残留。
乳品中残留的抗生素不但危害人体的健康,造成人体免疫力的降低，同时也会影响牛奶的品质，经济蒙受损失，对正常贸易产生负面影响。
文章从牛乳中抗生素残留的现状、来源、产生的危害、目前所用的检测方法以及近期检测方法的研究进展等方面进行综述，并对控制抗生素残留提出了相关的建议。
本文为加强我国对乳制品中抗生素的检测监督，解决目前乳品工业发展中面临的一些问题提供了参考。
关键词：乳品; 抗生素残留;微生物法;高效液相色谱法;免疫法Review on the Methods for Determination of Antibiotic Residues in Milk ProductsHouwen Forest Resources and Environment, Nanjing Forest University, Nanjing Jiangsu Province,210037ABSTRACT：With an increasing development of the milk industry in our country, multi-antibiotics have been applied widely to the feed additives and the preventing and treating diseases of dairy cattle ,which inevitably produces residues in milk. The antibiotic residues in milk not only do damage to people’s health, causing hypoimmunity ,but also have negative effects on the quality[在此处键入文档的摘要。
牛奶中的抗生素残留检测方法研究进展3.1微生物检测法微生物检测法是应用较广泛的方法，其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用,来定性或定量确定样品中抗微生物药物残留，如纸片法（PD）、TTC法、拭子法（STOP）等。
采用传统的微生物检测方法，缺点是：(1)时间长；(2)显色状态判断通过肉眼辨别，易产生误差，对微红色者无法做出准确判断；(3)操作复杂。
优点是费用低，一般实验室都能操作。
其中，纸片法和TTC法是牛奶中药物残留检测的两种常用的微生物检测法。
3.1.1纸片法纸片法，即PD法(Paper Disc)。
常用的纸片法有枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆菌纸片检测法。
这两种方法主要用来检测牛奶中的β－内酰胺类抗生素，其操作过程基本相同，而选用的菌种不同。
枯草杆菌纸片法检测的结果易出现假阳性，为了确定阳性物质是否为青霉素（或β－内酰胺类），对加热后的乳样用青霉素酶处理，以灭活乳样中的青霉素。
然后再行检测，检测限可达0.01 IU/mL。
而嗜热脂肪杆菌纸片检测法不仅用于检测奶样中β－内酰胺类抗生素，并能暗示是否还存在其它抑菌物质，检测限可达0.008 IU/mL以下。
一般在4h 内即可获得结果。
因此，在实践中嗜热脂肪杆菌纸片法比枯草杆菌纸片法应用更为广泛。
此外，神保胜彦(1991)对纸片法作了进一步研究和改进。
改进后的纸片法不仅能够确定抗生素的种类，而且提高了检出率和准确性，氯霉素最低检出量0.01mg/kg，土霉素0.05mg/kg，链霉素1mg/kg，红霉素0.05mg/kg，青霉素0.0025mg/kg。
3.1.2 TTC法TTC法，即氯化三苯基四氮唑法( tripheye tetrazolium chloride)，是目前我国食品卫生标准中规定的检查牛乳中抗生素残留的检测方法(GB5409—85)。
该法简便、快速，无需特殊设备，3～4h可见报告，很适合牧场、乳品厂及食品卫生检测部门采用。
检测各种抗生素所用的TTC法试验的灵敏度（最低检出量）分别为：青霉素0.004 U/mL，链霉素0.5 U/mL，庆大霉素0.4 U/mL，卡那霉素5 U/mL。
目前趋向研究更为灵敏、准确、简便、快速的微生物检测方法。
如美国和加拿大，使用拭子法和牛的抗生素和磺胺实验法（CAST）。
此外，美国近年来补充的一个新的实验方法－快速抗生素筛选法（FAST）。
尽管这些快速微生物检测法有时会产生一些假阳性，但在某种程度上是允许的；如产生这类情况，可进一步做确证实验。
3.2理化检测法理化检测方法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、联用技术等等，能进行定性、定量和药物鉴定，敏感性较高，但有的检测程序较复杂，有的检测费用较高。
在牛奶中抗生素残留检测方面，最常用的理化检测方法是高效液相色谱和联用技术。
3.2.1高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)是目前广泛应用的一种理化检测方法，它引入了气相色谱理论，在技术上采用了高压泵，高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分离速度快、效率高和操作自动化。
几乎所有的化合物包括高极性／离子型待测物和大分子物质，均可用HPLC进行测定。
HPLC的分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加精细(ф 5～10μm)，需高压泵推动，柱效高(105塔板／m)，速度快，灵敏度与GC相近。
与GC相比，HPLC流动相参与分离机制，其组成、比例和pH值等可灵活调节，如离子对色谱、胶束色谱、手性分离色谱等，使许多极难分离的待测物得以分析。
反相HPLC发展最快，目前已成为大多数抗生素残留的常规分析方法。
主要原因是：(1)化学键合固定相(C18或C8)性质稳定，不淋失；(2)使用水、甲醇或乙腈等水溶性有机溶剂作流动相，不干扰紫外检测，成本低；(3)样品中极性杂质先流出，只需待测物出峰后即可重复进样，分析速度快。
最常用的检测方式为浓度型的紫外检测器和荧光检测器。
紫外检测器(UVD)最普及，其次是荧光检测器和电化学检测器(EChD)。
由于奶样中药物残留量少，背景干扰往往很严重，因此一般都通过柱前衍生反应来提高紫外检测器检测残留的灵敏度。
彭莉等报道了用高效液相色谱法（HPLC）检测牛奶中氯霉素的残留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中残留的氯霉素，用紫外检测器在278nm检测样品。
平均加收率94.8％，变异系数< 12.0％。
此方法样品前处理简单、回收率高、实用性强、检验灵敏度高、重现性好、检测数据准确可靠，可作为牛奶中氯霉素残留检测的确证方法。
由于大部分抗生素在高于230nm的光谱区无吸收，而在低于230nm的紫外区许多样本基质和流动相产生干扰，需衍生化后测定，限制了紫外检测器的应用。
但是，大部分抗生素是手性分子，因此旋光检测器有很大发展潜力。
旋光检测有以下特点：(1)选择性高，样本仅需简单提取即可；(2)灵敏度高，利用He－He激光作光源，灵敏度可达5～10uα水平；(3)可同时得到流出组分的比旋度[α]，用以定性。
目前，该方法已用于红霉素、庆大霉素、羧苄青霉素和吩羧青霉素残留的测定。
此外，光二极管阵列检测器(DAD)是近10年来HPLC最重要的突破。
DAD可同时接收整个光谱区的信息，在色谱峰流出同时能进行每个瞬间的动态光谱扫描并快速采集信号，经计算机处理后得到色谱—光谱的三维图谱，信息量大大增加。
一次进样可得到每个组分峰的定量、定性和纯度信息，灵敏度亦明显提高。
3.2.2联用技术各种分析技术联用是现代兽药残留分析乃至整个分析化学方法上的发展特点。
计算机的应用加速了这一趋势。
联用技术可扬长避短，一般集分离、定量和定性(分子结构信息)于一体，因而特别适用于确证性分析。
常见的联用技术，有TLC－MS、GC－MS、LC－MS、CZE－MS、LC－NMR、SFC－MS等。
TLC－MS是最简单的离线联用技术。
GC－MS已相当成熟，应用相对较多。
但这些联用仪价格昂贵，远不如HPLC或GC那样普及。
MS无疑可作为HPLC的通用型检测器。
使用微型柱(15×0.3cm id)和适宜的接口技术，如热喷雾(TSP)、微粒束(PB)等解决了LC与MS的连接问题；使用软电离技术，如快原子轰击(FAB)、场解吸(FD)等解决了难气化物质的离子化问题。
LC－MS现在已进入实用阶段，其灵敏度较荧光检测器高1个数量级，能方便地对ng级的兽药残留组分进行检测与结构确证。
LC－NMR还可提供待测物立体化学方面的信息。
LC/MS是除GC/MS之外的一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的系统。
LC/MS 对高沸点、不挥发和热不稳定的化合物分离和鉴定具有独特的优势。
色/质联用法由于实现了高效层析分离和检测联机，可用微电脑控制层析条件、程序和数据处理，其特异性、灵敏度和重复性均好，并可一次同时完成同一样本中多种药物及其代谢物检测。
其分析方式有直接探头分析法、直接液体导入法、GC/MS、LC/MS联用法等。
使用电子轰击离子化、化学电离、快速原子轰击、热喷雾电离、等离子体喷雾、粒子束电离、大气压化学电离（APCI）和电喷雾电离（ESI）技术对不同MS离子源条件下青霉素类药物分子碎片类型的特征已经作了大量的工作。
另外离子阱质谱技术（MS/MS）也已用于鉴别青霉素类药物。
如Straub 等使用LC/ES/MS测定了牛奶中的几种青霉素残留。
青霉素，邻氯青霉素与苄青霉素的最低测定限为3～5μg/kg。
Kihak 等以NCI方式的LC/PB/MS技术成功地对牛奶中OTC、TC与CTC残留进行确证，方法检测限为0.02～0.05μg/mL。
3.2.3其它理化检测方法牛奶中抗生素残留检测方法还有气相色谱法（GC）、高效薄层色谱（HPTLC）、超临界流体色谱(SFC)和毛细管区域电泳法(CZE)等。
这些方法尽管在残留检测中不常用，但因其各自特有的性能，能弥补常用方法中不足之处。
如GC有许多高灵敏、通用性或专一性强的检测器供选用，如氢焰离子化检测器(FID)、氯磷检测器(NPD)等，检测限可达μg/kg级；HPTLC的斑点原位扫描定量、定性和高效分离材料(Φ3～10μm)改变了常规TLC在灵敏度和重现性方面的不足，但保持了TLC的简便、快速和样品容量大的优点，可使用正相或反相板，分辨率几乎与HPLC相当，在抗生素残留的快速筛选性检测方面应用广泛；SFC可弥补GC和HPLC的不足，方便地连接各种灵敏的检测器(MS，ECD等)；CZE是90年代以来研究最活跃的分析技术之一，兼有高压电泳的高速、高分辨和HPLC灵活、高效的优点，柱效高达105塔板／m。
Nishi等(1989，1990)使用CZE和MEKC成功地分离了十几个β－内酰胺类抗生素。
CZE将在简化样本前处理、多残留分析和分析自动化方面发挥重要作用。
目前CZE 的主要问题是样品量太小，限制了检测的灵敏度。
CZE－MS可能是最好的解决办法。
此外，随着接口技术的显著改进，质谱作为一种质量流速型检测器，正广泛应用于残留分析的检测中。
电化学检测器也已用于检测邻氯青霉素、头孢菌素和青霉素。
3.3免疫法目前药物残留免疫分析技术主要分为两大类：一为相对独立的分析方法，即免疫测定法(immunoassays，IAs)，如RIA、ELISA、固相免疫传感器(soindphase immunosensor )等；二是将免疫分析技术与常规理化分析技术联用，如利用免疫分析的高选择性作为理化测定技术中的净化手段，典型的方式为免疫亲合色谱(immunoaffinity chromatogrphy,IAC)。
与常规的理化分析技术相比，免疫分析技术最突出的优点是操作简单，速度快、分析成本低。
以使用微量滴板的ELISA为例，免疫测定法取样量小，前处理简单、容量大，仪器化程度低，检测奶与GC/MS或GC/ECD相似，可方便地达到ng/g～pg/g级，分析效率则为HPLC或GC 的几十倍以上。
目前大部分抗生素已经建立了免疫测定法，如磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、沙拉沙星、链霉素、四环素、莫能菌素等。
免疫分析能与其他技术联用。
在联用方法中，免疫分析技术既可作为HPLC或GC等测定技术的样品净化或分离手段，如IAC/HPLIAC/GC、HOIAC/HPLC；也可作为其离线或在线检测方法，如HPLC/IA、TLC/IA、CZE/IA、SFC/IA、FIA/IA等，这些方法结合了免疫分析的选择性、灵敏度与HPLC、GC等技术的高速、高效分离和准确检测能力，使分析过程简化、分析成本下降，拓展了待测物范围。
在HPLC/IA等分析中，IA一般作为离线检测方法。
又称免疫图谱法（immunograms），适用于液相检测器无响应或分离困难的残留组分的检测。
FIA/IA可以实现IA的动态、实时和自动检测，分析速度快，已发展为一种专门的免疫测定技术－FIIA。
