肝脏谷丙转氨酶活力测定

谷丙转氨酶活力测定（改良赖氏法）一，实验目的掌握血清丙氨酸氨基转移酶（ALT ，也称谷丙转氨酶，GPT ）活性测定的原理。

熟悉转氨酶活性测定的操作方法。

了解测定血清丙氨酸氨基转移酶活性的临床意义。

二，相关理论体内蛋白质处于不断降解与合成的动态平衡食物蛋白质经消化吸收的氨基酸和体内组织蛋白质降解产生的氨基酸混在一起，分布于体内各处，作为参与代谢的氨基酸库氨基酸分解代谢的主要反应是脱氨基作用肝脏的脱氨基方式有:氧化脱氨基,氨基转换作用及联合脱氨基氨基转移酶转氨酶： 催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶谷丙转氨酶 glutamic-pyruvic transminase GPT 又称丙氨酸转氨酶alanine aminotransferase ALT三．转氨作用的意义正常时转氨酶主要分布在细胞内，血清中酶活力很低 GOT 以心脏细胞中活力最大，其次为肝脏细胞 GPT 则以肝脏细胞中活力最大谷丙转氨酶的临床意义如果GPT 血清值超过正常上限2－3倍，并持续两周以上，表明有肝胆疾病存在的可能。

参考范围：0-50 U/L ，卡门氏单位0-25 KarU 四．酶活力单位（U ，active unit ）国际单位：61年酶学委员会建议使用统一单位，在特定条件下，1分钟内转化1 μmol底物所需的酶量，称为一个国际单位（IU ，又称U ）1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm ，光径1cm 的条件下，1ml 血清使反应液的吸光度下降0.001的转氨酶活性。

卡门氏单位和国际单位换算1 IU/L ＝2.1 KarU 五，实验原理血清中的丙氨酸转氨酶（ALT ），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。

生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT 活性的高低成正比关系。

血清中谷丙转氨酶活力测定结果血清中谷丙转氨酶（ALT）活力测定是一种常见的实验室检测方法，常用于评估肝功能和诊断肝病。

本文将介绍血清中谷丙转氨酶活力测定结果的相关知识。

血清中谷丙转氨酶活力（ALT）是指血液中存在的一种酶的活性，通常用于评估肝脏功能的状况。

正常情况下，谷丙转氨酶的活力是很低的，一般小于40单位/升。

当肝细胞受损或病变时，会释放ALT，使其活力升高。

高浓度的ALT通常与肝脏病变有关，例如肝炎、肝硬化、脂肪肝、药物性肝病等。

此外，高ALT水平还可能与其他疾病有关，例如急性胰腺炎、心肌梗塞、重型结核等。

因此，如果血清中ALT活力超过正常范围，应及时进行检查和诊断。

血清中ALT测定通常是使用血清学方法进行的。

一般情况下，医师会在胳膊上绑上一条缚带，并在手腕或肘部的静脉内取一小样血液。

样本会送到实验室进行分析。

实验室会使用化学试剂和仪器来测量血清中ALT的活力。

结果会以单位/升（U/L）的形式报告。

正常情况下，成人男性的ALT浓度应在10-40 U/L之间，女性的ALT浓度应在7-35U/L之间。

但这些数值还受到年龄、体重、性别和肝脏状态等因素的影响。

因此，在解读ALT浓度时，医生还需要考虑患者的其他情况。

ALT浓度的升高程度也是确定病情的重要指标之一。

一般来说，当ALT浓度超过正常范围的两倍以上时，就可以诊断为肝炎或其他肝病。

此外，还有一种称为谷草酰转移酶（AST）的酶，也与肝脏有关，但其升高程度不如ALT明显。

需要注意的是，虽然ALT浓度升高可能表明肝脏病变，但不能单独确定肝病的类型和严重程度。

医生还需要进行其他检查和评估，例如肝脏超声、CT扫描、肝组织活检等，以帮助确定具体的病情。

总之，血清中ALT活力测定是一种常见的实验室检测方法，通常用于评估肝脏功能和诊断肝病。

需要注意的是，结果需要结合患者的其他情况进行解读，以便更准确地诊断和治疗肝病。

三、方法和步骤
1、肝匀浆制备：
取新鲜动物肝脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏0.5g， 剪成小块，置于玻璃匀浆管内，加入4.5ml预冷的pH 7.4 0.1 mol/L磷酸缓冲液，制成10%肝匀浆，冰冻保存。
二． 标准曲线的绘制 取6支试管分别用0、1、2、3、5标号，按下表所列次序添加各试剂。 将试管于37℃水浴中保温，平衡管内外温度, 向各管内加0.5ml 2，4—二硝基苯肼后再保温20分钟， 最后分别向各管内加入0.4N NaOH 5毫升， 在室温下静置30分钟后， 以0号管做“空白”用520nm进行比色，读出光吸收值，以丙酮酸的微摩数为横坐标，光吸
202X
实验十七 谷丙转氨酶活性 测定 Exp.17 Activity Determination of Glutamic Pyruvic Transaminase
点击此处添加副标题
演讲人姓名
一、实验原理
氨基移换酶也称转氨酶,为广泛存在于生物机体内的酶，其作用为催化 α-氨基酸的α- 氨基与α- 酮酸的α- 酮基互换。因此在氨基酸的合成 和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的 种类甚多。 任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催 化，它们的最适pH接近7.4。
1 测定管 0.50
2 “空白”对照管 0.50
37℃水浴保温10min，使管内外温度平衡
稀释肝匀浆/ml
0.10
37℃水浴保温30分钟
2,4—二硝基苯肼试剂 /ml
稀释肝匀浆/ml
0.50
0.50 0.10
保温20分钟，冷却
NaOH (0.4N) /ml
5.0
5.0
室温下静置30分钟
A520nm

肝脏谷丙转氨酶活力测定进入实验室要注意的问题安全第一，在实验室中使用挥发性试剂时应在通风橱中进行，以免发生中毒事件；不得在实验室中随意使用明火，因为实验室中有许多易燃易爆药品，使用明火可能引起火灾或引发爆炸事件；不得在实验室吃东西，实验结束后也应将手洗净再吃东西。

在实验室中不得嬉戏打闹，更不得用实验药品互相开玩笑。

实验中使用药品应尽量节约，不得浪费药品，未使用完的药品因倒人废液缸或指定的容器中，切不可倒入原试剂瓶以免污染试剂。

实验完成之前不能离开实验室，如有特殊原因要离开需经实验室负责人批准才能离开。

每个实验台内的各种仪器的摆放顺序要牢记，离开实验室前要将仪器按顺序摆放好。

养成一个好的习惯。

一．实验目的了解转氨酶的性质及临床意义，并掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二．实验原理在氨基酸的分解代谢过程中，联合脱氨基为大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与氧化脱氨基的作用偶联而完成。

本实验以丙氨酸和ā-酮戊二酸作为谷丙转氨酶的作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶，在一定条件及时间作用后来测定所生成的丙酮酸的含量来确定其酶的活力。

丙酮酸能与2，4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸-2，4二硝基苯腙，后者在碱性条件溶液中呈棕色，基吸收光谱的峰为439-530nm，可用于测定丙酮酸的含量。

ā--酮戊二酸与能与2，4二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中的吸收光谱与丙酮酸二硝基苯肼稍有差别，在520nm波长处ā--酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远比丙酮酸2，4二硝基苯腙为低，因此在520nm处吸光度增加的程度与反应体系中的丙酮酸和ā--酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系。

故可籍此可测定谷丙转氨酶的活力。

三、实验器材容量瓶100ml 4个500ml 2个；电子天平；玻璃棒；研钵；试管5支；试管架；移液管0.5ml 2支；1ml 2支；5ml 1支；滴管1支；分光光度计，比色皿4个；四.实验试剂1标准丙酮酸溶液：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于100ml 0.05mol/L H2SO4中，现用现配。

ALT活性单位数=生成丙酮酸的量×10
实验
金氏法测定血清谷丙转氨酶活性
一. 实验目的
1.掌握金氏法测定血清谷丙转氨酶活性的原理 2.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义 3.熟悉实验操作及注意事项，进一步掌握标准曲线
的绘制以及酶活性单位的计算
二. 相关理论知识
酶（enzyme）？
由活细胞合成的能够催化特定化学反 应的蛋白质、RNA或其复合体，绝大 多数酶的化学本质是蛋白质。
0.4 mol/L NaOH溶液
5.0
5.0
混匀，于10 min后30 min内在520nm处比色，以对照管调零，读取测定管吸光度值。
注意事项
1 、加样的时候平行加样，减少操作误差，使得结果更加精 确。 2 、标准丙酮酸溶液的加样一定要准确，减小实验结果误差。 3 、 酶的活力测定与温度、时间影响很大，因此反应要严格 控制温度和掌握时间。 4 、试剂盘中试剂与移液管要专管专用，防止交叉污染。 5、 标准曲线制备及酶活性测定需要在同一台仪器上测定吸 光度。
★6、 样品为小牛血清，参考值：0~1个活性单位
五.实验结果
1.原始数据
金氏法测定血清谷丙转氨酶活性
试管编号 A
23456
测定管
测定人：
波长：
时间：
五.实验结果
2.计算 1）标准曲线绘制
用坐标纸绘制标准曲线； 标明名称、操作人、时间、仪器型号。
操作人： 仪器型号： 波长： 时间：
金氏法测定血清谷丙转氨酶活性
共同点：原理、试剂、操作步骤和作用温度相同。 不同点：在于活性单位定义和标准曲线绘制方法不 同，因此测定结果的单位数值不同。
三.实验原理 金氏法测定血清谷丙转氨酶活性原理

实验教学教案首页氨酶活力测定（验证性）相关知识１．酶的提纯基本操作程序及基本原则２．酶的活力单位（IU）的定义及酶活力的测定（酶的定量测定）３．测定酶活力一般经如下几个步骤①选择适宜的一定浓度的底物。

②确定酶促反应的条件。

优化条件③将一定量的酶液和底物溶液混合，确定反应时间（因要测定酶促反应初速度）。

④反应到一定时间后取出反应液终止反应。

⑤测定产物的生成量。

⑥计算酶活力、酶的比活力。

４．酶的比活力－－表示酶纯度的指标⏹每单位酶蛋白所含的活力单位数。

对固体酶：比活力＝活力单位/mg酶蛋白对液体酶：比活力＝活力单位/ml酶液⏹比活力越大，酶的活力越大，含酶量或有活性的酶量越多。

５．总活力、纯化倍数和回收率６．酶活力测定方法—不同酶选用不同的方法７．氨基酸转氨基作用、联合脱氨基作用８．谷丙转氨酶及临床意义: 查肝功为什么要抽血化验转氨酶指数呢？谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST，GOT）是人体内糖和蛋白质互相转变所需的酶，人再生体内分布广泛。

ALT 的分布以肝中最高，主要存在于肝细胞浆中，AST存在于肝细胞浆和线粒体内。

其次是肾、心、骨骼肌、脾等。

AST的分布则以心肌最高，其次为肝、骨骼肌、肾脏等。

①谷丙转氨酶为细胞内酶，血清中活性很低，各组织器官中以心和肝的活性最高。

当某种原因使细胞膜通过性↑，转氨酶可大量释放入血液，血清中转氨酶活性↑↑。

②抽血化验若转氨酶比正常水平偏高则有可能肝组织受损破裂，肝细胞的转氨酶进入血液。

（结合乙肝抗原等指标进一步确定是什么原因引起的）③常作为疾病诊断、观察疗效和预后的指标：急性肝炎：S-GPT↑↑、S-GOT↑心肌梗塞：S-GOT↑↑一、实验目的１．了解转氨酶的性质及临床意义２．掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二、实验原理联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。

丙氨酸及α－酮戊二酸为谷丙转氨酶的作用底物，利用内源性（肝细胞已有的）磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件下及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定酶活力。

肝脏谷丙转氨酶活力测定
一、实验目的
掌握谷丙转氨酶的测定方法。
二、实验原理
谷丙转氨酶作用于丙氨酸及α-酮戊二酸，生成谷氨酸与丙 酮酸。丙酮酸与2.4-二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙，此 物在碱性溶液呈红棕色，与经同样处理的标准丙酮酸比色， 求得丙酮酸的生成量以表示酶的活性。
C O O H 500：标准丙酮酸浓度 2.
37℃ 水浴5 分钟
0.1
0.1（标准丙酮酸） 0.1
混匀后 37℃水浴 准确保温30分钟
0.1（H2O）
0.5
0.5
0.5
0.5
——
——
0.5
0.5
混匀后 37℃水浴 准确保温20分钟
各加5ml ，混匀，静置10min，读A 520nm 0.000
六. 附注
➢2.4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异 性的，α-酮戌二酸也能与2.4-二硝基苯肼作用而 显色。 ➢2.4-二硝基苯肼身也有类似的颜色，因此空白 管颜色较深。
2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g）
掌握谷丙转氨酶的测定方法。
C H 4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性的，α-酮戌二酸也能与2. 2 2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g） C H 2 C H 3 5μg 丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。
S ×2.
C H N H 新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏） 2 5：谷丙转氨酶换算单位 C O O H 2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g）
四. 实验试剂
1.标准丙酮酸 现配 2.谷丙转氨酶底物 4℃，1周
二硝基苯肼溶液
6.新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏）
五、实验步骤
1.肝匀浆
处理：20g 肝先用生理盐水洗净，滤纸吸干水，再用预冷的0.1M pH7.4 PB捣

ALT(GPT)广泛存在于机体各种组织中，但在肝细胞 中含量最多，当肝脏有病变，特别是急性肝炎及肝细胞坏 死，血清中谷丙转氨酶活性显著升高。在肝癌、肝硬变以 及胆道疾病时，此酶活性也可中度或轻度增高。
如何测定酶的活性? 活性单位定义中必须规定哪些条件?
卡门氏单位的定义为：
在紫外分光光度计中，1ml血清(反应溶液总量为 3ml)在340nm波长下，用内径为1.0cm的比色皿，在 25℃，1分钟内生成的丙酮酸，在乳酸氢酶催化下， 使NADH+H+变成NAD+，使光密度下降0.001为1个 转氨酶活性单位。 丙氨酸 + α-酮戊二酸 GPT 谷氨酸 + 丙酮酸
相当于GPT活性(卡门氏单位) 0.00 28 57 97 150 200
37℃水浴预温5分钟，各管加2,4-二硝基苯肼0.5ml混匀， 再在37℃水浴中放置20分钟后，各管加0.4mol/L NaOH溶 液5ml，混匀放置10分钟后，以蒸馏水调零点，用520nm波 长比色，读取各管光密。.
各管的读数均减去对照管(O管)的光密度，然后以光密度值 为纵坐标，各管相应的转氨酶活性单位为横坐标，绘制标准 曲线。
实验操作
1. 标准曲线的制作:
0
1
2
3
4
5
丙酮酸标准液(ml)
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
ALT底物试剂(ml)
0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25
0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4(ml) 0.10 0.10 0.10 0.10 0.氨酶的测定有何临床意义？
2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要 避免溶血？
5.0
混匀，在室温中放置10分钟，以蒸馏水调零点，用 520nm波长比色，读取光密度。用T-C管的光密度查标准曲 线，即得到待测血清中所含ALT的酶活性。

实验十、血液转氨酶（谷丙转氨酶）活力的测定（实验：肝脏谷丙转氨酶活力测定）（本实验分2个实验完成：一、制作标准曲线二、测酶活力和总结。

或就做二就可以）【目的和要求】1、了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，2、学习转氨酶活力测定的原理和方法。

3、熟悉分光光度计的使用。

【原理】生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。

转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。

它们催化的反应如下。

正常人血清中只含有少量转氨酶。

当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。

测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。

谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。

丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，其吸收光谱的峰为439—530nm，因此在波长520nm处吸光度度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本呈线性关系，故可藉可用分光光度法测定。

从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。

【试剂和器材】一、试剂1.试管及试管架2.吸管3.恒温水浴4.分光光度计5、移液管6、电子天平7、研钵8、容量瓶9、冰箱二、器材1、标准丙酮酸溶液[标准丙酮酸（500μg/ml）]：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于pH7.4 0.1M 的PBS中，定容到100ml。

现用现配。

2、谷丙转氨酶底物：0.90g L-丙氨酸，29.2mg α-酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。

然后用1M NaOH调节pH到7.4，再用pH7.4 0.1mol/L的PBS定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。

实验八 肝脏谷丙转氨酶活力测定实验类型：验证性实验相关知识1. 酶活力：2. 酶活力单位(即酶含量的多少)国际单位 习惯单位：谷丙转氨酶在37度与底物作用30min 后，能产生2.5ug 的丙酮酸者为一个谷丙转氨酶活力单位 3.转氨酶4 谷丙转氨酶一、 实验目的1． 了解转氨酶的性质及临床意义 2． 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二、实验原理丙氨酸及α－酮戊二酸作用为谷丙转氨酶的作用底物，利用内源性磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件下及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定酶活力。

丙酮酸能与2,4－二硝基苯肼结合，生成丙酸－2,4二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439~530nm ，可用于测定丙酮酸的含量。

α－酮戊二酸也能与2,4－二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱为与丙酸－2,4二硝基苯腙的吸光度有差别，在520nm 波长比色时，丙酸－2,4二硝基苯腙吸光度高出3倍。

在520nm 处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α－酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可以测定谷丙转氨酶的活力。

三、实验器材、试剂、材料 1． 新鲜猪猪脏2． 722型分光光度计、剪刀、吸管3． 标准丙酮酸溶液；谷丙转氨酶底物；0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）；0.02%2,4－二硝基苯肼；0.4mol/L NaOH 溶液2 ＋辅基为磷2 2 + + ‘ ‘四、实验操作步聚1.肝匀浆制备（1）将猪肝脏用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏0.25g，剪成小块，置于玻璃匀浆管内（或小研砵中），加入2.25ml预冷的pH7.40.1%mol/L磷酸缓冲液，制成10%肝匀浆。

（每四组1份）（2）吸取肝匀浆0.1ml于另一试管中，加入预冷的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）4.9ml摇匀，为稀释肝匀浆（稀释50倍）（每四组1份）2.谷丙转氨酶活力测定（每组做1份）取试管4支按下表加液五、实验结果与讨论2.每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位（谷丙转氨酶活力计算：规定酶在37度与底物作用30min后，能产生2.5ug的丙酮酸者为一个谷丙转氨酶活力单位）3.每克肝脏谷丙氨酶的活力单位。

在医学实验中，测定血清谷丙转氨酶（AST）活力是一项常见的实验项目。

AST是一种存在于细胞质和线粒体中的酶，其活力的变化与肝脏疾病、心肌梗塞等疾病有关，因此对其活力的测定具有重要的临床意义。

分光光度法是一种常用的测定AST活力的方法，其原理简单、灵敏度高，被广泛应用于实验室教学和临床实验中。

本文将介绍分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力的教学方法及实验原理。

二、实验原理1. 原理概述分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力的原理是通过测定NADH在340nm处的吸光度变化来间接测定AST的活力。

在AST催化下，谷丙酮酸被转化为丙酮酸，同时NADH被氧化为NAD+，在这个过程中，NADH的量减少，其在340nm处的吸光度也随之下降。

通过测定NADH在340nm处的吸光度变化可以间接测定AST的活力。

2. 实验步骤（1）样品制备：将待测血清标本离心沉淀，取清澈液体作为实验样品。

（2）反应体系配置：在离心管中依次加入0.1mol/L磷酸缓冲液、0.1mol/L谷氨酰胺、0.005mol/L的NADH和待测血清标本，将混合液置于37℃水浴中预温。

（3）光度计调零：将光度计调零，设置吸光度波长为340nm。

（4）反应开始：向预温的混合液中加入谷丙酮酸，开始计时测定吸光（5）记录数据：间隔一定时间（例如30秒）记录一次吸光度值，直至吸光度不再发生变化。

三、教学方法1. 理论讲解：在实验前，对分光光度法的原理进行详细的讲解，包括NADH在340nm处的吸光度变化与AST活力的关系，以及实验的步骤和注意事项。

2. 演示操作：老师可以进行实际的操作演示，展示如何配置反应体系、如何操作光度计、如何记录数据等。

3. 学生操作：让学生分组进行实验操作，指导学生合理分配实验任务，注意安全操作，并及时解答学生在实验中遇到的问题。

4. 数据分析：引导学生利用实验数据进行分析，计算得出血清谷丙转氨酶活力的结果，并进行讨论和总结。

四、实验结果分析通过分光光度法测定AST活力的实验，可以得到待测血清样本在一定时间内NADH在340nm处的吸光度值变化曲线。

3. ALT底物液(含α-酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙氨酸200μmol/ml) 取α-酮戊二 酸29.2mg，DL-丙氨酸7g ,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH调pH至7.4（因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下 降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。
4℃保存。 ⑶将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即
为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4℃保存。
精品医学ppt
5
2. 标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL）
取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为5批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有 超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。
8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本 可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管
精品医学ppt
12
七、酶活性单位的定义
* 1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm
30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。
精品医学ppt
13
六、临床意义
化验介绍:
正常时，谷－丙转氨酶主要存在于组织细胞内，以肝细胞 含量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释放血中。所 以血清中此酶活力很低。
当肝脏、心肌病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内各 种酶释放出来，使血清中此酶活性升高。所以测定血清中此 酶的含量可作为诊断、鉴别诊断及预后观察的依据。
的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。 * 国际单位：在最适温度（25℃）下，1分钟产生1μmol丙酮酸的酶量为1 个活性单位，即1IU=1umol/min。

一、实验目的1. 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用。

2. 学习转氨酶活力测定的原理和方法。

3. 掌握分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力的操作技能。

二、实验原理转氨酶是一种广泛存在于生物体内的氨基转移酶，能催化氨基酸的氨基与酮基酸的酮基互换。

在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。

其中，谷丙转氨酶（ALT）是人体内最重要的转氨酶之一，主要存在于肝脏细胞内。

当肝脏发生病变时，如肝炎、心肌梗死等，血清中ALT活力常显著增加，因此在临床诊断上，ALT活力的测定具有重要的意义。

本实验采用分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力，通过检测ALT催化丙氨酸与酮戊二酸反应生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成的丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，来计算酶的活力。

三、实验材料1. 仪器：分光光度计、离心机、恒温水浴锅、移液器、试管等。

2. 药品与试剂：丙氨酸、酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼、NaOH、标准ALT溶液、血清样本等。

四、实验步骤1. 准备工作：将所有药品与试剂按照实验要求进行配置，确保实验所需的药品与试剂质量合格。

2. 标准曲线制作：将标准ALT溶液按照实验要求进行稀释，制成一系列不同浓度的标准溶液。

分别取等体积的标准溶液和2，4-二硝基苯肼溶液，混合后加入NaOH，进行显色反应。

在560nm波长下，测定吸光度值，以ALT浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 实验测定：取血清样本，按照实验要求进行稀释，分别加入丙氨酸、酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼和NaOH，进行显色反应。

在560nm波长下，测定吸光度值。

4. 数据处理：将实验测定的吸光度值代入标准曲线，计算出血清ALT活力。

五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，线性范围为20～100U。

2. 实验测定：根据实验数据，计算血清ALT活力，结果为X U/L。

3. 结果分析：根据血清ALT活力值，判断肝脏功能是否正常。

谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定一、［实验目的］1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用；2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力；3.学习治疗检测SGPT的方法及原理；4. 了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。

二、［仪器与试剂］1.实验材料动物肝脏2.实验试剂(1) 0.9%NaCl 溶液(2)海砂(3)1%谷氨酸溶液(1%KOH溶液中和)(4)1%丙酮酸钠溶液(用1%KOH溶液中和)(5)0.1%KHCO廨液3(6)0.025%—澳乙酸溶液(用1%KOH中和)(7)2%乙酸溶液(8)酚的饱和水溶液：将2份酚和2份水(按重量计算)混合，放入分液漏斗中，振荡。

静止24h以后分层，将下部酚层放入瓶中备用。

新配制的酚展层剂可以反复使用1周。

(9)0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液(10)0.1%标准谷氨酸溶液(11)0.1%标准丙氨酸溶液(12)1%KOH 溶液谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）一、［实验原理］观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。

通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。

为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂澳乙酸。

二、［实验操作］1.谷丙转氨酶提取液制备：2g肝脏+0.9%NaCL 6mL+海砂200mg，在低温下，研磨成浆，用稀薄的脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）。

2.转氨作用沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析3.纸层析操作方法取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆（滤纸不可以折），通过中心将滤纸绘成四等分扇形。

用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm），在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm，取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面，将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触，用大小相同的培养皿盖在滤纸上，溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h），80-100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100℃显色。

2,4一二硝基苯肼 溶液（ml）
血清（ml）
0.5
—— 各管混匀后，置于37℃ 水浴中保温20min
0.5
0.1
0.4 mol/L NaOH 溶液（ml）
5.0
5.0
混匀，10min后，30min内在520nm处比色，以对照管调零，读取测定管吸光度值。
2 标准曲线的制备
取6支试管，编号，按下表3-12步骤操作：
试管编号 吸光度（A） 丙酮酸含量 （ μmol ）
1
2
3
4
5
6
1 标准曲线图绘制
1）用坐标纸绘制标准曲线 2）标明操作人、时间、仪器型号和图表名称
1.标准曲线图绘制
1.标准曲线要过原点 2.注明标准曲线名称:金氏 法测定血清谷丙转氨酶活 性 3.注明横纵坐标的名称及 单位 4.注明分光光度计型号
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
各管混匀后，置于37℃ 水浴中保温20min。 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
混匀，10min后，30min内在520nm处比色。以第1管调零，读取各管吸光度值。
原始数据记录
表1 金氏法测定血清谷丙转氨酶活性
试管编号
对照管
测定管
吸光度 （A）
表2 丙酮酸标准曲线的绘制
转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。 在肝、心、肾等组织中，谷丙转氨酶 （GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活性 均较高。在正常的新陈代谢过程中， 血清内两种酶维持一定水平的转氨酶 活性（即正常值）。
转氨作用的机制：
体内主要两 种转氨酶？
谷草转氨 酶（GOT） 又称天冬 氨酸转氨 酶（AST）
心脏

A.取干净试管6支，编号后按照下表添加试剂。 B.将试管置于37℃水浴中保温10min，然后向每管中加入0.5ml2,4-二 硝基苯肼，再继续保温20min。 C.分别向各管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml，室温下静止10min。 D.用“0”号管作为空白对照，与520nm下测定吸收值。 E.以各管吸收值为纵坐标，丙酮酸的浓度为横坐标做标准曲线。
应
用
• GPT在肝脏中含量最多，当某种药物对肝脏早晨损害或病 毒肝炎的急性阶段，由于肝细胞受损，GPT就释放到血液 中，使血清中此酶水平明显要指标。
实验方法
1.标准曲线的制备
0 2mM丙酮酸标准溶液 （ml） 磷酸缓冲液（ml） GPT底物溶液（ml） 0.00 0.25 0.50 1 0.05 0.20 0.50 2 0.10 0.15 0.50 3 0.15 0.10 0.50 4 0.20 0.05 0.50 5 0.25 0.00 0.50
2、严格按照实验步骤进行，温度和时间均要严格控制。
2.GPT活性的测定：取干净试管4支，按照下表添加试剂。
试剂
鱼肌肉匀浆液（ml） GPT底物溶液（ml）
测定1
0.25 0.50
对照1
0.25
测定2
0.25 0.50
对照2
0.25
37 ℃水浴加热30min（转氨基反应） 2,4-二硝基苯肼（ml） GPT底物溶液（ml） 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
37 ℃水浴加热20min（丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应） 0.4mol/L氢氧化钠溶液 （ml） 5.00 5.00 5.00 5.00
各管反应完成后混匀，室温静止10min后，以对照管1或者对照2调 节零点，测定1和2号管的吸收值。

血清谷丙转氨酶活力测定实验目的1、学习测定谷丙转氨酶活性的原理。

2、掌握分光光度法定量测定技术。

实验原理转氨酶又叫氨基转氨酶，它催化转氨基反应。

转氨酶在氨基酸的分解、合成及三大物质的相互联系、相互转化上起很重要的作用。

转氨酶种类很多，在动物的心、脑、肾、肝细胞中含量很高，在植物和微生物中分布也很广，其中以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）活力最强，GPT在肝细胞中含量最丰富，它催化a-酮戊二酸和L-丙氨酸反应生成L-谷氨酸和丙氨酸。

正常人的血清GPT含量很少，活性很低，但当肝细胞受损时（如肝炎等病变），酶从肝细胞释放到血液中，使血清中的GPT活性显著增高。

测定GPT是临床上检查肝功能是否正常的重要指标之一。

GPT作用于L-丙氨酸和a-酮戊二酸后生成的一种产物——丙酮酸可与2，4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙。

2,4-二硝基苯腙在碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用分光光度法进行丙酮酸定量测定。

因此在一定的条件下，可进行GPT活力的测定并计算出血清中GPT的活力单位数。

实验器材和试剂1、器材试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、721型分光光度计、坐标纸、新鲜人血清。

2、试剂0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）、2μmol/L丙酮酸钠标准液、GPT底物液、2，4–二硝基苯肼液、0.4mol/L NaOH溶液。

实验步骤1、标准曲线制作（1）.取试管6支，标号，进行操作。

试剂/试管编号0 1 2 3 4 5V(0.1mol/L磷酸缓冲液)ml 0.10 0.10 O.10 0.10 0.10 0.10 V（GPT底物液）/ml 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25V（丙酮酸钠标准液）/ml 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25相当于丙酮酸实际含量/μmol 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5（2）混匀后，置37℃水浴预温5分钟，再分别加入2，4–二硝基苯肼液0.5ml，混匀，保温20分钟，各加入0.4mol/L NaOH 5ml，混匀继续保温10分钟，取出，冷至室温。