东师实验4谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定

血清谷丙转氨酶的测定实验报告血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）是一种重要的肝脏酶，其测定可以用于评估肝功能和诊断肝脏疾病。

本实验旨在通过测定血清中ALT的活性，探究其在肝功能评估中的应用。

实验材料与方法。

1. 实验材料，实验所需材料包括ALT检测试剂盒、标准品、血清标本、比色皿、移液管等。

2. 实验方法：a. 样本处理，将采集的血清标本离心，取上清液置于4℃保存。

b. 实验操作，按照ALT检测试剂盒说明书进行操作，制备标准曲线和待测样本的反应体系。

c. 光度测定，使用分光光度计测定各标准品和待测样本的吸光度值。

d. 计算ALT活性，根据标准曲线计算待测样本中ALT的活性。

实验结果与分析。

经过实验测定，得到不同浓度的ALT标准曲线，吸光度与ALT浓度呈线性关系，相关系数达到0.99以上。

待测样本的吸光度值为X，通过标准曲线计算得到其ALT活性为Y。

进一步分析发现，实验组ALT活性显著高于对照组，说明实验组受到了肝脏损伤。

实验结论。

本实验通过测定血清中ALT的活性，成功评估了肝功能并诊断了肝脏疾病。

实验结果表明，ALT活性的升高与肝脏损伤密切相关，可作为肝功能评估和肝脏疾病诊断的重要指标之一。

实验注意事项。

1. 实验操作中需严格按照操作规程进行，避免操作失误导致结果误差。

2. 实验过程中需注意安全，避免接触有害化学品和受伤。

3. 实验结果需结合临床资料进行分析，以获得准确的诊断结论。

实验展望。

未来，可以进一步探究ALT在肝脏疾病诊断中的应用，寻找更为准确、快速的检测方法，为临床诊断提供更可靠的参考。

结语。

通过本实验，我们深入了解了血清谷丙转氨酶的测定方法和应用，为肝功能评估和肝脏疾病诊断提供了重要的实验依据。

希望本实验能对相关领域的研究和临床应用提供一定的参考价值。

【临床意义】
肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细 胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清 中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要 指标之一。ALT显著增高见于各种急性肝炎及药 物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于肝癌、 肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于 阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发 性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。
尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝 醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用 标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光 度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他 比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续 监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法 学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全国肝炎 协作会议也建议统一使用改良赖氏法。
改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。
由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加 成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中
生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围 内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。
据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过 标准曲线查出血清中ALT的活性。

实验十、血液转氨酶（谷丙转氨酶）活力的测定（实验：肝脏谷丙转氨酶活力测定）（本实验分2个实验完成：一、制作标准曲线二、测酶活力和总结。

或就做二就可以）【目的和要求】1、了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，2、学习转氨酶活力测定的原理和方法。

3、熟悉分光光度计的使用。

【原理】生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。

转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。

它们催化的反应如下。

正常人血清中只含有少量转氨酶。

当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。

测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。

谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。

丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，其吸收光谱的峰为439—530nm，因此在波长520nm处吸光度度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的摩尔比基本呈线性关系，故可藉可用分光光度法测定。

从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。

【试剂和器材】一、试剂1.试管及试管架2.吸管3.恒温水浴4.分光光度计5、移液管6、电子天平7、研钵8、容量瓶9、冰箱二、器材1、标准丙酮酸溶液[标准丙酮酸（500μg/ml）]：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于pH7.4 0.1M 的PBS中，定容到100ml。

现用现配。

2、谷丙转氨酶底物：0.90g L-丙氨酸，29.2mg α-酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。

然后用1M NaOH调节pH到7.4，再用pH7.4 0.1mol/L的PBS定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。

保证反应时的温度的准确性 5. 反应温度和计时要准确
= SALT活力
测定管微克数—对照管微克数 （单位） 2.5×0.1
五、注意事项
1. 2，4-二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙 2. 吸量应准确，严格控制反应时间和温度。 3. 在测定SALT活力时，应事先将底物、血清在37℃水浴中恒 温 4. 溶血标本不宜采用，因血细胞内转氨酶活力较高，影响测定 结果。 5．在测定时，如酶活力较大（大于100单位），应将样品稀释 后再进行测定。
serum Aminotransferase/ transaminase
catalyze alanine α-ketoglutarate glutamic acid pyruvic acid alkali substrate
ABSTRACT
Observing Enzyme Activity Changes of Alanine Aminotransferase in Sample
三、实验原理
COOH
C H3
CH2 α-ketoglutarate C H2
C H N H2 COOH
CO
alanine
COOH
COOH GPT
SUBSTRATE
C H2 CH2
C H N H2 COOH
pyrivic acid
C H3 CO COOH
pyruvic acid glutamic acid
0.50 0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
37℃水浴保温20min
氢氧化钠ml
5
5
5
5
5
5
室温下静置10min
蒸馏水调零点，于520nm处测吸光度

实验教学教案首页肝脏谷丙转氨酶活力测定（验证性）相关知识１．酶的提纯基本操作程序及基本原则２．酶的活力单位（IU）的定义及酶活力的测定（酶的定量测定）３．测定酶活力一般经如下几个步骤①选择适宜的一定浓度的底物。

②确定酶促反应的条件。

优化条件③将一定量的酶液和底物溶液混合，确定反应时间（因要测定酶促反应初速度）。

④反应到一定时间后取出反应液终止反应。

⑤测定产物的生成量。

⑥计算酶活力、酶的比活力。

４．酶的比活力－－表示酶纯度的指标⏹每单位酶蛋白所含的活力单位数。

对固体酶：比活力＝活力单位/mg酶蛋白对液体酶：比活力＝活力单位/ml酶液⏹比活力越大，酶的活力越大，含酶量或有活性的酶量越多。

５．总活力、纯化倍数和回收率６．酶活力测定方法—不同酶选用不同的方法７．氨基酸转氨基作用、联合脱氨基作用８．谷丙转氨酶及临床意义: 查肝功为什么要抽血化验转氨酶指数呢？谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST，GOT）是人体内糖和蛋白质互相转变所需的酶，人再生体内分布广泛。

ALT的分布以肝中最高，主要存在于肝细胞浆中，AST存在于肝细胞浆和线粒体内。

其次是肾、心、骨骼肌、脾等。

AST的分布则以心肌最高，其次为肝、骨骼肌、肾脏等。

①谷丙转氨酶为细胞内酶，血清中活性很低，各组织器官中以心和肝的活性最高。

当某种原因使细胞膜通过性↑，转氨酶可大量释放入血液，血清中转氨酶活性↑↑。

②抽血化验若转氨酶比正常水平偏高则有可能肝组织受损破裂，肝细胞的转氨酶进入血液。

（结合乙肝抗原等指标进一步确定是什么原因引起的）③常作为疾病诊断、观察疗效和预后的指标：急性肝炎：S-GPT↑↑、S-GOT↑心肌梗塞：S-GOT↑↑一、实验目的１．了解转氨酶的性质及临床意义 ２．掌握谷丙转氨酶活力的测定方法 二、实验原理联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。

丙氨酸及α－酮戊二酸为谷丙转氨酶的作用底物，利用内源性（肝细胞已有的）磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件下及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定酶活力。

系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或 通过标准曲线查出血清中ALT的活性。
King 氏法谷丙转氨酶活性单位：每毫升血 清在 37℃与 pH7.4 的基质液作用 60min，生 成 1μmol 丙酮酸为一个单位。临床检验取 血清量为 0.1mL，报告数据以 100mL 血清 计算，因此实际测得结果乘 1000 即可。例 如 0.1mL 丙酮酸标准液中丙酮酸含量为 0.2μmol，即相当 GPT200U/100mL。
3、器材
试管及试管架，移液管（0.5mL，1 mL，5 mL）， 量筒（10 mL，100 mL），恒温水浴，722 型分光 光度计，坐标纸。
实验内容和步骤
1) 制备标准曲线
2) 绘制标准曲线
以光吸收值为纵坐标，酶活性单位数为横 坐标，在坐标纸上绘制各测得A520值与对 应的酶活性单位数的标准曲线。
注意事项
1) 为防止溶血及其他因素对酶活性测定的影响，实验过程所用的一切器皿（注射器、 试管等）应清洗干净，干燥后方能使用。
2) 空腹取血，避免血脂干扰。迅速分出血清，及时测定。 3) 作为标准物质的Байду номын сангаас酮酸钠极易变质。配试剂时应选择外观洁白干燥者。若颜色变黄
或潮解，则应重结晶，干燥至衡重后再用。 丙酮酸钠重结晶：取纯丙酮 8 份与蒸馏水 2 份混合，加入变质的丙酮酸钠使其达到饱
比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法 （Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。 不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法30min。因此 它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是：每1ml血清在 37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作用30 min，每 生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实 验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位的定义是：在温 度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度 下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物 质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单 位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1卡门氏单位 =0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。

GPT 酶活力单位的定义
• 卡门氏单位定义为：1ml血清(反应溶液总量为3ml)，在25℃，1min内生 成的丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下，使NADH 活力单位。 + H+变成NAD+，在340nm 波长下，用内径为1.0cm的吸收池，光密度每下降0.001为1个氨基转移酶
•
• •
金氏法单位定义是：每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成
实验操作
• • 1.标准曲线绘制:(1)取试管5支，按表6-8操作。 (2)混匀，室温放置10min后，以蒸馏水调零 ，用520nm波长比色，读取各管光密度。 各管的吸光度（An）减去0管的吸光度（A0），然后以吸光度的差值（An-A0）为纵坐 标，各管相应的氨基转氨酶活力单位为横坐标，绘制标准曲线。
1μ mol丙酮酸称为一个单位。 穆氏法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作用30
min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。
赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏 单位作表示的。
实验原理
• 血清中的谷丙转氨酶（GPT），在37℃、pH7.4的条件下，
可催化底物液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮 酸
试剂/ml 血清 GPT底物液
测定管(T) 0.1 0.50
混匀，置37℃水浴中保温30min
对照管(C) — 0.50
2,4-二硝基苯肼液
0.50
混匀，置37℃水浴中保温20min
0.50
血清 0.4mol/LNaOH
— 5.00
0.1 5.00
实验评价
• • 1. 重复性差，其原因有三： ①由于限制底物α -酮戊二酸的用量，如一般采用2.0mmol ／L 的浓度下，反应速度只 有最大反应速度的 65 ％，使产物生成量与酶的活性之间不能呈现良好的线性关系。 • ② 2,4- 二硝基苯肼在碱性条件下也能显色，为了降低试剂空白的吸光度而不得不使 用低浓度的 2,4- 二硝基苯肼(1.0mmol ／ L) 。此种水平的 2,4- 二硝基苯肼仅能与 反应体系中的两种酮酸的一半反应。

实验九肝脏中转氨酶活力的测定一、实验目的1. 了解转氨酶的性质和临床意义；2. 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二、实验原理本实验以丙氨酸的氧化脱氨基为例，分别测定谷丙转氨酶，谷氨酸脱氢酶活性外，又通过抑制剂观察肝组织中的联合脱氨基作用。

在谷丙转氨酶的催化下，丙氨酸和α-酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。

次反应可逆，平衡点近于1.0无论正向反应或逆向反应皆可用于测定此酶的活性，既可测定所产生的氨基酸，也可以测定生成的酮酸，因此可有多种测定方法。

本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸作为谷丙转氨酶作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。

丙酮酸能与2,4-二硝基苯肼结合，生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收峰为439-530nm，可用于测定丙酮酸的含量。

α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱与丙酮酸二硝基苯腙有差别，在520nm波长比色时，α-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。

经转氨基作用后，α-酮戊二酸减少而丙酮酸增加，因此在波长为520nm 处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸和α-酮戊二酸的摩尔浓度呈线性关系，故可借此测定谷丙转氨酶的活力。

三、实验材料、试剂和仪器（一）材料与试剂猪肝脏、乙醇、0.4mol/LNaOH标准丙酮酸溶液（1mL 相当于500μg）：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于100mL 的0.05mol/L的H2SO4中，此液需临用前配制。

谷丙转氨酶底物：称取L-丙氨酸0.90g 及α-酮戊二酸29.2mg，先溶于pH7.4 的0.1mol/L 磷酸缓冲液中，然后用1mol/L NaOH 调至pH7.4，再加pH7.4 的0.1mol/L 磷酸缓冲稀释至100mL，贮藏于冰箱内，可保存一周。

（试验了一下pH 接近7.5，中间未调整pH 值）0.1mol/L 的磷酸缓冲液（pH7.4）：称取13.97gK2HPO4（如果是K2HPO4·∙H2O，则需称取18.31g）和2.69gKH2PO4 溶于1000mL 蒸馏水中。

实验九肝脏中转氨酶活力的测定一、实验目的1. 了解转氨酶的性质和临床意义；2. 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二、实验原理本实验以丙氨酸的氧化脱氨基为例，分别测定谷丙转氨酶，谷氨酸脱氢酶活性外，又通过抑制剂观察肝组织中的联合脱氨基作用。

在谷丙转氨酶的催化下，丙氨酸和α-酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。

次反应可逆，平衡点近于1.0无论正向反应或逆向反应皆可用于测定此酶的活性，既可测定所产生的氨基酸，也可以测定生成的酮酸，因此可有多种测定方法。

本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸作为谷丙转氨酶作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。

丙酮酸能与2,4-二硝基苯肼结合，生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收峰为439-530nm，可用于测定丙酮酸的含量。

α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱与丙酮酸二硝基苯腙有差别，在520nm波长比色时，α-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。

经转氨基作用后，α-酮戊二酸减少而丙酮酸增加，因此在波长为520nm 处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸和α-酮戊二酸的摩尔浓度呈线性关系，故可借此测定谷丙转氨酶的活力。

三、实验材料、试剂和仪器（一）材料与试剂猪肝脏、乙醇、0.4mol/LNaOH标准丙酮酸溶液（1mL 相当于500μg）：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于100mL 的0.05mol/L的H2SO4中，此液需临用前配制。

谷丙转氨酶底物：称取L-丙氨酸0.90g 及α-酮戊二酸29.2mg，先溶于pH7.4 的0.1mol/L 磷酸缓冲液中，然后用1mol/L NaOH 调至pH7.4，再加pH7.4 的0.1mol/L 磷酸缓冲稀释至100mL，贮藏于冰箱内，可保存一周。

（试验了一下pH 接近7.5，中间未调整pH 值）0.1mol/L 的磷酸缓冲液（pH7.4）：称取13.97gK2HPO4（如果是K2HPO4·∙H2O，则需称取18.31g）和2.69gKH2PO4 溶于1000mL 蒸馏水中。

改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。
由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
丙转氨酶altalt在在3737生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的24加成反应生成丙酮酸加成反应生成丙酮酸24中生成红棕色的苯腙硝醌化合物其颜色的深浅在一定范中生成红棕色的苯腙硝醌化合物其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量亦即与围内与丙酮酸的生成量亦即与alt系
血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生 加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境
中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范 围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关
4) 转氨酶只能作用于α －L－氨基酸（L－天冬氨酸，L－丙氨酸），对 D－氨基酸无催 化作用。实验室多用α －DL 氨基酸（因较 L－氨基酸价廉），如采用α ―L―氨基酸, 则需按α －DL 氨基酸的用量减半。
5) 为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定 PH，保温时间，选用固定的比色计，比 色杯以减少误差。
系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或 通过标准曲线查出血清：每毫升血 清在 37℃与 pH7.4 的基质液作用 60min，生 成 1μmol 丙酮酸为一个单位。临床检验取 血清量为 0.1mL，报告数据以 100mL 血清 计算，因此实际测得结果乘 1000 即可。例 如 0.1mL 丙酮酸标准液中丙酮酸含量为 0.2μmol，即相当 GPT200U/100mL。

一、实验目的1. 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用。

2. 学习转氨酶活力测定的原理和方法。

3. 掌握分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力的操作技能。

二、实验原理转氨酶是一种广泛存在于生物体内的氨基转移酶，能催化氨基酸的氨基与酮基酸的酮基互换。

在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。

其中，谷丙转氨酶（ALT）是人体内最重要的转氨酶之一，主要存在于肝脏细胞内。

当肝脏发生病变时，如肝炎、心肌梗死等，血清中ALT活力常显著增加，因此在临床诊断上，ALT活力的测定具有重要的意义。

本实验采用分光光度法测定血清谷丙转氨酶活力，通过检测ALT催化丙氨酸与酮戊二酸反应生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成的丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，来计算酶的活力。

三、实验材料1. 仪器：分光光度计、离心机、恒温水浴锅、移液器、试管等。

2. 药品与试剂：丙氨酸、酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼、NaOH、标准ALT溶液、血清样本等。

四、实验步骤1. 准备工作：将所有药品与试剂按照实验要求进行配置，确保实验所需的药品与试剂质量合格。

2. 标准曲线制作：将标准ALT溶液按照实验要求进行稀释，制成一系列不同浓度的标准溶液。

分别取等体积的标准溶液和2，4-二硝基苯肼溶液，混合后加入NaOH，进行显色反应。

在560nm波长下，测定吸光度值，以ALT浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 实验测定：取血清样本，按照实验要求进行稀释，分别加入丙氨酸、酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼和NaOH，进行显色反应。

在560nm波长下，测定吸光度值。

4. 数据处理：将实验测定的吸光度值代入标准曲线，计算出血清ALT活力。

五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，线性范围为20～100U。

2. 实验测定：根据实验数据，计算血清ALT活力，结果为X U/L。

3. 结果分析：根据血清ALT活力值，判断肝脏功能是否正常。

东师实验4⾕丙转氨酶活性的鉴定及活⼒单位的测定综合研究性实验四：⾕丙转氨酶活性的鉴定及活⼒单位的测定⼀.实验⽬的1.⽤纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作⽤；2.⽤分光光度法测定⾎清丙转氨酶的活⼒；3.学习治疗检测SGPT的⽅法及原理；4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应⽤。

⼆.实验材料与试剂[⼀]实验材料动物肝脏[⼆]实验试剂1.9%NaCl溶液2.海砂3.1%⾕氨酸溶液（1%KOH溶液中和）4.%丙酮酸钠溶液（⽤1%KOH溶液中和）5.0.1%KHCO3溶液6.0.025%⼀溴⼄酸溶液（⽤1%KOH中和）7.2%⼄酸溶液8.酚的饱和⽔溶液将2份酚和2份⽔（按重量计算）混合后，放⼊分液漏⽃中，振荡。

静⽌24h以后分层，将下部酚层放⼊瓶中备⽤。

新配制的酚展层剂可以反复使⽤1周。

9.0.1%⽔合茚三酮的正丁醇溶液10.0.1%标准⾕氨酸溶液11.0.1%标准丙氨酸溶液12.1%KOH溶液⼆.⾕丙转氨酶活性的鉴定（纸层析法）[⼀]实验原理观察肌⾁糜中⾕丙转氨酶所催化的氨基移换反应。

通过纸层析法检查底物⾕氨酸的减少和产物丙氨酸的⽣成。

为防⽌丙酮酸被肌⾁糜中的其它酶所氧化或还原，在反应系统中加⼊了抑制剂溴⼄酸。

[⼆]实验操作（⼀）⾕丙转氨酶提取液制备⾕丙转氨酶提取液制备⽅法2g肝脏+0.9%NaCl6mL+海砂200mg在低温下，研磨成浆⽤脱脂棉过滤，得提取液（滤液不清）（⼆）转氨作⽤试剂对照管测试管0.1moL/L⾕氨酸0.500.500.1moL/L丙酮酸钠0.500.500.1%KHCO30.500.500.025%⼀溴⼄酸0.250.25煮沸的酶液0.50—酶液—0.50加脱脂棉塞，45℃⽔浴，1.5h，时时振荡内容物2%⼄酸6滴6滴沸⽔浴2min，使蛋⽩质完全沉下，过滤，作层析（三）纸层析1.⽅法纸层析⽅法取圆形层析滤纸1张，在圆⼼处⽤圆规绘出直径为3cm的同⼼圆通过中⼼将滤纸绘成四等分扇形，⽤⽑细管点样2-4次（直径不超过2mm）在滤纸的圆⼼上剪⼀⼩孔，直径约1-2mm取⼀⼩滤纸条，将下端剪成刷状，在卷成灯芯插⼊圆形⼩孔，不能使灯芯突出纸⾯将圆形滤纸平放在盛有层析液（⽔饱和酚）培养⽫上，使灯芯向下与溶剂接触⽤⼤⼩相同的培养⽫盖在滤纸上溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移⾄距滤纸边缘约1cm处时停⽌（展层时间为1h）80-100℃烘箱⼲燥，喷洒⽔合茚三酮的正丁醇溶液，80-100℃显⾊2.实验结果三.⾎清⾕丙转氨酶活⼒单位测定[⼀]实验原理本实验⽤丙氨酸和α-酮戊⼆酸为底物，经转氨作⽤⽣成⾕氨酸和丙酮酸。

改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度( 改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度) 浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度, 由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
【实验原理】 实验原理】 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃ 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与α 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加 成反应，生成丙酮酸-2,4成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中 生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围 内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。 内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。 据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过 标准曲线查出血清中ALT的活性。 标准曲线查出血清中ALT的活性。
二是比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 二是比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖 氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全 氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全 相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法 相同。不同之处在于作用时间：King法 Mohun法和 Reiman法 30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是： 30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是： 每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单 1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单 位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作 用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定 min，每生成2.5微克丙酮酸为1 义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1 义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位 的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血 的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血 清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质 清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质 的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的 定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系： 1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。 卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。

1
0.5 置于37℃水浴内预热5分钟
2
0.5
人血清
2,4－二硝基苯肼溶液 人血清
0.1
0.5 －
－
0.5 0.1
振摇均匀，置于37℃水浴内继续保温60分钟
氢氧化钠溶液
A520nm
5
5
0
充分摇匀，室温下静置30分钟后，以2号管作空白，520nm处比色
在标准曲线上查出丙酮酸的μ mol数（用1μ mol丙酮酸代表1.0单位酶 活力），计算每100 mL血清中转氨酶的活力单位数。

各管摇匀，置于37℃恒温水浴锅预热5-10分钟 各管摇匀，置于37℃恒温水浴锅加热20分钟
充分摇匀，室温下静置30分钟后，以0号管作空白，520nm处比色
用丙酮酸μ mol数为横坐标，光吸收值A520nm为纵坐标，画出标准曲线。
2．酶活力的测定
取2支干洁试管并标号，用第1号试管做为未知管，第2号试管做为空白对 照管。按下表操作。 试剂（ml） 谷丙转氨酶底物 试 管 号
血液中转氨酶活力的测定（分光光度法）
一、目的 1.了解转氨酶在代谢过程中的重要作用； 2.学习转氨酶活性测定的基本原理和操作方法； 3.了解转氨酶活性测定的临床意义。
二、原理
生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α 氨基酸的α -氨基与α -酮酸的α -酮基互换，在氨基酸的合成 和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用 。 转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草 酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶 （简称谷丙转氨酶）的活力最强。
思考题： 转氨酶在代谢过程中的重要作用及在临床诊断中的意义？
参考答案： 生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α 氨基酸的α -氨基与α -酮酸的α -酮基互换，在氨基酸的合成和 分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。 肝细胞中含转氨酶最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞受损伤 时，转氨酶即大量释放入血液，致使血清中转氨酶活性增高。 测定转氨酶是检查肝功能的重要指标之一。转氨酶显著增高见 于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于 肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于阻塞性 黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发性肌炎亦可引起转氨 酶活性升高。

一、实验目的1. 了解转氨酶在生物体内的重要作用。

2. 掌握转氨酶活力的测定原理和方法。

3. 学会运用分光光度法测定转氨酶活力。

二、实验原理转氨酶是一类催化氨基酸与酮酸之间氨基转移反应的酶。

在生物体内，转氨酶参与氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程。

转氨酶活力的高低可以反映肝细胞受损程度和肝功能状态。

本实验采用分光光度法测定转氨酶活力。

在特定条件下，转氨酶催化丙氨酸与α-酮戊二酸反应生成丙酮酸和谷氨酸。

丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙，后者在碱性条件下呈棕色，可通过分光光度法测定其吸光度，从而计算出转氨酶活力。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 丙氨酸- α-酮戊二酸- 2，4-二硝基苯肼- 磷酸氢二钠- 磷酸二氢钠- 碘化钾- 氯化钠- 丙酮- 酒精- 37℃水浴2. 实验仪器：- 电子天平- 移液器- 试管- 试管架- 玻璃搅拌棒- 分光光度计- 移液管- 容量瓶四、实验步骤1. 配制工作溶液：- 丙氨酸溶液：称取0.1g丙氨酸，溶解于100ml蒸馏水中，配制成0.1mol/L 的丙氨酸溶液。

- α-酮戊二酸溶液：称取0.1gα-酮戊二酸，溶解于100ml蒸馏水中，配制成0.1mol/L的α-酮戊二酸溶液。

- 2，4-二硝基苯肼溶液：称取0.1g2，4-二硝基苯肼，溶解于10ml丙酮中，配制成0.01mol/L的2，4-二硝基苯肼溶液。

2. 标准曲线的绘制：- 取7支试管，分别加入不同浓度的丙酮酸标准溶液，加入1ml 2，4-二硝基苯肼溶液，混匀后置于37℃水浴中反应60min。

- 在520nm波长下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，丙酮酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。

3. 转氨酶活力的测定：- 取7支试管，分别加入不同浓度的转氨酶溶液，加入1ml 丙氨酸溶液和1ml α-酮戊二酸溶液，混匀后置于37℃水浴中反应60min。

- 取出试管，加入1ml 2，4-二硝基苯肼溶液，混匀后置于37℃水浴中反应60min。