L-谷氨酸脱羧酶

大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶定点突变及其酶学性质初步研究摘要：大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶（L-GAD）是一种关键的酶，在生物体内催化L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸（GABA）。

本研究旨在通过定点突变技术对L-GAD进行改造，进而研究突变体的酶学性质。

通过大肠杆菌基因工程技术定点突变D479的临氨酸残基，获得了突变体L-GADD479A。

本研究分别对野生型和突变体L-GADD479A进行了比较分析。

引言：L-GAD是多种生物体内的关键酶之一，具有重要的生理功能。

通过催化L-谷氨酸转化为GABA，L-GAD参与了神经递质的合成以及神经元的抑制传递过程。

近年来，通过对L-GAD的研究，发现L-GAD的活性和稳定性可以通过定点突变来改变。

其中，D479位点在突变中被广泛注目。

材料与方法：将L-GAD的基因克隆至大肠杆菌系统，通过PCR扩增获得谷氨酸酶基因片段。

使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit在L-GAD基因的D479位点引入一个临氨酸突变，得到突变体L-GADD479A。

将野生型和突变体经过诱导表达，然后通过Ni-NTA亲和柱纯化获得纯化的L-GAD酶，利用SDS-PAGE进行酶的纯度鉴定。

结果：通过PCR扩增获得了L-GAD基因片段，通过定点突变技术成功将D479位点的天冬氨酸突变为临氨酸。

纯化的野生型和突变体L-GAD经SDS-PAGE分析得出纯度良好。

进一步的酶学性质研究表明，突变体L-GADD479A的酶活性相较于野生型L-GAD下降了20%。

此外，在pH 7.5下，野生型和突变体酶的酶活性最高，而在pH 3.0和pH 9.0时，酶的活性明显下降。

突变体L-GADD479A的热稳定性较野生型L-GAD提高了5℃，更能适应高温条件。

讨论：本研究通过定点突变技术成功地构建了突变体L-GADD479A，并对其酶学性质进行了初步研究。

突变体L-GADD479A在酶活性和热稳定性方面与野生型存在显著差异。

Ⅰ型糖尿病的关键抗原—谷氨酸脱羧酶
王建民
【期刊名称】《国外医学：内分泌学分册》
【年(卷),期】1996(016)002
【摘要】谷氨酸脱羧要酶是胰岛的正常组成成分，在遗传学异常的基础上，遇到感染和／或免疫细胞异常，机体可产生针对对谷氨酸脱羧酶的自身免疫反应，破坏胰岛素分泌细胞，导致糖尿病的发生。

应用谷氨酸脱羧酶自身抗原诱导免疫耐受可望用于防治Ⅰ型糖尿病。

【总页数】4页(P59-62)
【作者】王建民
【作者单位】湖南医科大学代谢内分泌研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R587.103
【相关文献】
1.谷氨酸脱羧酶对不同周龄的非肥胖型糖尿病小鼠发生1型糖尿病的影响 [J], 范国权;陈向伟
2.不同剂量谷氨酸脱羧酶对非肥胖型糖尿病小鼠发生1型糖尿病的影响 [J], 范国权;陈向伟;王春芳;刘丽娜
3.霍乱毒素B亚单位与谷氨酸脱羧酶抗原表位肽融合蛋白的表达及鉴定 [J], 刘利成;方宏清;彭远义;李彦英;张艳红;刘传喧;陈惠鹏
4.2型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶抗体水平与认知功能障碍的相关性研究 [J], 杨本
德; 王恒; 柳蕾; 郭秀凤
5.基于谷氨酸脱羧酶65的口服疫苗对链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠的治疗作用 [J], 吴伊玲;尤琪;吴洁
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大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的结构、功能及其基因表达调控赵艳;梁新乐;张虹【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2006(032)007【摘要】谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)广泛存在于原核和真核细胞,催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸和CO2.GAD的生物学功能和基因表达调控机制是当前研究的热点.对模式生物大肠杆菌(Escherichia coli)GAD的研究已取得了很大进展.文中综述了E.coli GAD的结构、功能及其基因表达调控机制的研究进展,为GAD的应用和基因操作提供理论依据,也为阐明GAD在真核生物中的生物学功能和基因表达调控机制提供了重要线索.【总页数】4页(P75-78)【作者】赵艳;梁新乐;张虹【作者单位】浙江工商大学食品,生物与环境工程学院,杭州,310035;浙江工商大学食品,生物与环境工程学院,杭州,310035;浙江工商大学食品,生物与环境工程学院,杭州,310035【正文语种】中文【中图分类】TS2【相关文献】1.植物NO3-转运蛋白的结构、功能及基因表达调控 [J], 徐海荣;邓若磊;曹云飞;肖凯2.大肠杆菌在lacZ基因表达和调控方面与气单胞菌、假单胞菌的异同及膜荧光法检测时“假阳性”的克服 [J], 林大榕3.大肠杆菌α-溶血素分泌系统基因表达调控研究进展 [J], 周立雄;张兆山4.朱砂叶螨转录因子TcNrf2对抗氧化酶基因表达的调控功能初步研究 [J], Gao Jintao;LIANG Xiao;WU Chunling;CHEN Qing;CHEN Qian5.鸡致病性大肠杆菌O_1、O_2和O_(78)的Ⅰ型菌毛结构基因表达载体的构建及表达产物的检测 [J], 李尚波;王文成;张贵刚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

谷氨酸脱羧酶转化氨基丁酸
谷氨酸脱羧酶（Glutamate Dehydrogenase，GDH）是一种酶，其主要功能是将谷氨酸转化为氨基丁酸（ABA）。

谷氨酸脱羧酶属于谷氨酸脱羧酶家族，包括GDH1和GDH2两个亚型。

GDH1主要存在于动物和真菌细胞中，起到调节氨基酸代谢的作用。

GDH2主要存在于植物细胞中，起到调节氨基酸代谢和抗逆性的作用。

谷氨酸脱羧酶的转化过程如下：
谷氨酸+ NADP+ + H2O -> 氨基丁酸+ NADPH + 2H+
在这个过程中，谷氨酸被转化为氨基丁酸，同时生成一个NADPH。

谷氨酸脱羧酶在生物体中具有重要的生理意义，能够调节氨基酸的代谢，并参与许多生理过程，如抗氧化、能量代转、信号转导等。

谷氨酸脱羧酶还能够参与植物体内氮循环，在植物体内参与谷氨酸代谢，并促进植物生长发育。

谷氨酸脱羧酶还有一种反向反应，即将氨基丁酸转化为谷氨酸。

这种反应能够提供能量，并且在植物体内参与氮循环，促进植物的生长发育。

谷氨酸脱羧酶在生物体中的作用是非常重要的，它能够调节氨基酸的代谢，并参
与许多生理过程。

谷氨酸脱羧酶抗体偏高在临床上提示与某些疾病相关，比如糖尿病、难治性癫痫。

虽然这些疾病如何引起谷氨酸脱羧酶抗体偏高的机制还不明确，但出现这种情况时就要提高警惕，建议到医院完善其他检查后，再针对相应疾病进行治疗。

1、糖尿病：谷氨酸脱羧酶抗体与胰岛细胞抗体、胰岛素自身抗体的检查结果结合起来，对于判断1型、2型糖尿病有重要价值。

已经有较多的临床数据与研究表明1型糖尿病患者的血液中谷氨酸脱羧酶抗体偏高，如果确诊为1型糖尿病患者，需要尽早使用胰岛素治疗；
2、难治性癫痫：谷氨酸脱羧酶是谷氨酸转化为γ-氨基丁酸的限速酶，直接影响脑组织中的γ-氨基丁酸浓度，而γ-氨基丁酸是中枢神经系统重要的抑制性递质，与癫痫发病密切相关，所以谷氨酸脱羧酶抗体阳性是判断难治性癫痫的一项敏感指标。

治疗上，难治性癫痫患者可遵医嘱口服抗癫痫药物，比如拉莫三嗪、加巴喷丁等，也可以使用电刺激治疗、病灶切除等方法。

重组植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶活力测定实验一、实验目的了解原核表达系统熟悉并掌握粗酶液的制备方法熟悉并掌握谷氨酸脱羧酶活力的测定方法熟悉并掌握超声破碎仪及U-V1100紫外可见分光光度计使用方法二、实验原理γ-氨基丁酸（GABA）作为一种非蛋白氨基酸，是目前研究较为深入的哺乳动物脑组织一种重要的抑制性神经递质，具有一系列的生理功能，例如降血压功能、治疗癫痫、抗疲劳、提高免疫力等。

谷氨酸脱羧酶（GAD,EC4.1.1.15）是一种磷酸吡哆醛（PLP）类酶，能专一催化L-谷氨酸脱羧成为γ-氨基丁酸（GABA）和CO2。

催化效率——即酶的活力是酶的重要参数，研究酶的活力是研究酶性质及应用的基础。

本实验通过测定谷氨酸脱羧酶催化产物γ-氨基丁酸产率来定义谷氨酸催化活力。

谷氨酸脱羧酶催化反应式如下：L-谷氨酸谷氨酸脱羧酶（GAD）γ-氨基丁酸（GABA）GAD现行测定方法及优缺点测定方法优点缺点HPLC法准确灵敏度高操作复杂、测定时间较长氨基酸自动分析仪法稳定操作简单仪器使用复杂、昂贵纸层析和薄层层析法方便简单稳定性差、适合定性测量Berthelot比色法灵敏度高、方便简单有游离氨干扰毛细管电泳法耗材少，环境污染小重现性较差根据样品的特性及实验的需要，本实验采用Berthelot法测定反应液中GABA。

GABA的测定方法采用Berthelot法，该方法利用苯酚和次氯酸钠与氨基反应生成蓝绿色物质(次氯酸钠氧化苯酚生成醌，醌和氨基反应生成蓝绿色物质)。

Berthelot法对GABA（ω-氨基酸）的响应高，而对L-谷氨酸（α-氨基酸）响应低，所以用Berthelot法可以快速、高灵敏度测定出催化反应产物中的GABA。

通过测定一定时间反应液中的GABA的吸光度值从而得到GABA的浓度，最终计算出谷氨酸脱羧酶的活力。

三、实验材料和主要仪器1、仪器MIKRO 220R 2205型低温冷冻离心机UV-1100型紫外可见分光光度计水浴锅ZHWY-110XAB104-N型电子分析天平FS-250N型超声破碎仪2、主要器皿100mL容量瓶、烧杯、样品瓶、5mL试管、5mL离心管、10mL离心管、50mL离心管3、试剂和材料γ-氨基丁酸（GABA）标准品（sigma公司）L-谷氨酸钠（味精）磷酸盐缓冲液（PBS）：8g/L NaCl,0.2g/L KCl,1.42g/L Na2HPO4,0.27g/L KH2PO4,加入浓盐酸调节pH至7.4Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH4.8，含0.2MNa2HPO4，0.1M柠檬酸，20mL）：0.2M Na2PO49.86mL,0.1M柠檬酸10.14mL混合。

谷氨酸脱羧酶
l型糖尿病（IDDM）是遗传易感性个体通过自身抗原介导的免疫反应引起胰岛B细胞破坏的自身免疫性疾病。

成人隐匿性自身免疫性糖尿病（LADA）是成年起病的 1型糖尿病，其临床特征是缓慢进展的自身免疫
胰岛B细胞破坏，初期与2型糖尿病表现相似。

谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）是人及动物体内抑制性神经递质γ-氨基丁
酸的合成酶，主要存在于胰岛B细胞。

谷氨酸脱羧酶（anti-glutamic acid decarboxylase antibody，GADA）是GAD诱发免疫反应产生的自身抗体，是诊断1型糖尿病的免疫学指标，而且对于成人隐匿性自身免疫性糖尿病的早期诊断具有重要意义。

GADA的存在，预示将发生内源性胰岛
素分泌缺乏。

中山大学硕士学位论文谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达姓名：***申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：***20070608半醛（ｓｓＡ）和谷氨酸，然后ＳＳ＾在琥珀酸半醛脱氢酶（Ｓｕｃｅｉｎａｔｅｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，简称ＳＳＡＤｒＩ）氧化下形成琥珀酸进入三羧酸循环，这些反应和谷氨酸脱羧酶（ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＥＣＡ．１．１．１５）催化的谷氨酸脱羧反应一起，构成了Ｙ一酮戊二酸氧化形成琥珀酸的另一条支路（Ｓｔｒｅｅｔｅｒｅｔａｌ，１９７２），称之为ＧＡＢＡ支路（如图１—１、卜２）。

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镕，ｌｇｔ鬻Ｙ－－黧—整鏊麓—㈨谷氯缒Ｉ；Ｉ舔氮毅脱羧醮ｌ‘ｌｌ置蔽联镛拜）骧期蘸辅ｉ跷了一氮蕊Ｔ馥’ｔｉｌ｝泓繁氟酶廷勰索酸—４琥珀麓≮器萄瑟甄萄嚣基毒嘲酸拳蒸图１－１：ＧＡＢＡ支路相关的酶ＩＦｉｇ．１·１：ＥｎｚｙｍｅｓｏｆｔｈｅＧＡＢＡｐａｔｈｗａｙＩ图１－２：ＧＡＢＡ支路相关的酶ＩＩＦｉｇ．１—２：ＥｎｚｙｍｅｓｏｆｔｈｅＧＡＢＡｐａｔｈｗａｙＩＩ１．２．１ＧＡＢＡ的生理功能（１）改善脑机能，延长记忆力。

研究表明，ＧＡＢＡ可以提高葡萄糖磷酯酶的活性，从而促进动物大脑的能量代谢，活化脑血流，增加氧供给量，最终恢复脑细胞功能，改善神经机能。

（２）改善视觉功能。

据报道，将带有毛细管的电极插入老年猴子的大脑视觉神经皮层中，通过毛细管给神经细胞注入微量的ＧＡＢＡ。

比较给药前后视觉神经细７马倩中山大学硕士学位论文ＧＡＤ６７３４８８ｂｐ图．２．７ＧＡＤ６７的基因结构分析Ｆｉｇ．２·７ＴｈｅｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＧＡＤ６７马倩中山大学硕士学位论文细菌表达载体ｐＱＥ３０由本室保存。

物理图谱见图３—２。

ｐＱＥ－３０，ｐＱＥ·３Ｔ，ａｎｄｏＱＥ－３２ＶｅｃｔｏｒｇＰｏｓｉｔｉｏｎｓ研’ｅｌｅｍｅｎＩｓｉｎｂａｓｅｓ“ｐＱＥ·３０割０Ｅ－３１ｐＱＥ－３２Ｖ＊ｃｔｏｒ赫｛ｂｐｌ３４６１钍醴＋泓６２跏一ｏｆｎｕｍｂｅｒｉｎｇ耐热ｏｌ（ＣＴＣＧＡＧ）１蠢１－６ｌ毒Ｔ５ｐｒｏｍｏ栅／ｌａｃｏｐ烈司垂ｃ盱ｄｅｍｅｎｔ７－－８７瑚７７迎７ｒＴ５ｔｒｏｒ％ｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｄ＂６１６１６ｌ６】ｃＨｉｓ－ｔａｇ∞ｄｉｎｇｓｅｑｕｅｍ：枣１２７—１４４他７－１钳１２７－ｔ４４Ｍｕｌ矗ｐｌｅｃ｜ｏｎｉｎｇ钳翻ｅ１４５一１９２１４７－１９４１４｛缸１９３ｈｂ如，Ｂ细ｎ５ｃ打ｐ如ｎｄｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ理赫２０８－－３０２２１０．－３０４２０９－３０３咖８Ｔ１ｔｍｎｓｃｎ两ｏｎａｌｈ冀啊瞄抟ｃｌ｜；ｏｒｒｆｅ叠ｉｏ“１０６４－１１６２１０６６＿１１６４１０６．孓．１１６署Ｃｏｌ￡１ｏ南ｉｎｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｍｎ１６３０１６４０１６３９参｛ｑ馥确瞅ｃｏｄｉｎｇｓｅｑ臼ｅｎｃ邑零２Ｓ垂－２３９６９２５＆－２３９８嚣２５７卫３９７叠竺‰燃盛驺§隔∞啼‘图３－２ｐＱＥ３０载体物理图谱、多克隆位点及测序引物占Ｆｉｇ．３－２Ｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐｏｆｐ０Ｅ３０ｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐ一ｍｄｌ＇ｓ。

氨基酸的脱羧基
１、L-谷氨酸L-谷氨酸脱羧酶γ-氨基丁酸(GABA) GABA为抑制性神经递质。

２、L-半胱氨酸磺酸丙氨酸磺酸丙氨酸脱羧酶牛磺酸
牛磺酸是结合型胆汁酸的组成成分。

３、L-组氨酸组氨酸脱羧酶组胺
组胺是一种强烈的血管舒张剂，并能增加毛细血管的通透性。

４、色氨酸色氨酸羟化酶5-羟色氨酸5-羟色氨酸脱羧酶5-羟色胺(5-HT)
脑内的5-羟色胺可作为神经递质，具有抑制作用；在外周组织，有收缩血管作用。

５、L-鸟氨酸鸟氨酸脱羧酶精脒
精胺
脱羧基SAM 脱羧基SAM
精脒与精胺是调节细胞生长的重要物质。

合称为多胺类物质。