单克隆抗体制备全攻略(二)

单克隆抗体的制备流程1.免疫原的制备和动物的免疫：在开始制备单克隆抗体之前，首先需要制备免疫原。

免疫原可以是蛋白质、多肽、多糖、细胞表面抗原等。

制备免疫原的常用方法包括化学合成、原核表达系统、真核表达系统等。

制备好免疫原后，将其与适当的佐剂混合，然后通过注射等方式将免疫原引入到实验动物体内。

通常使用小鼠、大鼠或兔子作为免疫动物。

2.脾细胞的获取和混合瘤细胞的建立：在免疫过程中，免疫原会刺激机体产生大量的抗体。

当机体免疫反应达到一定水平时，需要从免疫动物体内获取脾脏，获得含有抗体产生细胞的脾细胞悬液。

将脾细胞与能激活脾细胞的细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合，形成混合瘤细胞。

3.杂交瘤细胞的筛选和鉴定：将混合瘤细胞进行稀释，分装到96孔板中，使每个孔中只包含一个细胞。

这样每个孔中的细胞都是一个潜在的单克隆细胞。

随后，每个孔中的细胞在培养基中进行培养，以使细胞形成单个克隆。

根据杂交瘤细胞产生的特定抗体，可以使用ELISA等方法进行筛选和鉴定，以确定具有所需抗体的杂交瘤细胞。

4.单克隆抗体的生产和纯化：将筛选出来的单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，并定期收集培养上清液以获取单克隆抗体。

为了提高单克隆抗体的纯度和浓度，通常需要对培养上清液进行多次纯化。

典型的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

综上所述，单克隆抗体的制备流程包括免疫原的制备和动物的免疫、脾细胞的获取和混合瘤细胞的建立、杂交瘤细胞的筛选和鉴定，以及单克隆抗体的生产和纯化等几个主要步骤。

每个步骤都需要精确操作和耐心等待，但最终可以获得高纯度和高特异性的单克隆抗体，这在生物医学研究和临床诊断中具有重要的应用价值。

单克隆抗体的制备方法
单克隆抗体的制备方法主要包括以下几个步骤：
1. 免疫兔或小鼠：首先选择一个目标抗原，这可能是一种蛋白质、多肽或其他分子。

然后，将该抗原注射到实验动物（通常是免疫兔或小鼠）的体内，以刺激其免疫系统产生抗原特异性的抗体。

2. 細胞樹突瘤：在动物体内产生抗体后，从其体内提取淋巴细胞，通常是从脾脏或骨髓中获得。

然后，将这些淋巴细胞融合到特定的癌细胞（如骨髓瘤细胞）中，形成融合细胞，称为淋巴瘤细胞。

3. 杂交瘤筛选：将淋巴瘤细胞培养在富含饲养基的培养皿中，使其成长为一种混合的细胞群。

然后，利用对抗体特异性的检测方法，如ELISA或流式细胞术，筛选出对目标抗原具有高亲和力和高特异性的单克隆抗体产生的杂交瘤细胞。

4. 单克隆抗体培养和纯化：将筛选出的单克隆抗体杂交瘤细胞进行扩增培养，并采用特定培养基和条件，如添加低髓酸和高髓酸补充物，以增加单克隆抗体的产量。

随后，通过离心、净化和纯化等步骤，从培养物中分离和纯化出单克隆抗体。

5. 验证和应用：对制备的单克隆抗体进行验证，包括测定其亲和力、特异性和功能等方面。

然后，将其应用于各种实验和临床研究领域，如免疫组织化学、免
疫印迹、流式细胞术和免疫疗法等。

需要注意的是，单克隆抗体的制备过程较为繁琐和耗时，并且存在一定的技术挑战。

因此，近年来还出现了许多其他方法来制备单克隆抗体，如基因工程技术和体外抗体筛选技术等，可以更快速和高效地得到目标单克隆抗体。

单克隆抗体制备步骤及注意事项单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。

制备单克隆抗体的方法主要有杂交瘤技术和重组DNA技术。

以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。

步骤一：抗原免疫1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合适的抗原。

2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。

选择适合的动物后，根据抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。

3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。

通常先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。

步骤二：细胞融合1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。

2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培养基中培养，以供细胞融合使用。

3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。

将其培养至对数生长期。

4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。

步骤三：细胞筛选与扩展1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择杂交瘤细胞。

2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行有限稀释，使其实现单克隆化。

3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。

步骤四：单克隆抗体鉴定1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，检测其抗原特异性。

2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其在特定细胞或组织中的反应。

3.流式细胞术：通过流式细胞仪检测单克隆抗体与特定细胞表面标志物的结合情况。

步骤五：单克隆抗体生产与纯化1.细胞培养：将单克隆细胞株培养扩增至一定程度。

2.抗体收集：将培养上清液进行抗体收集。

3.纯化与浓缩：利用亲和层析、离子交换、凝胶过滤等技术，对抗体进行纯化和浓缩。

单克隆抗体制备全攻略
第二部分：后续制备抗体
一、克隆抗体转染/细胞表达
1、转染/细胞表达
在细胞转染/表达实验中，选择恰当的细胞系，以实现 Ideal Clone
抗体的有效表达。

一般来说，传统抗体的转染/表达系统可以从常见的细
胞类型中选择，如：CHO、COS、HEK293、HEK293T、BAK、T-Rex等。

在细
胞表达系统中，要获得较高质量和较高抗体表达水平的细胞，需要仔细筛
选要转染的细胞，以确保细胞表达的质量。

此外，在细胞表达实验中，对 mammalian expression vectors（比
如pCDNA3.1）进行转染/表达，通常会使用常用的转染剂，如：FUGENE-6、Lipofectamine 2000，以及使用高效器具，比如：Gene Pulser以及Nucleofector等。

此外，在实验中，也会使用不同类型的细胞表达系统，以同时表达多个受体，以实现有效地克隆抗体制备。

2、显示克隆抗体
显示技术是克隆抗体制备的一种优秀技术，它可以实现高质量的表达，同时保持抗体的结构和性质。

单克隆抗体制备流程单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前准备(一) 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。

一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。

要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。

商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0.5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。

单克隆抗体的制备流程
一、抗体cDNA克隆
2、结合分离：抗体和抗原之间采用免疫学方法，进行亲和结合分离，在病理学中，可以采用细胞亲和免疫电泳或者细胞色素紧缩技术来进行识
别性结合分离抗体。

3、mRNA提取：使用RNAsy Plus Kit根据操作说明提取亲和结合分
离后的抗体的mRNA，用于cDNA合成。

4、cDNA合成：使用双链cDNA合成试剂盒，根据说明书操作，将mRNA合成双链cDNA。

5、克隆：将双链cDNA进行克隆，经过构建的一系列步骤，最终将cDNA克隆到载体上，构建出抗体cDNA克隆库。

二、抗体cDNA克隆抗体制备
1、选择克隆体：选择抗体cDNA克隆库中的抗体表达克隆，采用PCR
技术进行选择，并检测克隆体具有良好的免疫特性，可以快速确定最佳克
隆体。

2、表达载体构建：将最佳克隆体插入到表达载体中，构建出属于克
隆体的表达载体，以此保证克隆体的正确表达。

3、表达系统筛选：利用多种表达系统，筛选出最佳的表达系统，以
此来达到最佳的表达效果。

4、表达调控：对于最佳的表达系统，根据cDNA克隆体的特性，进行
最佳的表达调控，以此达到最佳的抗体表达效果。

一文扫尽单克隆抗体制备流程单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。

通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。

目录1简介 2制备过程 3抗原准备 4动物免疫 5细胞融合 6杂交瘤细胞 7鉴定实验8克隆化方法 9细胞选择 10应用 11局限性 12研究进展简介1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠B细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。

将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。

利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。

这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。

这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，可用于探讨①蛋白质的精细结构;②淋巴细胞亚群的表面新抗原;③组织相容性抗原;④激素和药物的放射免疫(或酶免疫)分析;⑤肿瘤的定位和分类;⑥纯化微生物和寄生虫抗原;⑦免疫治疗和与药物结合的免疫。

制备过程单克隆抗体制备流程1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。

一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。

抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

单克隆抗体制备流程一、免疫准备1）试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂2）常用免疫原：纯化蛋白、融合蛋白、多肽。

3）耗材：1ml、2ml注射器，橡胶管，1.5ml EP管，刀片（或毛细玻璃管），酒精棉球。

4）免疫动物：小鼠（BALB/c,雌性6-8周）5）乳化器（或者手动推）二、免疫过程1）免疫前取血取血方式：酒精棉擦拭尾部后（酒精多了伤口挤压出来的血液易分散），用锋利的刀片在小鼠尾部靠近静脉处划开小口，如下图箭头所示方向从上往下挤压血管，血从伤口处流出后用枪吸取放入EP管中（30ul血够用）离心取上清放冰箱备用。

此方法取血最为简单易行，避免眼球取血毛细管扎瞎老鼠眼睛。

注意点：①避免切断老鼠尾巴②切口劲量靠近尾末端，方便挤压血管③伤口消毒酒精不要太多，不利于伤口血液凝固。

2）免疫原制备：一支2ml注射器吸抗原，另一支注射器吸等量体积佐剂，橡胶管连接两支注射器来回推几下混匀，然后放乳化器上乳化（为防止蛋白变性，乳化器上可放置冰袋），大约来回推1500次左右可乳化完全（滴一小滴到静水中若不扩散说明乳化完全）。

换上1ml注射器针头免疫小鼠（2ml注射器免疫不好控制，可将乳化液转移到1ml注射器中免疫，但这样会损失部分抗原）。

注：①每只老鼠免疫蛋白量10-100ug,初次免疫参考量50ug蛋白/只，加强免疫及融合前冲击免疫25ug蛋白/只。

初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前冲击免疫不使用佐剂可用缓冲液如PBS等稀释抗原（如果需要）。

②免疫量100ul-300ul/每只小鼠。

③多点免疫，一针不要打太多。

3）免疫方式和免疫时间根据免疫原决定免疫方式，皮下免疫和腹腔注射较为常见(纯化蛋白、融合蛋白多肽)。

皮下注射免疫，免疫时间间隔为2周，第三次免疫一周后（8-10d）采血测效价，决定是继续加强免疫还是冲击免疫后做融合。

较好的效价应该在10W以上，附表1 免疫接种时间表天数操作佐剂免疫方式0 初次免疫CFA 皮下14 第二次免疫IFA 皮下28 第三次免疫IFA 皮下36-38 收集血清测效价＿＿42 第四次免疫（如果需要）IFA 皮下50 收集血清测效价＿＿52 融合前冲击免疫＿腹腔55 收获脾细胞和融合＿＿注：如果第四面免疫血清效价仍然达不到要求可以继续加强免疫，如果免疫超过6次仍然达不到要求免疫基本失败。

单克隆抗体制备主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、单抗的鉴定及制备等。

1 动物免疫根据抗原的特性选择合适的免疫方案，对于可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂。

常用佐剂为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。

要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状。

（1）初次免疫，Ag50ug/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，一般1.5ml,间隔3周。

（2）第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔3周。

（3）第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7天后采血测其效价，检测免疫效果，间隔3周。

（4）加强免疫，剂量50ug，腹腔注射。

（5）3天后，取脾融合。

2细胞融合（1）饲养细胞的制备在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞小鼠腹腔巨噬细胞的准备：①用6-10 周龄的BALB/c小鼠。

②拉颈处死，浸泡于75%的酒精，消毒3min,用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。

用吸管注入6ml培养液，反复冲洗，吸出冲洗液。

③放入10ml离心管，1200rpm离心5min.④用20%小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为1*105/ml.加入96孔板，100ul/孔。

放入37度孵箱培养。

（2）骨髓瘤细胞的准备①于融合前48-36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养②融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。

③1000r/min离心5-10分钟，弃去上清。

④加入30ml不完全培养基，离心洗涤一次。

然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。

⑤取骨髓瘤细胞悬液，加0.4%台酚蓝染液作活细胞计数后备用。

（3）脾细胞的准备取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。

同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml 不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。

单克隆抗体制备步骤及注意事项制备步骤如下：1.免疫原选择：选择具有免疫原性的抗原作为单克隆抗体制备的靶点。

免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类等。

2.动物模型选择：根据免疫原的性质选择适合的动物模型，如小鼠、兔子等。

应考虑动物模型对免疫原的免疫响应情况以及制备成功的单克隆抗体的应用价值。

3.免疫原注射：将免疫原注射到动物模型体内，通常通过多次注射来诱导免疫反应。

在注射前，可以选择适当的佐剂来增强免疫原的免疫原性，如完全弗氏佐剂或委氏佐剂。

4.混合细胞瘤的制备：在免疫原注射后，等待免疫反应充分发生。

细胞瘤可用于细胞融合，产生融合细胞并筛选单克隆抗体。

常用的细胞瘤包括SP2/0和NS-15.细胞融合：将免疫小鼠脾细胞和癌细胞融合成杂交瘤细胞。

融合的常见方法有聚乙二醇融合法和电融合法。

6.肿瘤细胞筛选：将融合细胞播种在含有选择剂的培养基上，通过选择剂来杀死未融合细胞和不产生抗体的融合细胞，留下产生单克隆抗体的细胞。

7.单克隆抗体筛选：对产生的单克隆细胞进行筛选，常用的方法有ELISA和细胞免疫荧光检测。

8.单克隆抗体培养：将筛选出的单克隆细胞进行扩增培养，获得大量的细胞。

9.单克隆抗体纯化：将培养得到的细胞培养上清进行蛋白A/G亲和层析柱纯化，获得纯化的单克隆抗体。

10. 单克隆抗体鉴定：通过Western blot、免疫组化或其它适当的方法对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性和亲和力。

注意事项如下：1.免疫原的选择应根据具体实验要求合理选择，确保其免疫原性和制备成功的单克隆抗体的应用价值。

2.在注射免疫原前，应充分考虑动物模型对所选择免疫原的免疫响应情况，并进行充分的预备实验和试验。

3.免疫小鼠注射免疫原时，需要严格控制免疫原注射的剂量和频率，以避免过度免疫导致不良反应。

4.细胞融合时，应根据实验要求选择合适的融合方法，并注意细胞融合的时间和条件，以获得高效的细胞融合率。

5.单克隆抗体筛选和鉴定时，应使用多种合适的方法进行综合评估，确保获得特异性和亲和力较高的单克隆抗体。

单克隆抗体制备标准化操作方案第一章小鼠免疫小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。

好的免疫效果：血清效价达一万以上，脾脏粘连且大小是正常鼠的两倍以上。

小鼠的选择：选择与所用骨髓瘤细胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄在8～12周。

为避免小鼠反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。

免疫原：免疫原的纯度一般并不重要。

但有时免疫原纯度也会造成很大影响，若杂质存在使免疫反应减弱，或筛选方法不能区分对特意性成分反应的抗体及对杂质反应的抗体，以及有些抗原的免疫原性十分强，即便痕迹量的存在，也会影响对所识别抗原的免疫反应。

上述诸情况下使用纯化抗原会更有利。

常用的免疫方案：（一）可溶性抗原初次免疫： 50～100μg蛋白抗原加等体积福氏完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠，四周后进行第二次免疫第二次免疫：50～100μg（25～50ug，为初免剂量一半）蛋白抗原（与初免等量），加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多点注射，注射体积500μl/只小鼠两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价（用ELISA方法检测）效价达一万以上的小鼠融合前三天取抗原25μg（50～100ug，与初免剂量相同）加强免疫，尾静脉注射，注射体积200μl/只300ul/只，效价在一万以下的小鼠继续第三次免疫第三次免疫：50μg蛋白抗原加等体积福氏不完全佐剂乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射体积500μl/只，小鼠融合前三天取抗原25μg加强免疫，注射体积200μl/只。

（二）颗粒性（细胞）抗原可用5×106~2×107细胞与完全佐剂混合，作皮下或腹腔注射，2~3周后重复一次，但佐剂改为不完全佐剂，再待2~3周后用同样剂量细胞或半量细胞静脉注射，3~4天后取脾融合。

为挑选免疫反应较好的动物进行融合，第二次免疫后10天左右应从尾部取血，检查抗体滴度。

单克隆抗体研制的详细步骤一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。

常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。

一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。

即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。

因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。

因为常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来很多麻烦。

所以，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。

随着杂交瘤技术的诞生，这个目标得以实现。

1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。

这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。

通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。

与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。

单抗技术的问世，不但带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促动了众多学科的发展。

Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。

二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。

一、单克隆抗体的概念和原理免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要因素。

当动物体受抗原刺激后可产生抗体。

抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，各种抗原分子具有很多抗原决定簇，因此，免疫动物所产生的抗体实为多种抗体的混合物。

用这种传统方法制备抗体效率低、产量有限，且动物抗体注入人体可产生严重的过敏反应。

此外，要把这些不同的抗体分开也极困难。

近年，单克隆抗体技术的出现，是免疫学领域的重大突破。

（1）单克隆抗体的基本概念抗体主要由B淋巴细胞合成。

每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。

动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。

当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。

被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。

如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。

单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

（2）单克隆抗体技术的基本原理要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。

而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。

这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。

其制备原理示意如下：二、基本方法1. 抗原提纯与动物免疫对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。

如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。

可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。

选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。

单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具.制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前准备（一）免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。

一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0。

5ml ip (腹腔内注射）↓2～3周后第二次免疫1×10７／0。

5ml ip↓3周后加强免疫(融合前三天）1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)↓取脾融合2。

可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂,常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。

要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。

商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀.初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0。

8～1ml 0.2ml／点)↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│(ip剂量不宜超过0。

5ml）↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)↓2～3周后加强免疫，剂量50~500μg为宜，ip或iv↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。

单克隆抗体的制备一、单克隆抗体技术的原理B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。

B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。

将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。

这种技术即称为单克隆抗体技术。

制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。

采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T），在这种选择性培养基中，由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。

而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。

融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。

B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。

单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：①单一特异性，与一个抗原决定簇反应；②可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；③一经制出，可无限量地供应；④生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。

单克隆抗体与常规的血清抗体的性质比较,见下表:性质常规血清抗体单克隆抗体抗体含量少μg/ml 多 mg/ml无关的Ig 多少或几乎无其它血清蛋白有少，培养物上清常有10％胎牛血清Ag-Ab结合免疫原的全部成分的全部抗原决定簇免疫原中的一种成分的一个抗原决定簇特异性亲和力的重复性不同批号间有变化无变化与其它抗原的交叉反应与带有共同抗原决定簇的抗原有部分交叉一般无。