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大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达陈丽丽;虢灿杰;陈源文;李定国【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2010(030)010【摘要】目的构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础.方法从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒.慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度.将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting 方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体.倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL.重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达.BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义(P<0.05).结论成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达.【总页数】6页(P1189-1193,1216)【作者】陈丽丽;虢灿杰;陈源文;李定国【作者单位】上海交通大学,医学院附属新华医院消化内科,上海200092;上海交通大学,医学院附属新华医院消化内科,上海200092;上海交通大学,医学院附属新华医院消化内科,上海200092;上海交通大学,医学院附属新华医院消化内科,上海200092【正文语种】中文【中图分类】R373%Q786【相关文献】1.靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默 [J], 李菁华;刘震雄;赵曙光;张哲;闻勤生;王景杰;张明鑫2.靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默 [J], 李菁华;刘震雄;赵曙光;张哲;闻勤生;王景杰;张明鑫3.BMP-7过表达抑制大鼠肝星状细胞上皮-间叶转化 [J], 陈丽丽;虢灿杰;陈源文;沈峰;李定国4.利用CRISPR/Cas9慢病毒载体构建敲除大鼠肝星状细胞COX-2基因的细胞模型 [J], 彭敏;曹婷;阳学风;易世杰;傅念;周克兵;龙建武5.重组副腺病毒介导的大鼠星状细胞激活相关蛋白基因转染对大鼠肝星状细胞表达间质胶原酶mRNA的影响 [J], 李欣燕;许瑞安;王广基;谢海棠;赵小辰;陈淼因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白-7真核表达载体的构建及序列分析陈勇;赵雪花;王海燕;朱汉荣;夏瑞明;成彩莲【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2005(16)6【摘要】利用PCR技术,从质粒pRSET/mIGFBP-7中获得目的基因小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白-7(mIGFBP-7),将其插入质粒pcDNA3.1/HisB中,构建了含mIGFBP-7的真核表达重组质粒pcDNA3.1/mIGFBP-7.经测序鉴定,重组质粒构建正确,为下一步对其功能研究奠定了基础.【总页数】2页(P630-631)【作者】陈勇;赵雪花;王海燕;朱汉荣;夏瑞明;成彩莲【作者单位】武汉科技大学,医学院生物化学教研室,湖北,武汉,430080;武汉科技大学,医学院生物化学教研室,湖北,武汉,430080;武汉科技大学,医学院生物化学教研室,湖北,武汉,430080;武汉科技大学,医学院生物化学教研室,湖北,武汉,430080;武汉科技大学,医学院生物化学教研室,湖北,武汉,430080;武汉科技大学,医学院生物化学教研室,湖北,武汉,430080【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.人胰岛素样生长因子-1基因克隆及其真核表达载体的构建 [J], 牛嗣云;岳凤鸣;陈志宏;高维娟;高福禄2.人胰岛素样生长因子-1真核表达载体的构建及在神经干细胞中的表达 [J], 朱登纳;王军;贾延劼;牛国辉;张博爱;吴值荣3.小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白7原核表达载体的构建 [J], 邱惠;陈勇;韦罗生4.Ⅰ型胰岛素样生长因子重组真核表达载体的构建及在烫伤大鼠皮肤中的表达 [J], 杨磊;高建华;王颖;王甲汉5.肌腱愈合及粘连形成机制的研究:胰岛素样生长因子1基因真核表达载体的构建及表达 [J], 程昌志;张正治;潘险峰;苟俊;孙玮;潘峰;傅晓岚;白贵友因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
pEGFP-HPV16E7重组融合蛋白质粒的构建及其表达左泽华;李辉;伍欣星【期刊名称】《中国病毒学》【年(卷),期】2003(018)004【摘要】应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与人乳头瘤病毒16型E7(HPV16E7)的重组融合表达质粒,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析后,用基因转染技术将其导入小鼠肝癌细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达.酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段的大小、方向和插入位点均正确,在转染的小鼠肝癌细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.构建的pEGFP-HPV16E7融合表达质粒能直观地反映转染细胞中EGFP-HPV16E7融合蛋白的表达.由于转化率与表达率融为一体,故有利于对转染细胞的筛选,缩短转染细胞在体外的筛选的时间适用于对HPV16E7分子生物学特性、致瘤机理及APC提呈等的研究.为建立表达HPV16E7的实体瘤动物模型奠定了基础.【总页数】4页(P344-347)【作者】左泽华;李辉;伍欣星【作者单位】武汉大学医学院病毒学研究所分子生物学研究室,湖北武汉,430071;武汉大学医学院病毒学研究所分子生物学研究室,湖北武汉,430071;武汉大学医学院病毒学研究所分子生物学研究室,湖北武汉,430071【正文语种】中文【中图分类】R373【相关文献】1.重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达 [J], 赵亮;姚丽娟;孔建新;濮跃晨;孙安源;罗以勤;张林杰2.人IL-6和TNF突变体重组融合蛋白表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达 [J], 刘丽;欧阳应斌;黄培堂;刘及3.组织蛋白酶B过表达质粒和特异性siRNA表达质粒的构建与转染及对血管平滑肌细胞作用初步探讨 [J], 张涛;羊镇宇;薄小萍;王强;陈茂华;李坚;郭素峡;冯健;尤华彦4.含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅴ.IFN-γ基因真核表达重组质粒的构建及其在DNA免疫中基因佐剂的作用 [J], 郭虹;陈观今;郑焕钦5.弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建 [J], 郭虹;陈观今;周永安;郑焕钦;刘彦文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组质粒pEGFP-N1-apoJ的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达周冲;刘学良;郑晓梅;刘亮【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2015(025)033【摘要】目的体外构建重组质粒pEGFP-N1-apoJ,转染大鼠骨髓间充质干细胞,并检测其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达.方法通过脂质体介导重组质粒pEGFP-N1-apoJ转染大鼠骨髓间充质干细胞,确定转染效率,并通过Real-time PCR、免疫细胞化学法、Western blot法检测载脂蛋白-J(apoJ)的表达.结果增强型绿色荧光蛋白在大鼠骨髓间充质干细胞中瞬时转染效率达35％.转染后Real-time PCR、免疫细胞化学法和Western blot法检测证实重组质粒pEGFP-N1-apoJ在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达.结论重组质粒pEGFP-N1-apoJ成功转染大鼠骨髓间充质干细胞,并在大鼠骨髓间充质干细胞中得到表达,有助于应用apoJ行基因治疗,为进一步研究apoJ作为新的脑出血治疗措施奠定实验基础.【总页数】5页(P15-19)【作者】周冲;刘学良;郑晓梅;刘亮【作者单位】四川医科大学附属第一医院神经外科,四川泸州646000;四川医科大学附属第一医院神经外科,四川泸州646000;四川医科大学附属第一医院神经内科,四川泸州646000;四川医科大学附属第一医院神经外科,四川泸州646000【正文语种】中文【中图分类】R-332【相关文献】1.CD47重组质粒及其过表达重组大鼠骨髓间充质干细胞的构建及鉴定 [J], 叶力文;邓玮;陈庆伟;柯大智;李桂琼2.重组质粒pEGFP-BMP7的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达 [J], 胡静;戚孟春;邹淑娟;李继华;周海孝3.EGFP标记的VEGF165重组质粒的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达 [J], 易甫;张荣庆;贾国良4.重组质粒pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达 [J], 张斌青;安锐;吴涛;孙逊5.含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅴ.IFN-γ基因真核表达重组质粒的构建及其在DNA免疫中基因佐剂的作用 [J], 郭虹;陈观今;郑焕钦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组BMP7真核表达载体的构建及其对关节软骨细胞的转染曲福军;侯宜;戚良晨;刘丽玲;池光范;侯立中【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2005(31)6【摘要】目的:构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体,并探讨转染关节软骨细胞的脂质体和DNA的最佳比例及BMP7基因表达.方法:构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体.用脂质体将pcDNA3.1-BMP7包裹形成DNA脂质体复合物,转染家兔关节软骨细胞,G418筛选.转染过程中确定脂质体浓度、脂质体与pcDNA3.1-BMP7质粒的比例.原位杂交、PCR、Western blotting测定BMP7表达.结果:构建了pcDNA3.1-BMP7真核表达载体,脂质体与pcDNA3.1-BMP7质粒最佳转染浓度为3 mL培养液中加10μL脂质体和4μgpcDNA3.1-BMP7质粒(2.5:1);以400 mg·L-1G418的正常培养液筛选28 d,BMP7为阳性表达.结论:在脂质体介导下,pcDNA3.1-BMP7转染家兔关节软骨细胞获得成功,且BMP7在该细胞中稳定表达.【总页数】5页(P819-823)【作者】曲福军;侯宜;戚良晨;刘丽玲;池光范;侯立中【作者单位】吉林大学再生医学科学研究所生物化学研究室,吉林,长春,130021;哈尔滨医科大学附属第二医院,临床药学药物研究所,黑龙江,哈尔滨,150086;吉林大学再生医学科学研究所生物化学研究室,吉林,长春,130021;吉林大学中日联谊医院,胸外科,吉林,长春,130031;黑龙江省哈尔滨市兽医研究所,黑龙江,哈尔滨,150086;吉林大学再生医学科学研究所生物化学研究室,吉林,长春,130021;吉林大学再生医学科学研究所生物化学研究室,吉林,长春,130021【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.利用同源重组技术构建DKK1、BMP4真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究 [J], 张梦瑶;杨峰;刘开东;刘积凤;贺建宁;柳楠2.利用同源重组技术构建Hoxa5、BMP6真核表达载体及共转染成纤维细胞表达[J], 李晶;张梦瑶;刘开东;柳楠;贺建宁3.利用同源重组构建Chordin、BMP6真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究 [J], 荣恒;李晶;柳楠;张梦瑶;贺建宁4.利用同源重组构建BMP6、BMPR1B真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究 [J], 荣恒;张梦瑶;贺建宁;柳楠5.重组真核表达载体pEGFP-N1/PDGF-A的构建及真皮干细胞的转染 [J], 闫国和;粟永萍;王军平;汪代杰;艾国平;王锋超;冉新泽;程天民因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
BMP7在骨髓间充质干细胞中的表达及诱导该细胞向软骨细胞分化的开题报告一、课题背景随着人口老龄化和运动伤害的增加，骨和关节疾病的患病率明显升高。
软骨缺陷和骨关节炎等疾病是临床上常见的骨和关节疾病，严重影响着患者的生活质量。
骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，被广泛用于组织工程和再生医学的研究中。
利用BMSCs治疗软骨缺损和骨关节炎具有很大的潜力，但目前其临床应用还面临着很多挑战，其中一个重要的难点就是如何有效地促使BMSCs 向软骨细胞分化。
BMP7是骨形态发生蛋白家族的一员，已被证明能够促进软骨细胞的形成和维持软骨组织的稳定性。
然而，关于BMP7在BMSCs中的作用尚不完全清楚，特别是其对BMSCs向软骨细胞分化的调控机制尚未明确。
二、研究内容本课题的目标是探究BMP7在BMSCs中的表达水平以及其诱导BMSCs向软骨细胞分化的作用及调控机制。
具体研究内容包括：1. 检测BMP7在BMSCs中的表达水平：采用免疫荧光染色和Western blotting 等技术检测BMP7在BMSCs中的表达水平，并对其时空表达特点进行分析。
2. 观察BMP7对BMSCs向软骨细胞分化的作用：根据已有文献报道，将BMSCs 通过特定的培养条件（如添加适当浓度的胰岛素、转化生长因子β、维生素C等）诱导向软骨细胞分化。
通过添加不同浓度的BMP7（如10、50、100 ng/mL）来观察其对BMSCs向软骨细胞分化的影响。
3. 探究BMP7诱导BMSCs向软骨细胞分化的调控机制：在BMP7诱导的软骨分化过程中，采用基因组学和蛋白质组学方法分析相关信号通路和转录因子的表达和调控。
三、研究意义和价值该研究将有助于深入了解BMP7在BMSCs中的作用及其诱导BMSCs向软骨细胞分化的调控机制，为利用BMSCs治疗软骨缺损和骨关节炎提供理论基础和实验依据。
同时，本课题所涉及的技术也将为组织工程和再生医学领域的研究提供新的思路和策略。
BMP-2重组质粒转染骨髓间充质干细胞及表达的检测张明磊;常非;高忠礼;柳扬;刘光耀【摘要】目的 pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒转染骨髓间充质干细胞,并检测其在靶细胞中的表达.方法脂质体将pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒转染入BMSCs,荧光显微镜下观察绿色荧光,计算转染率,利用ELLISA法检测目的基因在靶细胞中的表达,免疫组化染色检测成骨特异性生化指标(I型胶原、ALP及骨钙素).结果本实验成功的利用脂质体将质粒转染入BMSCs,目的基因可以持续高表达,并促进细胞向成骨方向分化.结论为进一步利用BMP-2基因修饰组强Ⅰ程骨促进成骨提供实验基础.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2010(014)011【总页数】3页(P1742-1744)【关键词】骨髓间充质干细胞;骨形态发生蛋白;转染【作者】张明磊;常非;高忠礼;柳扬;刘光耀【作者单位】吉林大学中日联谊医院,骨科,吉林,长春130021;吉林大学中日联谊医院,骨科,吉林,长春130021;吉林大学中日联谊医院,骨科,吉林,长春130021;吉林大学中日联谊医院,骨科,吉林,长春130021;吉林大学中日联谊医院,骨科,吉林,长春130021【正文语种】中文【中图分类】Q7骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为骨组织工程常用种子细胞之一,具有很强的成骨分化能力,在特定环境中可以被诱导分化为成骨细胞,促进骨修复过程。
但其成骨速度、成骨效率、修复骨缺损的效果并不令人满意[1]。
基因治疗及转基因技术的发展为解决这些问题提供了一条有效的道路,将编码细胞因子的基因导入BMSCs中,植入骨缺损部位,在局部持续产生细胞因子,以自分泌和旁分泌的方式诱导成骨。
本实验中将 BMP-2基因转染BMSCs,表达BMP-2,促进骨修复效应,为治疗临床上治疗骨缺损奠定良好的基础。
1 材料和方法1.1 材料 pEGFP-N1/BMP-2真核表达质粒(吉林大学中日联谊医院骨科构建),LIPofectamineTM脂质体转染试剂盒(Gibco公司),DMEM培养基(美国Gibco 公司),胎牛血清(美国Hyclone公司),SP免疫组化试剂盒、DAB(福州麦新生物技术有限公司),兔抗人BMP-2抗体(Santa Cruz)。
重组质粒pEGFP-BMP7的构建及在大鼠骨髓MSCs中的表达作者姓名:胡静，戚孟春，邹淑娟，李继华,周海孝作者单位:四川大学华西口腔医学院E-mail:drhu@中文摘要：目的 本研究旨在通过基因重组策略体外构建重组质粒pEGFP-BMP7，并检测其在大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）中的表达。
方法 应用RT-PCR方法从大鼠肾脏中分离、扩增目的基因片段，并进行测序；随后将所得cDNA定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1中，进行双酶切来鉴定克隆的正确性。
通过脂质体介导重组pEGFP-BMP7瞬时转染大鼠骨髓MSCs，确定转染效率；并通过RT-PCR、免疫细胞化学手段检测BMP7的表达。
结果 通过RT-PCR成功获得了一1.3kbp的cDNA片段；该cDNA除756bp处有一碱基从T突变成A外，其余序列与大鼠BMP7基因完全相符。
重组质粒双酶切图谱显示，BMP7 cDNA被正确插入到载体中。
绿色荧光蛋白（GFP）在大鼠MSCs中早期瞬时转染效率可达33%。
转染后RT-PCR 和免疫细胞化学检测证实了重组pEGFP-BMP7在大鼠MSCs中的表达。
结论 本研究成功构建了重组真核表达质粒pEGFP-BMP7，并在大鼠骨髓MSCs中得到表达。
该策略有助于应用BMP7行基因治疗，促进DO骨痂形成和修复颅颌面骨缺损。
关键词：骨形成蛋白7；基因克隆；基因转染；间充质干细胞；绿色荧光蛋白骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）属TGF-β超家族。
目前发现的BMPs 成员已达10多种，其中BMP7是对骨组织再生作用最强的BMPs成员之一。
在胚胎发育中，BMPs 对骨组织形成具有重要的调节和促进作用[1]；外源性BMPs也被证实可有效促进骨折愈合和骨缺损的修复[2]。
近年来，重组BMPs也被用以促进牵张成骨（distraction ostegenesis, DO）骨痂形成。
但由于其生物活性半衰期短，体内容易流失，因而效果并不理想。
探索更好的途径，来充分发挥其促进骨形成的作用，是目前各国学者不断探索的课题。
本研究旨在建立BMP7基因的体外真核细胞表达系统，为其进一步基因治疗，促进DO骨痂形成和修复颅颌面骨缺损奠定实验基础。
- 1 -1．材料和方法1.1 实验材料携有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green fluorescent protein, EGFP)质粒pEGFP-N1购自美国BD Clontech公司；感受态细菌DH5a、LB培养基、限制性内切酶、T4DNA连接酶均为美国GIBCO公司产品；脂质体Lipofectamine TM2000、DNA Ladder购自美国Invitrogen公司；兔抗鼠BMP7单克隆抗体购自美国SANTA CRUZ公司；上下游引物合成及DNA测序由上海生工完成。
1.2 目的基因大鼠BMP7 cDNA的获得根据Gene Bank中大鼠BMP-7基因的全mRNA系列，设计2条引物，包含了起始和终止密码子；在上下游引物中分别引入Hind III和BamH I限制性内切酶位点及各3个保护性碱基。
上游引物（P1）：5’CCT aagctt ATG CAC GTG CGC TCG CTG CGC GCT，下游引物（P2）：5’TTT ccatcc CTA GTG GCA GCC ACA GGC CCG GAC CA。
从大鼠肾脏中提取总RNA，并用上述引物通过RT-PCR法扩增得到目的基因cDNA片段，送上海生工测序。
1.3 真核表达载体pEGFP-BMP7的体外构建将PCR扩增所得cDNA片段和携有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的真核表达载体pEGFP-N1用Hind III和BamH I进行双酶切，分别回收1.3kb 和4.7kb的片段；用T4 DNA连接酶将 1.3kb的目的基因片段连入线性化的pEGFP-N1（4.7kb）中。
然后转化感受态大肠杆菌DH5a，挑选单个阳性菌落接种于含卡那霉素的液体LB培养基中，37℃振荡过夜，以碱裂解法中量提取质粒。
分别用Hind III和BamH I进行单酶切和双酶切鉴定；所得重组质粒命名为pEGFP-BMP7。
1.4 脂质体介导pEGFP-BMP7瞬时转染大鼠骨髓MSCs分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）[3]，并于6孔板内制备细胞爬片。
细胞转染分为三组：A组为实验组，用质脂体Lipofectamine TM2000进行pEGFP-BMP7转染；B组为实验对照，转染空pEGFP-N1质粒；C组为空白对照，只加入等量质脂体，其余步骤相同。
细胞转染24h后，于荧光显微镜下观察细胞内荧光表达情况；并分别测定转染后2d、7d、14d、21d和28d EGFP的表达效率，观察期限为4w。
1.5 目的基因BMP7在MSCs中的表达检测RT-PCR法检测BMP7的表达：转染后72h，收获三组细胞，提取细胞总RNA；并用先前设计的上下游引物，通过RT-PCR法检测BMP7基因的表达。
PCR扩增的条件为：95℃变性5min 后，按下述参数循环30次：94℃变性20s，55℃退火30s，68℃延伸1min；末次循环后，- 2 -在延伸温度下再延时5min。
各组PCR产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
免疫细胞化学法检测BMP7蛋白的表达：转染后72h，收获三组细胞爬片。
经丙酮固定，用1％H2O2处理，滴加正常羊血清，37℃孵育30min；去血清，滴加兔抗鼠BMP7单克隆抗体 (1:100)，4℃过夜。
滴加生物素化的羊抗兔IgG，37℃孵育30min；上述各步之间均用PBS振荡洗涤。
最后用DAB显色，常规脱水、封片，显微镜下观察。
2. 结 果2.1 目的基因BMP7的获取及测序从大鼠肾脏中获取的基因，经PCR扩增后，其产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，显示为一1.3kbp左右的cDNA片段（图1a）；经测序表明，该片段全长1311bp；两端除去18bp 的限制性内切酶和保护碱基，中间为1293bp的目的基因。
目的基因除756bp处碱基由T突变成A，氨基酸由天冬氨酸变成谷氨酸外，其余序列均与大鼠BMP7基因序列相同；说明所获序列为大鼠BMP7 cDNA序列。
2.2 重组质粒pEGFP-BMP7的酶切鉴定分别用Hind III和BamH I对重组质粒pEGFP-BMP7进行单酶切和双酶切，并行1％琼脂糖凝胶电泳。
结果显示：重组质粒经Hind III和BamH I单酶切后，为单一的6.0kbp 左右的条带；而双酶切后，则可同时获得1.3kbp和4.7kbp左右的2条片段；前者为目的基因片段，后者为载体DNA片段；说明载体pEGFP-N1中已插入BMP7基因，且连接正确，重组质粒pEGFP-BMP7构建成功 (图1b)。
图1. BMP7基因的获取 (a) 和重组质粒pEGFP-BMP7酶切图谱 (b). 带1，pEGFP-N1; 带2，Hind III；带3，BamH I；带4，Hind III+BamH I2.3 脂质体介导的质粒对MSCs的瞬时转染经脂质体Lipofectamine TM2000介导转染48h后，A、B、C三组细胞均有少量细胞发生死亡，并呈悬浮状态（<10%），这是由脂质体的细胞毒性造成；经换液去除这些细胞，以后未发生上述现象。
转染24h开始，B组细胞有较多的细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光（图2）；A组和C- 3 -组未见荧光（A组目的基因后加了终止密码子，绿色荧光蛋白不表达）。
绿色荧光多见于折光性强，处于分裂期的细胞；荧光强弱不均，提示基因转入的拷贝数略有差异。
至转染后7d，绿色荧光强度无明显改变；以后随着时间的延长，绿色荧光呈下降趋势。
至转染14d 后，绿色荧光蛋白表达明显降低；转染后28d，只有少数细胞发出绿色荧光。
绿色荧光蛋白EGFP在第2、7、14、21、28d对MSCs的转染效率分别为32.58%、28.5%、19.62%、15.52%和7.79%。
图2. 绿色荧光蛋白在MSCs中的表达. a，相差显微镜(×100)；b,荧光显微镜(×100)图3. 免疫细胞化学检测BMP7在MSCs中的表达(×100)图4 RT-PCR法检测BMP7在MSCs中的表达. 带1, A组; 带2, B组; 带3, C组; 2.4 目的基因BMP7在MSCs中的表达转染后的三组细胞经免疫细胞化学检测，只有A组（pEGFP- BMP7转染）部分细胞染色为阳性，阳性率约为33%。
B和C组细胞免疫细胞化学染色均为阴性。
提示A组细胞转染后表达了目的基因BMP7(图3)。
三组细胞的总RNA经RT-PCR扩增后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，只有A组细胞- 4 -在约1.3kbp处有一特异性扩增条带，提示有目的基因转录；而B组和C组细胞，均未见特异性扩增条带 (图4) 。
3. 讨 论骨形成蛋白（BMPs）属TGF-β超家族；是目前发现的对骨组织再生作用最强的生长因子。
BMPs以同源或异源二聚体的形式发挥作用；与具有磷酸激酶活性的I型和II型胞膜受体结合，使胞内第二信使Smad蛋白发生磷酸化，并进一步激活胞核内的靶基因，促使其表达[2, 4]。
BMPs 能够促进未分化间充质细胞（MPCs）和成骨细胞前体增殖，并诱导其向成骨/成软骨细胞方向分化；同时对MPCs、成骨细胞和内皮细胞具有趋化作用，因而可通过促进它们的募集和血管生成来诱导骨形成[5]。
BMPs还可影响多种生长因子和激素的分泌，来促进骨再生。
研究显示，外源性BMPs可有效促进骨折愈合和骨缺损的修复[2]。
最新研究也表明，牵张间隙内有BMPs 的特异时空表达，提示BMPs在DO中同样发挥重要的作用[[6, 7]。
pEGFP-N1是野生型绿色荧光蛋白 (GFP) 的突变体，适于在哺乳动物细胞内表达；其64位和65位氨基酸分别由野生型GFP的Phe和Ser突变成Leu和Thr，结果荧光表达明显增强[8]。
该质粒在GFP起始密码子上游具有多克隆位点，用以插入目的基因，来构建目的基因-GFP的融合蛋白，适于目的基因的体内原位检测。
本研究初期也曾尝试构建BMP7-GFP的融合蛋白，但未检测到BMP7和GFP的表达；考虑是由于融合蛋白影响了它们的空间构象造成；因而在正式实验中，在BMP7基因末端加入了终止密码子。
本研究通过从大鼠肾脏中提取BMP7 cDNA序列，并插入到pEGFP-N1多克隆位点中；双酶切结果显示，同时获得了1.3kbp和4.7kbp左右的2条DNA片段，分别与BMP7和pEGFP-N1大小相符，说明载体中已正确插入了BMP7基因，重组质粒pEGFP-BMP7构建成功。
