实验五血液中谷丙转氨酶活力的测定 (3)

谷丙转氨酶活力测定（改良赖氏法）一，实验目的掌握血清丙氨酸氨基转移酶（ALT ，也称谷丙转氨酶，GPT ）活性测定的原理。

熟悉转氨酶活性测定的操作方法。

了解测定血清丙氨酸氨基转移酶活性的临床意义。

二，相关理论体内蛋白质处于不断降解与合成的动态平衡食物蛋白质经消化吸收的氨基酸和体内组织蛋白质降解产生的氨基酸混在一起，分布于体内各处，作为参与代谢的氨基酸库氨基酸分解代谢的主要反应是脱氨基作用肝脏的脱氨基方式有:氧化脱氨基,氨基转换作用及联合脱氨基氨基转移酶转氨酶： 催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶谷丙转氨酶 glutamic-pyruvic transminase GPT 又称丙氨酸转氨酶alanine aminotransferase ALT三．转氨作用的意义正常时转氨酶主要分布在细胞内，血清中酶活力很低 GOT 以心脏细胞中活力最大，其次为肝脏细胞 GPT 则以肝脏细胞中活力最大谷丙转氨酶的临床意义如果GPT 血清值超过正常上限2－3倍，并持续两周以上，表明有肝胆疾病存在的可能。

参考范围：0-50 U/L ，卡门氏单位0-25 KarU 四．酶活力单位（U ，active unit ）国际单位：61年酶学委员会建议使用统一单位，在特定条件下，1分钟内转化1 μmol底物所需的酶量，称为一个国际单位（IU ，又称U ）1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm ，光径1cm 的条件下，1ml 血清使反应液的吸光度下降0.001的转氨酶活性。

卡门氏单位和国际单位换算1 IU/L ＝2.1 KarU 五，实验原理血清中的丙氨酸转氨酶（ALT ），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。

生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT 活性的高低成正比关系。

血清谷丙转氨酶的测定实验报告血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）是一种重要的肝脏酶，其测定可以用于评估肝功能和诊断肝脏疾病。

本实验旨在通过测定血清中ALT的活性，探究其在肝功能评估中的应用。

实验材料与方法。

1. 实验材料，实验所需材料包括ALT检测试剂盒、标准品、血清标本、比色皿、移液管等。

2. 实验方法：a. 样本处理，将采集的血清标本离心，取上清液置于4℃保存。

b. 实验操作，按照ALT检测试剂盒说明书进行操作，制备标准曲线和待测样本的反应体系。

c. 光度测定，使用分光光度计测定各标准品和待测样本的吸光度值。

d. 计算ALT活性，根据标准曲线计算待测样本中ALT的活性。

实验结果与分析。

经过实验测定，得到不同浓度的ALT标准曲线，吸光度与ALT浓度呈线性关系，相关系数达到0.99以上。

待测样本的吸光度值为X，通过标准曲线计算得到其ALT活性为Y。

进一步分析发现，实验组ALT活性显著高于对照组，说明实验组受到了肝脏损伤。

实验结论。

本实验通过测定血清中ALT的活性，成功评估了肝功能并诊断了肝脏疾病。

实验结果表明，ALT活性的升高与肝脏损伤密切相关，可作为肝功能评估和肝脏疾病诊断的重要指标之一。

实验注意事项。

1. 实验操作中需严格按照操作规程进行，避免操作失误导致结果误差。

2. 实验过程中需注意安全，避免接触有害化学品和受伤。

3. 实验结果需结合临床资料进行分析，以获得准确的诊断结论。

实验展望。

未来，可以进一步探究ALT在肝脏疾病诊断中的应用，寻找更为准确、快速的检测方法，为临床诊断提供更可靠的参考。

结语。

通过本实验，我们深入了解了血清谷丙转氨酶的测定方法和应用，为肝功能评估和肝脏疾病诊断提供了重要的实验依据。

希望本实验能对相关领域的研究和临床应用提供一定的参考价值。

3）、向空白与样品管中分别加入0.5 mL 2，4－二硝基 苯肼，摇匀，水浴保温15分钟。
4）、向空白管中加入0.1 mL血清，摇匀。
5）、向所以3支试管中都加入5.0 mL 0.4 M NaOH溶液， 摇匀并水浴保温15分钟后在520 nm进行比色测定。
保温30分钟
五、实验结果
1、用测定吸光值在标准曲线上查出丙酮酸的生成量 2、计算：
六、酶活力单位的定义
国际单位：在最适温度下，1分钟内转化1μmol底物的 酶量称为1个酶单位（U）。
Katal单位：在一定条件下，1秒钟内转化1mol底物所 需要的酶量。 1 U＝16.67 nKat 1 Kat ＝6 107 U
七、注意事项
1. 在测定谷丙转氨酶活力时，应事先将底物、血清在37℃水 浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。 2.转氨酶只能作用于α-L-氨基酸，对D-氨基酸无作用。实验 室多用α-DL-氨基酸。 3. 进行样品测定时，加入2,4-二硝基苯肼溶液后要摇匀并保 温15分钟。 4. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。
2. 标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL） 3.谷-丙转氨酶底物溶液 (含α-酮戊二酸2 μmol/ml及DL-丙氨酸200 μmol/ml) 4. 2.4二硝基苯肼溶液 (0.02%,1mol/L HCl溶液) 5. 0.4mol/L NaOH溶液 。
四、实验操作
1、标准曲线制作： 1）、取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5编号。 先将试管置于37℃恒温水浴中保温5分钟以平衡内外 温度。然后按下表所列的次序添加各试剂。
一．实验原理 转氨作用 指在转氨酶催化下 将-氨基酸的氨基转给 另一个-酮酸，生成相 应的-酮酸和一种新的 -氨基酸的过程,也称氨 基移换作用。

肝脏谷丙转氨酶活力测定
一、实验目的
掌握谷丙转氨酶的测定方法。
二、实验原理
谷丙转氨酶作用于丙氨酸及α-酮戊二酸，生成谷氨酸与丙 酮酸。丙酮酸与2.4-二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙，此 物在碱性溶液呈红棕色，与经同样处理的标准丙酮酸比色， 求得丙酮酸的生成量以表示酶的活性。
C O O H 500：标准丙酮酸浓度 2.
37℃ 水浴5 分钟
0.1
0.1（标准丙酮酸） 0.1
混匀后 37℃水浴 准确保温30分钟
0.1（H2O）
0.5
0.5
0.5
0.5
——
——
0.5
0.5
混匀后 37℃水浴 准确保温20分钟
各加5ml ，混匀，静置10min，读A 520nm 0.000
六. 附注
➢2.4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异 性的，α-酮戌二酸也能与2.4-二硝基苯肼作用而 显色。 ➢2.4-二硝基苯肼身也有类似的颜色，因此空白 管颜色较深。
2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g）
掌握谷丙转氨酶的测定方法。
C H 4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性的，α-酮戌二酸也能与2. 2 2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g） C H 2 C H 3 5μg 丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。
S ×2.
C H N H 新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏） 2 5：谷丙转氨酶换算单位 C O O H 2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g）
四. 实验试剂
1.标准丙酮酸 现配 2.谷丙转氨酶底物 4℃，1周
二硝基苯肼溶液
6.新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏）
五、实验步骤
1.肝匀浆
处理：20g 肝先用生理盐水洗净，滤纸吸干水，再用预冷的0.1M pH7.4 PB捣

光度。由测得的吸 A 光度在曲线上查得
试样溶液中待测组
分的浓度，最后计
算得到试样中待测
组分的含量。
0
浓度C
几点注意：
(1) 理想的标准曲线应为：用不同浓度标准 溶液所测得的吸光度对浓度作图时，是 一条斜率接近于1通过原点的直线；
(2) 标准溶液浓度范围应在被测物质浓度的 一半到二倍之间；
(3) 吸光度在0.05---1.0之间为宜。
A样 = KC样L
A标
KC标L
则：
C样 =
A样 A标
C标
2. 标准曲线法
(1) 配制一系列不同
含量的待测组分的 吸
标准溶液，以不含
光 度
待测组分的空白溶 A
液为参比，测定标
准溶液的吸光度。
并绘制
吸光度—浓度曲线
0
浓度C
(2) 得到标准曲线
（工作曲线），然
后再在相同条件下 吸
测定试样溶液的吸
光 度
四、操作步骤
五、注意事项
1.血清样品的测定需在显色后30分钟内完 成。
2.在血清中加入底物后，应准确记时。
பைடு நூலகம்
六、实验的结果
• 1.第一组同学绘制标准曲线 • 2.其余组的同学做ALT活性的测定 • 实验报告要求2项都完成
七、讨论与小结
实验三
血清谷丙转氨酶（ALT) 活性的测定
一、实验目的：
• 进一步掌握分光光度法基本原理和应用 • 通过实验, 理解酶促反应的原理 • 掌握反应原理、操作步骤及标准曲线的
绘制。
二、原 理
三、方法
分光光度法----标准曲线法
定量分析方法
1. 对比法
将标准与样品分别在相同条件下显色，测 定其吸光度。因是相同物质在相同条件下 测定，故可按下式计算出样品的浓度：

实验十、血液转氨酶（谷丙转氨酶）活力的测定（实验：肝脏谷丙转氨酶活力测定）（本实验分2个实验完成：一、制作标准曲线二、测酶活力和总结。

或就做二就可以）【目的和要求】1、了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，2、学习转氨酶活力测定的原理和方法。

3、熟悉分光光度计的使用。

【原理】生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。

转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。

它们催化的反应如下。

正常人血清中只含有少量转氨酶。

当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。

测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。

谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。

丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，其吸收光谱的峰为439—530nm，因此在波长520nm处吸光度度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本呈线性关系，故可藉可用分光光度法测定。

从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。

【试剂和器材】一、试剂1.试管及试管架2.吸管3.恒温水浴4.分光光度计5、移液管6、电子天平7、研钵8、容量瓶9、冰箱二、器材1、标准丙酮酸溶液[标准丙酮酸（500μg/ml）]：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于pH7.4 0.1M 的PBS中，定容到100ml。

现用现配。

2、谷丙转氨酶底物：0.90g L-丙氨酸，29.2mg α-酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。

然后用1M NaOH调节pH到7.4，再用pH7.4 0.1mol/L的PBS定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。

将试管于37℃水浴中保温，平衡管内外温度, 向各管内加0.5ml 2，4—二硝基苯肼后再保 温20分钟，
最后分别向各管内加入0.4N NaOH 5毫升，
在室温下静置30分钟后，
以0号管做“空白”用520nm进行比色，读出 光吸收值，以丙酮酸的微摩数为横坐标，光吸收 值为纵坐标，画出标准曲线。
表1.丙酮酸钠标准曲线的绘制
在各种转氨酶中，谷氨酸-草酰乙酸转氨酶 （简称谷草转氨酶）及谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简 称谷丙转氨酶）活力最强。
上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内， 在正常人血清中也有少量，机体发生肝炎。心肌 梗塞等病变时，血清中转氨酶活力显著增加，所 以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 它们的催化反应如下：
试剂
管号 0
1
2
3
4
5
丙酮酸钠标准液/ml 0.00
0.05
0.10 0.15 0.20 0.25
谷丙转氨酶底物/ml 0.50
0.45
0.40 0.35 0.30 0.25
磷酸缓冲溶液 0.10
0.10
0.10 0.10 0.10 0.10
(0.1M pH7.4) /ml
37℃水浴中保温， 平衡管 内外温 度
本方法中用分光光度法，根据硝基苯腙的生成 量可以计算酶的活力。
→
二、实验用品
1、材料 新鲜动物肝匀浆。
2、试剂 （1）0.1M磷酸缓冲液（pH=7.4）
取0.1M KH2PO4液50ml，0.1N NaOH液39.3ml， 再加蒸馏水10.7ml，混匀即得。 （2）丙酮酸钠标准液（2.0微克分子/ml）：
取A·R丙酮酸钠11mg溶解于50ml 0.1M磷酸缓冲液 内（宜当日新配）。

血清谷丙转氨酶的测定实验报告血清谷丙转氨酶的测定实验报告引言：血清谷丙转氨酶（AST）是一种存在于细胞质和线粒体中的酶，主要参与氨基酸代谢过程。

AST的测定在临床上具有重要意义，可以用于评估肝脏功能和诊断肝脏疾病。

本实验旨在通过酶促动力学方法测定血清中AST的活性，并分析实验结果。

实验材料与方法：1. 实验材料：- 血清标本：从健康志愿者采集的血样。

- AST测定试剂盒：包括底物、辅酶、酶标试剂等。

- 酶标仪：用于测定底物的光吸收值。

2. 实验方法：- 步骤一：标定酶标仪将已知浓度的AST酶标溶液分别加入不同的试管中，测定其对应的光吸收值，建立标准曲线。

- 步骤二：制备样本将采集到的血清标本离心，取上清液，稀释至适宜浓度。

- 步骤三：测定AST活性将标定好的试剂和稀释后的血清标本加入试管中，混匀后，放入酶标仪中测定吸光度。

- 步骤四：计算AST活性根据标准曲线，计算出各个样本的AST活性。

结果与讨论：通过实验测定，我们得到了一系列样本的AST活性数据。

根据标准曲线，我们可以计算出每个样本的AST活性，并进行进一步的分析。

首先，我们可以观察到不同样本之间AST活性的差异。

正常情况下，AST活性在一个相对稳定的范围内，超出该范围可能提示肝脏功能异常或疾病存在。

因此，通过测定AST活性，我们可以初步判断一个人的肝脏健康状况。

其次，我们还可以对不同条件下AST活性的变化进行研究。

例如，我们可以比较不同性别、不同年龄段、不同体重指数的人群的AST活性是否存在差异。

这样的研究有助于进一步了解AST在人体内的生理变化和代谢过程。

此外，我们还可以将AST活性与其他临床指标进行关联分析。

例如，我们可以比较AST活性与肝功能指标、炎症指标等之间的关系。

这些关联分析可以为临床诊断和治疗提供重要的参考依据。

总结：通过本实验，我们成功地测定了血清中AST的活性，并对实验结果进行了分析和讨论。

AST的测定在临床中具有重要意义，可以用于评估肝脏功能和诊断肝脏疾病。

在医学实验中，测定血清谷丙转氨酶（AST）活力是一项常见的实验项目。

AST是一种存在于细胞质和线粒体中的酶，其活力的变化与肝脏疾病、心肌梗塞等疾病有关，因此对其活力的测定具有重要的临床意义。

分光光度法是一种常用的测定AST活力的方法，其原理简单、灵敏度高，被广泛应用于实验室教学和临床实验中。

本文将介绍分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力的教学方法及实验原理。

二、实验原理1. 原理概述分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力的原理是通过测定NADH在340nm处的吸光度变化来间接测定AST的活力。

在AST催化下，谷丙酮酸被转化为丙酮酸，同时NADH被氧化为NAD+，在这个过程中，NADH的量减少，其在340nm处的吸光度也随之下降。

通过测定NADH在340nm处的吸光度变化可以间接测定AST的活力。

2. 实验步骤（1）样品制备：将待测血清标本离心沉淀，取清澈液体作为实验样品。

（2）反应体系配置：在离心管中依次加入0.1mol/L磷酸缓冲液、0.1mol/L谷氨酰胺、0.005mol/L的NADH和待测血清标本，将混合液置于37℃水浴中预温。

（3）光度计调零：将光度计调零，设置吸光度波长为340nm。

（4）反应开始：向预温的混合液中加入谷丙酮酸，开始计时测定吸光（5）记录数据：间隔一定时间（例如30秒）记录一次吸光度值，直至吸光度不再发生变化。

三、教学方法1. 理论讲解：在实验前，对分光光度法的原理进行详细的讲解，包括NADH在340nm处的吸光度变化与AST活力的关系，以及实验的步骤和注意事项。

2. 演示操作：老师可以进行实际的操作演示，展示如何配置反应体系、如何操作光度计、如何记录数据等。

3. 学生操作：让学生分组进行实验操作，指导学生合理分配实验任务，注意安全操作，并及时解答学生在实验中遇到的问题。

4. 数据分析：引导学生利用实验数据进行分析，计算得出血清谷丙转氨酶活力的结果，并进行讨论和总结。

四、实验结果分析通过分光光度法测定AST活力的实验，可以得到待测血清样本在一定时间内NADH在340nm处的吸光度值变化曲线。

向2支试管各加NaOH溶液5mL。 据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中GPT的活力。
二硝基苯腙（黄色），进而在碱性环境中生成 取血清加入1号试管内，准确保温30min。
取2支试管并标号，用1号试管作为测定管，2好试管作为空白对照管。 酶活力（U/100mL）的计算
红棕色的苯腙硝醌化合物。 在标准曲线上查出 丙酮酸的umol数（用1 umol丙酮酸代表酶活力单位），计算100mL血清中转氨酶的活力单位数。
据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中GPT的活力。 取血清加入1号试管内，准确保温30min。 测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。
酶活力（U/100mL）的计算 在标准曲线上查出 丙酮酸的umol数（用1 umol丙酮酸代表酶活力单位），计算100mL血清中转氨酶的活力单位数。 取出后向各管加入NaOH溶液5mL。 室温下静置10min，以零号管作对照,于520nm波长处测定各管光吸收值。 向2支试管各加NaOH溶液5mL。 向2支试管各加NaOH溶液5mL。 室温下静置10min，以2号管作对照,于520nm波长处测定1号管光吸收值。 其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与GPT活力的高低成正比关系。 各加入基质液，置37℃恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。 磷酸缓冲液（）
血液中转氨酶活力的测定（分光光度法）
【实验目的】
1.掌握转氨酶活力测定的原理和方法。 2.了解血清谷丙转氨酶活力测定的临床意义。
【实验原理】
测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分 光光度法。血清中的谷-丙转氨（GPT），在 37℃、的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：

3. ALT底物液(含α-酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙氨酸200μmol/ml) 取α-酮戊二 酸29.2mg，DL-丙氨酸7g ,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH调pH至7.4（因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下 降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。
4℃保存。 ⑶将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即
为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4℃保存。
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2. 标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL）
取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为5批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有 超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。
8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本 可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管
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七、酶活性单位的定义
* 1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm
30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。
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六、临床意义
化验介绍:
正常时，谷－丙转氨酶主要存在于组织细胞内，以肝细胞 含量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释放血中。所 以血清中此酶活力很低。
当肝脏、心肌病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内各 种酶释放出来，使血清中此酶活性升高。所以测定血清中此 酶的含量可作为诊断、鉴别诊断及预后观察的依据。
的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。 * 国际单位：在最适温度（25℃）下，1分钟产生1μmol丙酮酸的酶量为1 个活性单位，即1IU=1umol/min。

一、实验目的1. 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用。

2. 学习转氨酶活力测定的原理和方法。

3. 掌握分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力的操作技能。

二、实验原理转氨酶是一种广泛存在于生物体内的氨基转移酶，能催化氨基酸的氨基与酮基酸的酮基互换。

在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。

其中，谷丙转氨酶（ALT）是人体内最重要的转氨酶之一，主要存在于肝脏细胞内。

当肝脏发生病变时，如肝炎、心肌梗死等，血清中ALT活力常显著增加，因此在临床诊断上，ALT活力的测定具有重要的意义。

本实验采用分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力，通过检测ALT催化丙氨酸与酮戊二酸反应生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成的丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，来计算酶的活力。

三、实验材料1. 仪器：分光光度计、离心机、恒温水浴锅、移液器、试管等。

2. 药品与试剂：丙氨酸、酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼、NaOH、标准ALT溶液、血清样本等。

四、实验步骤1. 准备工作：将所有药品与试剂按照实验要求进行配置，确保实验所需的药品与试剂质量合格。

2. 标准曲线制作：将标准ALT溶液按照实验要求进行稀释，制成一系列不同浓度的标准溶液。

分别取等体积的标准溶液和2，4-二硝基苯肼溶液，混合后加入NaOH，进行显色反应。

在560nm波长下，测定吸光度值，以ALT浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 实验测定：取血清样本，按照实验要求进行稀释，分别加入丙氨酸、酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼和NaOH，进行显色反应。

在560nm波长下，测定吸光度值。

4. 数据处理：将实验测定的吸光度值代入标准曲线，计算出血清ALT活力。

五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，线性范围为20～100U。

2. 实验测定：根据实验数据，计算血清ALT活力，结果为X U/L。

3. 结果分析：根据血清ALT活力值，判断肝脏功能是否正常。

血清谷丙转氨酶活力测定目的和要求了解转氨酶的性质及临床意义。

掌握用测定试剂盒方法测定谷丙转氨酶（GPT或ALT）活力。

原理在氨基酸分解代谢中，联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。

此过程可用下式表示：本实验以丙氨酸的氧化脱氨为例，测定谷丙转氨酶活性。

在谷丙转氨酶的催化下，丙氨酸和α–酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。

此反应可逆，平衡点近于1。

无论正向或逆向反应皆可用于测定此酶的活性，既可测定所产生的氨基酸，也可测定生成的α–酮酸，因此可有多种测定方法。

本实验以丙氨酸及α–酮戊二酸作为谷丙转氨酶（GPT或ALT）作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。

丙酮酸能与2，4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸–2，4–二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439～530nm，可用于测定丙酮酸含量。

α–酮戊二酸也能与2，4二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱与丙酮酸二硝基苯稍有差别，在520nm波长比色时，α–酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。

经转氨酶作用后，α–酮戊二酸减少而丙酮酸增加，因此在波长520nm处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α–酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可以籍以测定谷丙转氨酶的活力。

但是，由于在实验中不宜有过多的α–酮戊二酸以降低其对显色的干扰，因此，对于作为底物的α–酮戊二酸浓度作了一定的限制，从而不能保证酶反应充分进行，以致丙酮酸产量与酶之间的关系并不始终成一直线关系。

当酶量增大时，曲线斜率减小。

因此在测定时，如酶活力较大（大于100单位），应将样品稀释后再进行测定。

另外，2，4二硝基苯肼对此显色反应也有一定的干扰，因此，在制作丙酮酸标准曲线时，虽没有加α–酮戊二酸，但是丙酮酸二硝基苯腙的吸光度与丙酮酸含量之间的关系也并不始终呈一直线关系，丙酮酸含量增大时，曲线斜率降低，因此，必须采用标准曲线中呈现出直线关系的部分来测定丙酮酸的生成量。

生物化学实验技术
生物化学实验技术
α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼结合， 生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光 谱与丙酸酮二硝基苯稍有差别，在520m波长 比色时，α-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较 丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。经转 氨基作用后，α-酮戊二酸减少而丙酮酸增加， 因此在波长520m处吸光度增加的程度与反应 体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本上呈 线性关系，故可藉以测定谷丙转氨酶的活力。
3、酮体的测定
（1）另取2只50mL锥形瓶，按下表编号后加 入有关试剂。加完试剂后摇匀，放置10min。
编号
滤液1
I（实验） 2.0 II（对照） --
试剂（mL）
滤液2
0.1mol/L 10%NaO
H2O
碘溶液 H溶液
--
--
3.0
3.0
2.0
--
3.0
3.0
生物化学实验技术
在标准曲线上查出丙酮酸的μmol数（用 1μmol丙酮酸代表1.0单位酶活力），计算每 100mL血清中转氨酶的活力单位数。
混匀后，37℃水浴20min
0.4mol/L NaOH溶液/mL
5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
混匀后，室温放置10min，以0号管作空白，在505nm比色
丙酮酸的μmol数（横坐标） 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
A505nm（纵坐标）
生物化学实验技术
2、另取2支试管，按下表进行操作。
生物化学实验技术
本实验以丙氨酸及α-酮戊二酸作为谷丙转氨酶 （GPT或ALT）作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛 作辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮 酸的量来确定其酶活力。丙酮酸能与2,4-二硝基苯肼 结合，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，后者在碱性溶液 中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439~530nm，可用于 测定丙酮酸含量。

0.5
－
－
－
丙酮酸 0.4
0.1
0.1
50 ug/ ml
－
混匀, 37℃水浴准确保温30min
0.5
0.5
0.5
0.5
谷-丙转氨酶底物液
0.4mol/L NaOH溶液
－
0.5
－
－
混匀, 37℃水浴保温10min
5.0
5.0
5.0
5.0
混匀, 室温静置10min, 520nm比色测吸光度A. 用空白管调零,测定标准管吸光度;用对照管调零,测定测定管吸光度
37℃保温条件下与底物作用30min后，每生成2.5ug的丙酮
酸为1谷-丙转氨酶单位，正常值为2-40单位/ml。
三、实验步骤：
试剂 (ml)
0.1mol/L 磷酸盐缓冲液
谷-丙转氨酶底物液 血清(肝匀浆)
2, 4-二硝基苯肼溶液
取干燥大试管4支，标号
测定管
0.4
对照管
0.4
标准管
0.6
Байду номын сангаас空白管
1.0
A档 拉杆2、3、4档 测吸光度： 标准管、测定管
休息状态：拉杆1档 A=1.-----
四、结果、讨论：
谷丙转氨酶活性单位/每毫升肝匀浆=
m （A测定管 /A标准管 × 标准管中丙酮酸含量）
×1
2.5
0.1
m标准管中丙酮酸含量 = V标准管×C标准管 (0.4 ml × 50 ug/ ml)
五、注意事项：
1 、保温温度和时间要精确， 即谷丙转氨酶发挥催化作用环境
2 、概念：酶活性单位
3、 微量移液器的使用 P4
（1） 套吸头 （2） 吸取溶液： 按到第一档，垂直进入液面（0.5cm）

1
0.5 置于37℃水浴内预热5分钟
2
0.5
人血清
2,4－二硝基苯肼溶液 人血清
0.1
0.5 －
－
0.5 0.1
振摇均匀，置于37℃水浴内继续保温60分钟
氢氧化钠溶液
A520nm
5
5
0
充分摇匀，室温下静置30分钟后，以2号管作空白，520nm处比色
在标准曲线上查出丙酮酸的μ mol数（用1μ mol丙酮酸代表1.0单位酶 活力），计算每100 mL血清中转氨酶的活力单位数。

各管摇匀，置于37℃恒温水浴锅预热5-10分钟 各管摇匀，置于37℃恒温水浴锅加热20分钟
充分摇匀，室温下静置30分钟后，以0号管作空白，520nm处比色
用丙酮酸μ mol数为横坐标，光吸收值A520nm为纵坐标，画出标准曲线。
2．酶活力的测定
取2支干洁试管并标号，用第1号试管做为未知管，第2号试管做为空白对 照管。按下表操作。 试剂（ml） 谷丙转氨酶底物 试 管 号
血液中转氨酶活力的测定（分光光度法）
一、目的 1.了解转氨酶在代谢过程中的重要作用； 2.学习转氨酶活性测定的基本原理和操作方法； 3.了解转氨酶活性测定的临床意义。
二、原理
生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α 氨基酸的α -氨基与α -酮酸的α -酮基互换，在氨基酸的合成 和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用 。 转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草 酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶 （简称谷丙转氨酶）的活力最强。
思考题： 转氨酶在代谢过程中的重要作用及在临床诊断中的意义？
参考答案： 生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α 氨基酸的α -氨基与α -酮酸的α -酮基互换，在氨基酸的合成和 分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。 肝细胞中含转氨酶最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞受损伤 时，转氨酶即大量释放入血液，致使血清中转氨酶活性增高。 测定转氨酶是检查肝功能的重要指标之一。转氨酶显著增高见 于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于 肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于阻塞性 黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发性肌炎亦可引起转氨 酶活性升高。

200 –
50.0 –
200
2000
冷却至室温后，510nm处比色
比色方法：以空白管调零，读取标准管及样品管光密度值。 第五页
（2）计算： 依据朗伯-比尔定律： A=KLC
标准管谷丙转氨酶活力：57U/L
U样=
A样 A标
× U标
样品管光密度值
样品管谷丙转氨酶活力（＝
×57
U/L）
标准管光密度值
第六页
温水浴锅
第四页
四、实验步骤
（1）取3支试管，按下表加入试剂:
试剂
试剂空白管 标准管 样品管
基质液(uL)
200
200
标准液(uL)
–
50.0
血清样品(uL)
–
–
蒸馏水(uL)
50.0
–
混合37℃水浴放置30min显色剂(uFra bibliotek)200
200
37℃水浴放置20min
稀释NaOH(uL)
2000
2000
参考值
谷丙转氨酶
血清参考值：0~ 50U/L
第七页
注意事项
正确使用比色器皿：手拿比色皿的毛面；比 色液应占比色皿的2/3。
每次测定时都需用试剂空白溶液调零，不能用 蒸馏水代替
微量移液枪的正确使用
第八页
（1）丙氨酸+α-酮戊二酸 ALT 丙酮酸+谷氨酸
（2）丙酮酸+2,4-二硝基苯肼
丙酮酸2,4-二硝基苯肼(黄色)
NaOH （3） 丙酮酸2,4-二硝基苯肼
（黄色）
苯腙硝醌化合物 （红棕色）
510nm
相对血清ALT活力
光吸收法测定
第三页