实验六肝脏谷丙转氨酶活力测定

一、实验目的1. 了解转氨酶在生物体内的作用及其在临床诊断中的重要性。

2. 学习并掌握转氨酶活力测定的原理和方法。

3. 通过实验操作，提高对实验仪器的操作技能。

二、实验原理转氨酶（Transaminase）是一类催化氨基酸与α-酮酸之间氨基转移反应的酶，广泛存在于生物体内。

在人体内，转氨酶主要存在于肝脏、心肌、骨骼肌等组织中，其中以谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）最为重要。

ALT和AST活性的测定在临床上具有重要的诊断价值，可作为肝功能异常、心肌梗死等疾病的辅助诊断指标。

本实验采用分光光度法测定ALT活力。

ALT催化L-丙氨酸与α-酮戊二酸之间的转氨反应，生成L-谷氨酸和丙酮酸。

丙酮酸与2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）反应，生成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙（PNP）。

PNP在碱性条件下呈棕色，其最大吸收峰在520nm处，通过测定520nm处的吸光度，可以计算出ALT的活力。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡肝- 0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）- 0.1mol/L丙氨酸- 0.1mol/Lα-酮戊二酸- 2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）- 30%氢氧化钠溶液- 碘化钾溶液- 硫代硫酸钠溶液- 酶活力测定试剂盒2. 实验仪器：- 酶标仪- 电子天平- 移液器- 离心机- 恒温水浴箱- 试管四、实验步骤1. 样品制备：将鸡肝剪碎，加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），匀浆，离心取上清液。

2. 标准曲线绘制：配制一系列不同浓度的丙酮酸标准溶液，加入2，4-DNPH和30%氢氧化钠溶液，在520nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

3. 样品测定：将样品溶液、底物溶液、2，4-DNPH和30%氢氧化钠溶液加入试管，混匀，在520nm处测定吸光度。

4. 数据处理：根据标准曲线，计算样品中ALT的活力。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：在520nm处，吸光度与丙酮酸浓度呈线性关系。

谷丙转氨酶活力测定（改良赖氏法）一，实验目的掌握血清丙氨酸氨基转移酶（ALT ，也称谷丙转氨酶，GPT ）活性测定的原理。

熟悉转氨酶活性测定的操作方法。

了解测定血清丙氨酸氨基转移酶活性的临床意义。

二，相关理论体内蛋白质处于不断降解与合成的动态平衡食物蛋白质经消化吸收的氨基酸和体内组织蛋白质降解产生的氨基酸混在一起，分布于体内各处，作为参与代谢的氨基酸库氨基酸分解代谢的主要反应是脱氨基作用肝脏的脱氨基方式有:氧化脱氨基,氨基转换作用及联合脱氨基氨基转移酶转氨酶： 催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶谷丙转氨酶 glutamic-pyruvic transminase GPT 又称丙氨酸转氨酶alanine aminotransferase ALT三．转氨作用的意义正常时转氨酶主要分布在细胞内，血清中酶活力很低 GOT 以心脏细胞中活力最大，其次为肝脏细胞 GPT 则以肝脏细胞中活力最大谷丙转氨酶的临床意义如果GPT 血清值超过正常上限2－3倍，并持续两周以上，表明有肝胆疾病存在的可能。

参考范围：0-50 U/L ，卡门氏单位0-25 KarU 四．酶活力单位（U ，active unit ）国际单位：61年酶学委员会建议使用统一单位，在特定条件下，1分钟内转化1 μmol底物所需的酶量，称为一个国际单位（IU ，又称U ）1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm ，光径1cm 的条件下，1ml 血清使反应液的吸光度下降0.001的转氨酶活性。

卡门氏单位和国际单位换算1 IU/L ＝2.1 KarU 五，实验原理血清中的丙氨酸转氨酶（ALT ），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。

生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT 活性的高低成正比关系。

血清中谷丙转氨酶活力测定结果血清中谷丙转氨酶（ALT）活力测定是一种常见的实验室检测方法，常用于评估肝功能和诊断肝病。

本文将介绍血清中谷丙转氨酶活力测定结果的相关知识。

血清中谷丙转氨酶活力（ALT）是指血液中存在的一种酶的活性，通常用于评估肝脏功能的状况。

正常情况下，谷丙转氨酶的活力是很低的，一般小于40单位/升。

当肝细胞受损或病变时，会释放ALT，使其活力升高。

高浓度的ALT通常与肝脏病变有关，例如肝炎、肝硬化、脂肪肝、药物性肝病等。

此外，高ALT水平还可能与其他疾病有关，例如急性胰腺炎、心肌梗塞、重型结核等。

因此，如果血清中ALT活力超过正常范围，应及时进行检查和诊断。

血清中ALT测定通常是使用血清学方法进行的。

一般情况下，医师会在胳膊上绑上一条缚带，并在手腕或肘部的静脉内取一小样血液。

样本会送到实验室进行分析。

实验室会使用化学试剂和仪器来测量血清中ALT的活力。

结果会以单位/升（U/L）的形式报告。

正常情况下，成人男性的ALT浓度应在10-40 U/L之间，女性的ALT浓度应在7-35U/L之间。

但这些数值还受到年龄、体重、性别和肝脏状态等因素的影响。

因此，在解读ALT浓度时，医生还需要考虑患者的其他情况。

ALT浓度的升高程度也是确定病情的重要指标之一。

一般来说，当ALT浓度超过正常范围的两倍以上时，就可以诊断为肝炎或其他肝病。

此外，还有一种称为谷草酰转移酶（AST）的酶，也与肝脏有关，但其升高程度不如ALT明显。

需要注意的是，虽然ALT浓度升高可能表明肝脏病变，但不能单独确定肝病的类型和严重程度。

医生还需要进行其他检查和评估，例如肝脏超声、CT扫描、肝组织活检等，以帮助确定具体的病情。

总之，血清中ALT活力测定是一种常见的实验室检测方法，通常用于评估肝脏功能和诊断肝病。

需要注意的是，结果需要结合患者的其他情况进行解读，以便更准确地诊断和治疗肝病。

（2）样品测定
取2支试管，标记，按下表依次加入试剂。
管号 血清/mL 基质液/mL
2，4-二硝基苯肼/mL
基质液/mL NaOH溶液/mL
对照管 0.10 ——
混匀，37℃水浴30min 0.50
混匀，37℃水浴20min 0.50 5.00
混匀，室温放置10min
测定管 0.10 0.50
0.50
—— 5.00
在505nm波长下用对照管调零，读取测定管的吸光度值， 对照标准曲线求得ALT相应的酶活力单位。
【临床意义】
肝细胞中ALT含量最丰富，，当肝脏疾病导致肝细胞损伤后， ALT即大量释放进入血液中，导致血清中ALT活性明显增高。 故测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。 ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死； 中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞； 轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、
实验六
【实验目的】
掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理及操作； 熟悉ALT标准曲线的绘制； 熟悉酶活力概念； 了解赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的评价
【实验原理】
赖氏法：
在37℃、pH7.4的条件下，以丙氨酸和ɑ-酮戊二酸为底物，ALT 催化生成丙酮酸和谷氨酸；丙酮酸产量的多少，即反应酶活性 的大小；
试管和试管架
【实验方法】
（1试剂。
管号
空白管
1
2
3
4
5
丙酮酸标准液/mL
0
0.05 0.10
0.15
0.20
0.25
基质液/mL
0.50
0.45 0.40
0.35
0.30

肝脏谷丙转氨酶活力测定
一、实验目的
掌握谷丙转氨酶的测定方法。
二、实验原理
谷丙转氨酶作用于丙氨酸及α-酮戊二酸，生成谷氨酸与丙 酮酸。丙酮酸与2.4-二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙，此 物在碱性溶液呈红棕色，与经同样处理的标准丙酮酸比色， 求得丙酮酸的生成量以表示酶的活性。
C O O H 500：标准丙酮酸浓度 2.
37℃ 水浴5 分钟
0.1
0.1（标准丙酮酸） 0.1
混匀后 37℃水浴 准确保温30分钟
0.1（H2O）
0.5
0.5
0.5
0.5
——
——
0.5
0.5
混匀后 37℃水浴 准确保温20分钟
各加5ml ，混匀，静置10min，读A 520nm 0.000
六. 附注
➢2.4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异 性的，α-酮戌二酸也能与2.4-二硝基苯肼作用而 显色。 ➢2.4-二硝基苯肼身也有类似的颜色，因此空白 管颜色较深。
2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g）
掌握谷丙转氨酶的测定方法。
C H 4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性的，α-酮戌二酸也能与2. 2 2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g） C H 2 C H 3 5μg 丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。
S ×2.
C H N H 新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏） 2 5：谷丙转氨酶换算单位 C O O H 2）每g 肝脏谷丙转氨酶活力单位（U/g）
四. 实验试剂
1.标准丙酮酸 现配 2.谷丙转氨酶底物 4℃，1周
二硝基苯肼溶液
6.新鲜肝脏（购买或取活的小白鼠肝脏）
五、实验步骤
1.肝匀浆
处理：20g 肝先用生理盐水洗净，滤纸吸干水，再用预冷的0.1M pH7.4 PB捣

测定转氨酶活力的实验报告测定转氨酶活力的实验报告引言：转氨酶是一类重要的酶，广泛存在于生物体内，参与多种生物化学反应。

通过测定转氨酶的活力，可以了解生物体内的代谢情况，对疾病的诊断和治疗具有重要意义。

本实验旨在通过测定转氨酶的活力，探究其在生物体内的作用及其相关机制。

材料与方法：1. 实验动物：选取健康的小鼠作为实验对象。

2. 试剂：包括转氨酶检测试剂盒、生理盐水、麻醉剂等。

3. 仪器：分光光度计、离心机等。

实验步骤：1. 将小鼠随机分为实验组和对照组，每组10只。

2. 实验组小鼠经过麻醉后，采集血液样本，离心分离血清。

3. 对照组小鼠同样采集血液样本，离心分离血清。

4. 使用转氨酶检测试剂盒，按照说明书进行操作，测定血清中转氨酶的活力。

5. 使用分光光度计，测定各组样本的吸光度值，并计算相应的转氨酶活力。

6. 对实验结果进行统计学分析。

实验结果：实验组小鼠的转氨酶活力明显高于对照组小鼠。

经过统计学分析，两组之间的差异具有显著性。

讨论：转氨酶活力的测定结果表明，在实验组小鼠中，转氨酶的活力明显增强。

这可能是由于实验组小鼠受到了某种刺激，导致转氨酶的合成和释放增加。

转氨酶在生物体内参与氨基酸代谢和脂肪酸代谢等重要过程，其活力的增强可能与这些代谢通路的活跃有关。

转氨酶活力的测定对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。

例如，肝功能异常常常伴随着转氨酶活力的改变。

通过测定转氨酶活力，可以及早发现肝脏疾病，并进行相应的治疗。

此外，转氨酶活力的测定还可以用于评估药物的肝毒性，指导药物的使用和剂量调整。

然而，需要注意的是，转氨酶活力的测定结果受到多种因素的影响。

例如，实验条件的控制、样本的保存和处理等都可能对结果产生影响。

因此，在进行转氨酶活力的测定时，需要严格控制实验条件，并进行多次重复实验，以确保结果的准确性和可靠性。

结论：通过测定转氨酶的活力，我们可以了解生物体内的代谢情况，并对疾病的诊断和治疗提供重要参考。

肝脏谷丙转氨酶活力测定进入实验室要注意的问题安全第一，在实验室中使用挥发性试剂时应在通风橱中进行，以免发生中毒事件；不得在实验室中随意使用明火，因为实验室中有许多易燃易爆药品，使用明火可能引起火灾或引发爆炸事件；不得在实验室吃东西，实验结束后也应将手洗净再吃东西。

在实验室中不得嬉戏打闹，更不得用实验药品互相开玩笑。

实验中使用药品应尽量节约，不得浪费药品，未使用完的药品因倒人废液缸或指定的容器中，切不可倒入原试剂瓶以免污染试剂。

实验完成之前不能离开实验室，如有特殊原因要离开需经实验室负责人批准才能离开。

每个实验台内的各种仪器的摆放顺序要牢记，离开实验室前要将仪器按顺序摆放好。

养成一个好的习惯。

一．实验目的了解转氨酶的性质及临床意义，并掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二．实验原理在氨基酸的分解代谢过程中，联合脱氨基为大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与氧化脱氨基的作用偶联而完成。

本实验以丙氨酸和ā-酮戊二酸作为谷丙转氨酶的作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶，在一定条件及时间作用后来测定所生成的丙酮酸的含量来确定其酶的活力。

丙酮酸能与2，4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸-2，4二硝基苯腙，后者在碱性条件溶液中呈棕色，基吸收光谱的峰为439-530nm，可用于测定丙酮酸的含量。

ā--酮戊二酸与能与2，4二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中的吸收光谱与丙酮酸二硝基苯肼稍有差别，在520nm波长处ā--酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远比丙酮酸2，4二硝基苯腙为低，因此在520nm处吸光度增加的程度与反应体系中的丙酮酸和ā--酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系。

故可籍此可测定谷丙转氨酶的活力。

三、实验器材容量瓶100ml 4个500ml 2个；电子天平；玻璃棒；研钵；试管5支；试管架；移液管0.5ml 2支；1ml 2支；5ml 1支；滴管1支；分光光度计，比色皿4个；四.实验试剂1标准丙酮酸溶液：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于100ml 0.05mol/L H2SO4中，现用现配。

将试管于37℃水浴中保温，平衡管内外温度, 向各管内加0.5ml 2，4—二硝基苯肼后再保 温20分钟，
最后分别向各管内加入0.4N NaOH 5毫升，
在室温下静置30分钟后，
以0号管做“空白”用520nm进行比色，读出 光吸收值，以丙酮酸的微摩数为横坐标，光吸收 值为纵坐标，画出标准曲线。
表1.丙酮酸钠标准曲线的绘制
在各种转氨酶中，谷氨酸-草酰乙酸转氨酶 （简称谷草转氨酶）及谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简 称谷丙转氨酶）活力最强。
上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内， 在正常人血清中也有少量，机体发生肝炎。心肌 梗塞等病变时，血清中转氨酶活力显著增加，所 以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 它们的催化反应如下：
试剂
管号 0
1
2
3
4
5
丙酮酸钠标准液/ml 0.00
0.05
0.10 0.15 0.20 0.25
谷丙转氨酶底物/ml 0.50
0.45
0.40 0.35 0.30 0.25
磷酸缓冲溶液 0.10
0.10
0.10 0.10 0.10 0.10
(0.1M pH7.4) /ml
37℃水浴中保温， 平衡管 内外温 度
本方法中用分光光度法，根据硝基苯腙的生成 量可以计算酶的活力。
→
二、实验用品
1、材料 新鲜动物肝匀浆。
2、试剂 （1）0.1M磷酸缓冲液（pH=7.4）
取0.1M KH2PO4液50ml，0.1N NaOH液39.3ml， 再加蒸馏水10.7ml，混匀即得。 （2）丙酮酸钠标准液（2.0微克分子/ml）：
取A·R丙酮酸钠11mg溶解于50ml 0.1M磷酸缓冲液 内（宜当日新配）。

血清谷丙转氨酶活力测定目的和要求了解转氨酶的性质及临床意义。

掌握用测定试剂盒方法测定谷丙转氨酶（GP T或ALT）活力。

原理在氨基酸分解代谢中，联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。

此过程可用下式表示：本实验以丙氨酸的氧化脱氨为例，测定谷丙转氨酶活性。

在谷丙转氨酶的催化下，丙氨酸和α–酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。

此反应可逆，平衡点近于1。

无论正向或逆向反应皆可用于测定此酶的活性，既可测定所产生的氨基酸，也可测定生成的α–酮酸，因此可有多种测定方法。

本实验以丙氨酸及α–酮戊二酸作为谷丙转氨酶（GP T或ALT）作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。

丙酮酸能与2，4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸–2，4–二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439～530nm，可用于测定丙酮酸含量。

α–酮戊二酸也能与2，4二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱与丙酮酸二硝基苯稍有差别，在520nm波长比色时，α–酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。

经转氨酶作用后，α–酮戊二酸减少而丙酮酸增加，因此在波长520nm处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α–酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可以籍以测定谷丙转氨酶的活力。

但是，由于在实验中不宜有过多的α–酮戊二酸以降低其对显色的干扰，因此，对于作为底物的α–酮戊二酸浓度作了一定的限制，从而不能保证酶反应充分进行，以致丙酮酸产量与酶之间的关系并不始终成一直线关系。

当酶量增大时，曲线斜率减小。

因此在测定时，如酶活力较大（大于100单位），应将样品稀释后再进行测定。

另外，2，4二硝基苯肼对此显色反应也有一定的干扰，因此，在制作丙酮酸标准曲线时，虽没有加α–酮戊二酸，但是丙酮酸二硝基苯腙的吸光度与丙酮酸含量之间的关系也并不始终呈一直线关系，丙酮酸含量增大时，曲线斜率降低，因此，必须采用标准曲线中呈现出直线关系的部分来测定丙酮酸的生成量。

实验教学教案首页肝脏谷丙转氨酶活力测定（验证性）相关知识１．酶的提纯基本操作程序及基本原则２．酶的活力单位（IU）的定义及酶活力的测定（酶的定量测定）３．测定酶活力一般经如下几个步骤①选择适宜的一定浓度的底物。

②确定酶促反应的条件。

优化条件③将一定量的酶液和底物溶液混合，确定反应时间（因要测定酶促反应初速度）。

④反应到一定时间后取出反应液终止反应。

⑤测定产物的生成量。

⑥计算酶活力、酶的比活力。

４．酶的比活力－－表示酶纯度的指标⏹每单位酶蛋白所含的活力单位数。

对固体酶：比活力＝活力单位/mg酶蛋白对液体酶：比活力＝活力单位/ml酶液⏹比活力越大，酶的活力越大，含酶量或有活性的酶量越多。

５．总活力、纯化倍数和回收率６．酶活力测定方法—不同酶选用不同的方法７．氨基酸转氨基作用、联合脱氨基作用８．谷丙转氨酶及临床意义: 查肝功为什么要抽血化验转氨酶指数呢？谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST，GOT）是人体内糖和蛋白质互相转变所需的酶，人再生体内分布广泛。

ALT的分布以肝中最高，主要存在于肝细胞浆中，AST存在于肝细胞浆和线粒体内。

其次是肾、心、骨骼肌、脾等。

AST的分布则以心肌最高，其次为肝、骨骼肌、肾脏等。

①谷丙转氨酶为细胞内酶，血清中活性很低，各组织器官中以心和肝的活性最高。

当某种原因使细胞膜通过性↑，转氨酶可大量释放入血液，血清中转氨酶活性↑↑。

②抽血化验若转氨酶比正常水平偏高则有可能肝组织受损破裂，肝细胞的转氨酶进入血液。

（结合乙肝抗原等指标进一步确定是什么原因引起的）③常作为疾病诊断、观察疗效和预后的指标：急性肝炎：S-GPT↑↑、S-GOT↑心肌梗塞：S-GOT↑↑一、实验目的１．了解转氨酶的性质及临床意义 ２．掌握谷丙转氨酶活力的测定方法 二、实验原理联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。

丙氨酸及α－酮戊二酸为谷丙转氨酶的作用底物，利用内源性（肝细胞已有的）磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件下及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定酶活力。

谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定一、[实验目的]1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用；2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力；3.学习治疗检测SGPT的方法及原理；4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。

二、[仪器与试剂]1．实验材料动物肝脏2．实验试剂（1）0.9%NaCl溶液（2）海砂（3）1%谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和）（4）1%丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和）（5）0.1%KHCO3溶液（6）0.025%一溴乙酸溶液（用1%KOH中和）（7）2%乙酸溶液（8）酚的饱和水溶液：将2份酚和2份水（按重量计算）混合，放入分液漏斗中，振荡。

静止24h以后分层，将下部酚层放入瓶中备用。

新配制的酚展层剂可以反复使用1周。

（9）0.1%水合茚三酮的正丁醇溶液（10）0.1%标准谷氨酸溶液（11）0.1%标准丙氨酸溶液（12）1%KOH溶液谷丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）一、[实验原理]观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反应。

通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。

为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。

二、[实验操作]1.谷丙转氨酶提取液制备：2g肝脏+0.9%NaCL 6mL+海砂 200mg，在低温下，研磨成浆，用稀薄的脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）。

2.转氨作用取试管2支，按下表加入试剂，加入试剂的单位为mL加脱脂棉塞，45℃水浴，1.5h，时时振荡内容物沸水浴2min，使蛋白质完全沉下，过滤，作层析3.纸层析操作方法取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆（滤纸不可以折），通过中心将滤纸绘成四等分扇形。

用毛细管点样2-4次（直径不超过2mm），在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1-2mm，取一小滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面，将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触，用大小相同的培养皿盖在滤纸上，溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h），80-100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80-100℃显色。

在医学实验中，测定血清谷丙转氨酶（AST）活力是一项常见的实验项目。

AST是一种存在于细胞质和线粒体中的酶，其活力的变化与肝脏疾病、心肌梗塞等疾病有关，因此对其活力的测定具有重要的临床意义。

分光光度法是一种常用的测定AST活力的方法，其原理简单、灵敏度高，被广泛应用于实验室教学和临床实验中。

本文将介绍分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力的教学方法及实验原理。

二、实验原理1. 原理概述分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力的原理是通过测定NADH在340nm处的吸光度变化来间接测定AST的活力。

在AST催化下，谷丙酮酸被转化为丙酮酸，同时NADH被氧化为NAD+，在这个过程中，NADH的量减少，其在340nm处的吸光度也随之下降。

通过测定NADH在340nm处的吸光度变化可以间接测定AST的活力。

2. 实验步骤（1）样品制备：将待测血清标本离心沉淀，取清澈液体作为实验样品。

（2）反应体系配置：在离心管中依次加入0.1mol/L磷酸缓冲液、0.1mol/L谷氨酰胺、0.005mol/L的NADH和待测血清标本，将混合液置于37℃水浴中预温。

（3）光度计调零：将光度计调零，设置吸光度波长为340nm。

（4）反应开始：向预温的混合液中加入谷丙酮酸，开始计时测定吸光（5）记录数据：间隔一定时间（例如30秒）记录一次吸光度值，直至吸光度不再发生变化。

三、教学方法1. 理论讲解：在实验前，对分光光度法的原理进行详细的讲解，包括NADH在340nm处的吸光度变化与AST活力的关系，以及实验的步骤和注意事项。

2. 演示操作：老师可以进行实际的操作演示，展示如何配置反应体系、如何操作光度计、如何记录数据等。

3. 学生操作：让学生分组进行实验操作，指导学生合理分配实验任务，注意安全操作，并及时解答学生在实验中遇到的问题。

4. 数据分析：引导学生利用实验数据进行分析，计算得出血清谷丙转氨酶活力的结果，并进行讨论和总结。

四、实验结果分析通过分光光度法测定AST活力的实验，可以得到待测血清样本在一定时间内NADH在340nm处的吸光度值变化曲线。

3. ALT底物液(含α-酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙氨酸200μmol/ml) 取α-酮戊二 酸29.2mg，DL-丙氨酸7g ,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol /L NaOH调pH至7.4（因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下 降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。
4℃保存。 ⑶将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即
为0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4℃保存。
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2. 标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL）
取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为5批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有 超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。
8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本 可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管
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七、酶活性单位的定义
* 1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm
30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。
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六、临床意义
化验介绍:
正常时，谷－丙转氨酶主要存在于组织细胞内，以肝细胞 含量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释放血中。所 以血清中此酶活力很低。
当肝脏、心肌病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内各 种酶释放出来，使血清中此酶活性升高。所以测定血清中此 酶的含量可作为诊断、鉴别诊断及预后观察的依据。
的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。 * 国际单位：在最适温度（25℃）下，1分钟产生1μmol丙酮酸的酶量为1 个活性单位，即1IU=1umol/min。

一、实验目的1. 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用。

2. 学习转氨酶活力测定的原理和方法。

3. 掌握分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力的操作技能。

二、实验原理转氨酶是一种广泛存在于生物体内的氨基转移酶，能催化氨基酸的氨基与酮基酸的酮基互换。

在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。

其中，谷丙转氨酶（ALT）是人体内最重要的转氨酶之一，主要存在于肝脏细胞内。

当肝脏发生病变时，如肝炎、心肌梗死等，血清中ALT活力常显著增加，因此在临床诊断上，ALT活力的测定具有重要的意义。

本实验采用分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力，通过检测ALT催化丙氨酸与酮戊二酸反应生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成的丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，来计算酶的活力。

三、实验材料1. 仪器：分光光度计、离心机、恒温水浴锅、移液器、试管等。

2. 药品与试剂：丙氨酸、酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼、NaOH、标准ALT溶液、血清样本等。

四、实验步骤1. 准备工作：将所有药品与试剂按照实验要求进行配置，确保实验所需的药品与试剂质量合格。

2. 标准曲线制作：将标准ALT溶液按照实验要求进行稀释，制成一系列不同浓度的标准溶液。

分别取等体积的标准溶液和2，4-二硝基苯肼溶液，混合后加入NaOH，进行显色反应。

在560nm波长下，测定吸光度值，以ALT浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 实验测定：取血清样本，按照实验要求进行稀释，分别加入丙氨酸、酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼和NaOH，进行显色反应。

在560nm波长下，测定吸光度值。

4. 数据处理：将实验测定的吸光度值代入标准曲线，计算出血清ALT活力。

五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，线性范围为20～100U。

2. 实验测定：根据实验数据，计算血清ALT活力，结果为X U/L。

3. 结果分析：根据血清ALT活力值，判断肝脏功能是否正常。

血清谷丙转氨酶活力测定实验目的1、学习测定谷丙转氨酶活性的原理。

2、掌握分光光度法定量测定技术。

实验原理转氨酶又叫氨基转氨酶，它催化转氨基反应。

转氨酶在氨基酸的分解、合成及三大物质的相互联系、相互转化上起很重要的作用。

转氨酶种类很多，在动物的心、脑、肾、肝细胞中含量很高，在植物和微生物中分布也很广，其中以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）活力最强，GPT在肝细胞中含量最丰富，它催化a-酮戊二酸和L-丙氨酸反应生成L-谷氨酸和丙氨酸。

正常人的血清GPT含量很少，活性很低，但当肝细胞受损时（如肝炎等病变），酶从肝细胞释放到血液中，使血清中的GPT活性显著增高。

测定GPT是临床上检查肝功能是否正常的重要指标之一。

GPT作用于L-丙氨酸和a-酮戊二酸后生成的一种产物——丙酮酸可与2，4-二硝基苯肼反应生成2,4-二硝基苯腙。

2,4-二硝基苯腙在碱性条件下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比，可用分光光度法进行丙酮酸定量测定。

因此在一定的条件下，可进行GPT活力的测定并计算出血清中GPT的活力单位数。

实验器材和试剂1、器材试管及试管架、移液器或吸量管、恒温水浴锅、721型分光光度计、坐标纸、新鲜人血清。

2、试剂0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）、2μmol/L丙酮酸钠标准液、GPT底物液、2，4–二硝基苯肼液、0.4mol/L NaOH溶液。

实验步骤1、标准曲线制作（1）.取试管6支，标号，进行操作。

试剂/试管编号0 1 2 3 4 5V(0.1mol/L磷酸缓冲液)ml 0.10 0.10 O.10 0.10 0.10 0.10 V（GPT底物液）/ml 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25V（丙酮酸钠标准液）/ml 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25相当于丙酮酸实际含量/μmol 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5（2）混匀后，置37℃水浴预温5分钟，再分别加入2，4–二硝基苯肼液0.5ml，混匀，保温20分钟，各加入0.4mol/L NaOH 5ml，混匀继续保温10分钟，取出，冷至室温。

4．加入2,4-二硝基苯肼溶液后需充分 ．加入 二硝基苯肼溶液后需充分 振荡混匀，否则会影响重复性； 振荡混匀，否则会影响重复性；加氢氧化 钠溶液方法要一致 方法要一致， 钠溶液方法要一致，不同方法也会导致吸 光度读数的差异。 光度读数的差异。 5．基质缓冲液和 2,4-二硝基苯肼溶液 ． 二硝基苯肼溶液 配制必须准确， 配制必须准确，每次测定时空白管吸光度 上下波动不应超过0.015，如超出此范围应 上下波动不应超过 ， 检查试剂及仪器等方面的问题。 检查试剂及仪器等方面的问题。
二、ALT催化的化学反应: ALT催化的化学反应 催化的化学反应:
反应式
大多数氨基酸可参与转氨基作用， 大多数氨基酸可参与转氨基作用，但赖 氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸除外。 氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸除外。
丙氨酸 +α-酮戊二酸
ALT
丙酮酸 + 谷氨酸
三、ALT的分布: ALT的分布 的分布:
主要分布于肝、肾细胞、心肌细胞等， 主要分布于肝、肾细胞、心肌细胞等，血 清中的含量很低。 清中的含量很低。 病变时，细胞受损，血清ALT含量升高。 ALT含量升高 病变时，细胞受损，血清ALT含量升高。
2,4-二硝基苯肼溶液0.5 ml，混匀，37℃ 20min； 各管加 2,4-二硝基苯肼溶液0.5 ml，混匀，37℃水浴 20min； NaOH溶液 溶液5.0 ml，混匀，室温放置10min 10min。 各管加 0.4 mol/L NaOH溶液5.0 ml，混匀，室温放置10min。
波长505 nm处比色 处比色， 蒸馏水调零点 读取各管吸光度； 调零点， 波长50； 各管读数均减去0号管吸光度 吸光度， 各管读数均减去0号管吸光度，所得差值与对应的卡门氏酶活性 单位作图即成标准曲线。 单位作图即成标准曲线。