中药莲子心中总生物碱的提取及特征图谱研究资料

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本科毕业设计(论文)

中药莲子心中总生物碱的提取及特征图谱

研究

学院轻工化工学院

专业制药工程

年级班级2011级(3)班

学号3211001806

学生姓名练利芳

指导教师郑俊霞

2015年6 月

中药莲子心中总生物碱的提取及特征图谱研究

练利芳

梁华杰

轻工化工学院

摘要

目的:本实验是对莲子心药材中的化学成分进行初步分离,并对所得到的总生物碱成分进行HPLC分析,根据特征图谱来确定莲子心总生物碱的种类以及成分。相信随着科学技术的进一步发展,也会有越来越多的相关研究,能够早日实现其最大的药用价值。

方法:经过前期查阅文献从而确定本次实验方案,本实验将莲子心药材(10.5 kg)粉碎,加12倍80%乙醇,回流提取3次,每次2 h。合并提取液,浓缩至无醇味,浓缩液用1%盐酸调至pH = 3,纱布过滤;滤液加氨水调PH至9,二氯甲烷萃取,浓缩萃取液,得到暗黄色沉淀200 g,即为莲子心总生物碱部分。对莲子心总生物碱部分进行HPLC分析,探索总生物碱的HPLC分析条件,确定了最优的分析条件。在最优的分析条件下,建立了HPLC特征图谱。

结果:结合所得的特征图谱发现莲子心中所含生物碱成分远远多于文献报道的十几个化合物。这表明其中包含有大量结构未知的生物碱类化合物,需要进一步系统研究。

结论:通过此次实验所得到的实验数据,可以为莲子心总生物碱成分的探索和技术开发提供理论基础,为日后研究莲子心总生物碱的药理作用奠定基础。

关键词:莲子心,总生物碱,特征图谱。

Abstract

Objective:This experiment is to preliminary separate the chemical composition of Plumula,and HPLC analysis the total alkaloids,which make sure the kind and composition of total alkaloids separate from separate. I believe that with the further development of science and technology , there will be more and more relevant research , as early as possible to achieve its maximum medicinal value.

Method: After a preliminary literature review to determine this experimental program , This experiment crushed the Plumula(10.5 kg),added 12 times 80% ethanol to the powder,refluxed and extracted them three times,each time two hours.And combined the extract,concentrated it until we could’t smell the taste of alcohol, the concentrate was adjusted to pH=3 with 1% hydrochloric acid, then filtered with gauze. The filtrate was adjusted to pH=9 with ammonia, the solvent extraction with dichloromethane,concentrated the extracts, we got 200g dark yellow precipitate., which was the total alkaloids of plumula. After a HPLC analysis to the total alkaloids, explored the analytical conditions of HPLC, made sure the best of the analytical conditions of HPLC.The characteristic spectrum was bulit in the best of the analytical conditions of HPLC.

Results: It was found that the kind of alkaloids in Plumula contained far more than reported in the literature through the result of characteristic spectrum.It indicated that the Plumula contains a large number of unknown structure of alkaloids.

Conclusion:The experimental data obtained in this experiment may provided a theoretical basis for the exploration and technology odevelopment of Plumula total alkaloids, and lay the foundation for future study of the pharmacological effects .

Keywords : Plumula, total alkaloids, the characteristic spectrum.

目录

1 绪论 (1)

2 理论基础 (2)

2. 1 植物莲的简介 (2)

2.1.1 莲子的药食同源 (3)

2. 2 莲子心的研究简介 (3)

2.2.1 莲子心的植物基源 (4)

2.2.2 莲子心的鉴别 (4)

2.2.3 莲子心的化学成分 (4)

2.2.4 莲子心的临床运用 (4)

2.2.5 莲子心的发展瞻望 (6)

2.3 莲子心总生物碱研究 (6)

2.3.1 生物碱 (6)

2.3.2 莲子心的生物碱 (7)

2.3.3 莲子心生物碱的药理作用 (8)

2.3.4 莲子心总生物碱的提取 (9)

3 实验部分 (13)

3.1 药材 (13)

3.2 化学试剂 (13)

3.3 仪器原理介绍 (13)

3.3.1 超声清洗器 (13)

3.3.2 旋转蒸发仪 (14)

3.3.3 高效液相色谱仪 (14)

3.4 实验操作 (15)

3.4.1莲子心总生物碱的提取 (15)

3.4.2总生物碱HPLC的分析的研究 (16)

4 结果与分析 (16)

4.1总生物碱HPLC的分析的研究 (16)

4.1.1探究总生物碱HPLC的特征图谱检测波长选择的结果 (16)

4.1.2探究优化总生物碱HPLC的分析条件的结果 (16)

4.2总生物碱特征图谱的结果 (18)

4.3展望 (18)

参考文献 (21)

致谢 (23)

1. 绪论

随着人们生活水平提高,保健意识增强,莲子心作为天然保健品已走入了寻常百姓家,用量急剧增加。据相关部门对中国30个城市中药材、保健品、食品三个市场调查显示,从1999年至2015年,莲子心市场需求逐年增加,价格连年上涨。我国莲子总产量10万吨左右,从中所得莲子心据初步估算约1 500 t[1]。据目前研究报道的莲子心主要成分有生物碱、生物碱类化合物、甾醇类、此外莲子心中还含有水溶性多糖成分及锌、铜、铁、钙、镁、钠、钾、镍、锰、镉等微量元素。通过现代药理的研究,可以发现莲子心具有清心安神,交通心肾,涩精止血等疗效,用于治疗热入心包,神昏谵语,心肾不交,失眠遗精,血热吐血的症状。莲子心自被发现可入药以来,凭借其药效显著,就一直在中药中占据着非常重要的地位。在历史的医书药典中,因其具有非常高的营养活性和药用价值而被广泛应用。

近一个世纪以来,随着科技的日益发达,学者们对莲子心生物碱类成分进行了大量的生物活性和体内药物学等方面的研究。为进一步探明莲子心中主要化学成分的类型及结构,也可以为莲子心生物碱类成分的探索和技术开发提供坚实的基础,为日后研究总生物碱的药理学提供支持,实现莲子心药用价值的最大化。由于莲子心产地又遍布全国各地,因此确定其产量相对较大的地区作为产品开发的药材资源提供了便利的条件。

本试验是对莲子心药材中的化学成分进行初步分离,对莲子心总生物碱部分进行HPLC分析。通过探索总生物碱的HPLC分析条件,确定了最优的分析条件:甲醇(A)-水(1‰氨水)(B)梯度洗脱:0-5-15-40-50 min,40-50-60-80-100 A%。并在最优的分析条件下,对总生物碱部分建立HPLC特征图谱进行分析,结果发现莲子心中所含生物碱成分远远多于文献报道的十几个化合物。这表明其中包含有大量结构未知的生物碱类化合物,需要进一步系统研究。为早日实现莲子心的药用价值最大化提供研究基础,造福百姓。

2.理论基础

2.1植物莲的简介

我国莲栽培约有3 000年历史,自生或栽培于池塘内,至今在南北各地均有种植。莲(Nelumbo nucifera Gaertn)为睡莲科莲属多年生水生草本,原产印度和中国。莲生于水泽、池塘、湖沼或水田内,有野生或栽培。长江流域以“清明”前后最适宜。北方4月下旬均可栽培。若用莲子种植,5到7月也可种植。栽植地必须保持每天有10小时以上的光照。此外,荷花易被草类等鱼类吞食,因此在种植前,应先清除湖塘中的有害鱼类,并用围栏加以围护,以免鱼类侵入。

我国莲资源丰富,分布广泛,种类繁多,开发潜力巨大。我国莲的主要品种有:湖南安乡的湘莲;福建建宁的建莲;江西鄱阳的红花和白花子莲;江苏吴江的青莲子等。莲的部位分莲子、荷叶、莲子心,荷梗、藕节、莲须、还有石莲子等。莲通身都可入药,夏季的常用药就有荷叶、莲子肉、藕节、莲子心等等。

(1)荷叶的采收与功效

荷叶为莲的叶,是生水生草本植物。6~7月花未开放时采收,除去叶柄,晒至七八成,对折成半圆形,晒干。夏季亦用初生嫩叶或鲜叶。荷叶具有清热解暑,升发清阳,凉血止血的功效,用于暑热烦渴,脾虚泄泻,暑湿泄泻,便血崩漏。荷叶炭可以收涩化瘀止血,治疗多种出血症及产后血晕,是临床上必不可少的常用药。此外,源于荷叶可以去除体内蓄存的痰湿,从而达到排毒轻身的效果,具有的减脂轻身的功效,更是深受女性朋友和“三高”人群的青睐。

(2)莲肉的形状与功效

在夏末初秋的时节,街头小巷买到的新鲜的莲蓬,掰开墨绿色的莲蓬抠出嫩绿色的莲子,再剥开那层嫩绿色的外皮就是莲子肉了。新鲜的莲子肉水吃起来有淡淡甜味,清新的气息充盈于口腔,是一道美味佳肴。晒干的莲子肉可以作为食材也可以入药,莲子肉鲜者甘平,干者甘涩平,具有补脾止泻,益肾涩精、养心安神的功效。人们餐桌上常吃的莲藕也是来源根茎。

(3)藕的形状与功效

藕性味甘温,能健脾开胃、益血补心。故有主补五脏,有消食、止渴、生津的功效。制成藕粉是妇孺和体弱多病者的滋补佳品。莲须为花的雄蕊,具有固肾

涩精的功效,也是一味比较珍贵的中药。

2.1.1莲子的药食同源

无论是从药品还是从食品的角度来看,莲子心的临床运用前景很广阔,很具有开发价值。药食同源是莲子心的重要的特性,中国人民不仅将莲子与其他药物配伍治病,更在日常生活中,用莲子做成莲子汤、莲子羹、莲子糕、莲子酥、莲蓉、莲子罐头、冰糖莲子等,还把莲子和其他食物炖煮成莲子红枣汤、莲子银耳汤、八宝粥、八宝饭等等。以下都是一些在寻常百姓家常见的食疗案例。

(1)莲子百合麦冬汤

莲子百合麦冬汤是用莲子(带心)、百合各30克、麦门冬12克,加合适的水煎服而成。麦门、百合冬是味甘微寒之品,具有清心宁神的效果。用于病后余热未尽,心阴不足,心烦口干,心悸不眠脾虚腹泻,小便淋浊,妇女带下,尿频等症状。

(2)莲肉糕

莲子肉、糯米(或大米)各200克炒香,茯苓100克(去皮),共研为细末加白糖适量,然后一同拌匀,加水至泥状,蒸熟待冷后压平均块即成。茯苓可以补脾利湿药,味甘平,与莲子肉、糯米同蒸糕食,增加补脾益胃的功效。用于治疗亚健康者脾肾虚弱、饮食不化、大便稀溏等症状。

(3)健脾益胃散[2]

白术、薏苡仁、莲子肉、扁豆、芡实、山药各120克、人参15克(或党参60克)、茯苓10克,炒后研末即可。食用时可以加适量白糖。每次用15~30克,以鲜开水冲调服。这其实是去甘草的四君子汤,加入甘平补脾之物而成的处方。药性较平和,能健运脾胃,滋养补益。用于脾虚少食、小儿疳积消瘦、腹泻、肺结核病人肺脾两虚,也用于肾病者纳减、少气、咳嗽的症状。

类似于上述的关于莲的食疗法还有很多,这些食品中的莲子,也能或多或少产生保健作用。丰富的药食同源的中医药开启了中医食疗的大门,它们使中医在调理上跨越了行医的限制,进入一个安全,有效,无毒副作用的阶段,尤其是在治未病上,发挥着低成本,高效验的作用。

2.2莲子心的研究简介

2.2.1莲子心的植物基源

莲子心(Plumula nelumbinis)又名薏、苦薏等,为睡莲科植物莲的成熟的种子干燥幼叶及胚根。干燥的莲子心,呈细圆柱形,长1~1.4厘米。直径约0.2cm,幼叶绿色,有2个分歧,一长一短,卷成箭形,先端反折,两叶可见2片盾状卷曲的幼叶。中央的胚芽直立,长约2毫米。基部胚根黄绿色,略呈圆柱形,长33毫米。质脆,易折断,断面有多数小孔[3]。

2.2.2莲子心的鉴别

(1)莲子心的显微鉴别

方法:药材粉碎,过60目筛。取粉末制片,按常规的水合氯醛透化,观察淀粉粒不加热;其它特征需加热,均加甘油1滴,再加盖玻片封存,置显微镜下观察。

粉末特征:粉末灰绿色[1]。气微,味苦。①子叶:薄壁细胞呈长圆形或多角形,壁稍厚,有的作连珠状,隐约可见层纹域,纹孑L类三角形或稍延长,排列紧密。②叶肉:细胞呈类圆形,壁薄,细胞内含淀粉粒或绿色色素;③胚根:细胞长方形,排列整齐,壁菲薄,有的含脂肪油滴。④淀粉粒:众多,单粒椭圆形、广卵圆形或蚌壳形,长5~25 μm,直径5~13 μm,脐点点状、裂缝状或星状,层纹不明显;复粒少,2~3分粒。⑤表皮:细胞长方形,径向延长,壁薄。

(2)莲子心的理化鉴别

取本品粉末2g,加甲醇30 ml,超声处理30分钟,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇l ml使溶解,作为供试品溶液。另取莲心碱高氯酸盐对照品,加甲醇制成每lml含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层谱法(试验吸取供试品溶液4?6 μ1、对照品溶液4 μ1, 分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯烷-乙酸酯-二乙胺( 5 : 4 : 1 )为展开剂,展开,取出,晾干,喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中,在与对照色谱相的位置上,显相同颜的斑点[3]。

2.2.3莲子心的化学成分

莲子心药材存在着很多的有机成分和无机成分,同时又受到产地及各种生态因子等因素的影响,莲子心的各种化学成分跟含量也会有些不同。经过科学家们的漫长探索,莲子心的成分逐渐被发现。早在2 0 世纪6 0 年代, 国外已报道

莲子心中含有莲心碱(liensinine)、异莲心碱(isoliensinine)、莲心季铵碱(lotusine)、甲基莲心碱(neferine)、荷叶碱(nuciferine)、前荷叶碱(pronuciferine)、牛角花碱(lorusine)、甲基紫堇杷灵(methylcorypalline)、去甲基衡州悟乌药碱(demethylcoclaurine或higenamine)。前三者居多,这三者同属双苄基喹啉类生物碱。除上述的生物碱外,还有木犀草素、芦丁(rutin)[4]、金丝桃苷(hyperin)等黄酮类化合物[1]。

在后续的报道中,莲子心中的弱极性部位还存在棕榈酸,β-谷甾醇、β-谷甾醇正辛烷酸酯、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖甙等甾醇类化合物,有机酸类,挥发油类化合物[5-6]。另外,多种无机微量元素也在莲子心中被发现,如锌、铜铁、钙、镁、镍、锰、镉等[1]。

伴随着科学技术的进一步发展,人们赋予中药全新的认识,刺激着人们对中药的进行更加深入的探究。目前,对莲子心化学成分的研究也达到一定的高度,虽然对其中大部分的成分都已经较为熟悉,但是还是会有一些还有待认识开发的成分。因此,在前人的研究基础上,利用日渐臻美的科学技术,将莲子心的活性成分以及药用价值完全展现出来,这将是一笔巨大的人类医药财富。

2.2.4莲子心的临床运用

早在《本草纲目》中就记载莲子心能“清心去热”,在中药中的四气五味中就有明确地说明:苦,能泄、能燥、能坚。具有清心安神、交通心肾和涩精止血的功效。用于治疗热入心包,神昏谵语,心肾不交,失眠遗精,血热吐血。在民间,饮用莲子心茶有去烦清心,降血压、治失眠和便秘的作用[6]。

在临床上,当前某些莲子心中具有药用功能的成分,已做成制剂运用于临床,在治疗心血管系统、泌尿系统、血液系统、神经、精神系统等疾病上有显著的效果[7]。,如由莲子心合杜仲、玄参、牡丹皮、钩藤组成清心胶囊方,治疗高血压病34例,结果显示对轻、中度的高血压病患者具有比较好的降压作用,比单用卡托普利组更好;莲子心在治疗血液系统疾病方面,明显优于传统常规西药,以莲子心、竹叶、连翘等清心降火,与当归、茯苓、枣仁等配伍可补血、健脾、安神,基本治愈9例,缓解6例,明显进步3例;莲子心合黄连清心火配伍半夏、竹茹、石菖蒲、苍术、佩兰、胆南星等化痰开窍、芳香化浊。

2.2.5莲子心的发展瞻望

莲子心作为一种历史悠久的中药材,为人类在抵制疾病方面奠定了坚实的基础。实验研究和临床实践都已证实莲子心生物碱成分能够起到降压以及增抗心律失常机能的作用,还具有协同抗肿瘤作用等功能,从而深化了对莲子心传统疗效的认识。虽然伴着提取、分离、鉴别技术的发展而得到快速的认识,但是还有某些成分是未知的。我国莲子心资源丰富,开发潜力巨大,在利用莲子心这样具有广谱、高效、无副作用的天然资源方面,研发工作还是有欠缺的[2]。

如果能够确切地充分探究莲子心的成分,为莲子心的药理作用及作用机制的研究提供了支持,而作用机制又能够为临床治疗提供坚实的科学根据。这将能够很好的提高对莲子心的成分的认识以及莲子心生物碱药理作用的探究。中药莲子心总生物碱成分的提取与特征图谱研究这一课题,对开发利用中草药资源及实现莲子心药用价值的最大化有积极的意义。

2.3莲子心总生物碱研究

2.3.1生物碱

生物碱(alkaloids)是科学家研究最早的一类有生物活性的重要天然有机化合物[6]。1803年Derosne首先从鸦片中分离得到第一个生物碱那丁丁之后。科学家又陆续从植物中提取到其他生物碱。现在随着体天然产物的分离与结构研究的新方法、新技术的不断出现,大大加速了生物碱的研究过程。生物碱是一类存在生物体的含氮有机化合物,但是排除了氨基酸、蛋白质、肽及核酸、含硝基和亚硝基的化合物如卟啉类的一类化合物。目前,人们共识的生物碱至少应具备以下几个特点:结构中至少含有一个氮原子;一般不包括分子量大于1500的肽类化合物;是具有碱性和酸性的;氮原子来源于氨基酸或嘌呤母核或甾体与萜类的氨基化;排除上述简单定义中所有例外的化合物。

多数生物碱为结晶形固体,少数是无定形的粉末,个别生物碱为液态,如烟碱、毒藜碱、槟榔碱等。固体生物碱一般具有确定的熔点,极个别的生物碱也会出现双熔点的现象。生物碱多数具有苦味,有些味非常苦,如盐酸小檗碱等;有些生物碱具有辣味,如胡椒碱等;还有一些生物碱具有甜味。生物碱一般为无色,

少数具有较长共轭体系的生物碱而表现出各种颜色。生物碱的生理活性与其旋光性有关,通常左旋体的生物活性会较右旋体强[9]。

生物碱在不同溶剂中的溶解性能与结构中氮原子的存在状态、分子的大小、结构中的官能团的种类和数目以及溶剂的性质等因素有关。根据溶解性能可以分为亲脂性生物碱和水溶性生物碱,亲脂性生物碱易溶于苯、乙醚、卤代烷烃等亲脂性有机溶剂;在甲醇、乙醇、丙酮等亲水性有机溶剂也有较好的溶解度;但在水中溶解度是几乎不溶的。水溶性生物碱数目很少,主要包括季铵型生物碱及少数小分子叔胺碱,该类生物碱易溶于水、酸水和碱水,也可溶于甲醇、乙醇和正丁醇等极性大的有机溶剂,在极性小的有机溶剂几乎不溶解。有些生物碱的结构既具有碱性氮原子,又有酸性基团,如酚羟基、羧基等,这类生物碱称为两性生物碱。含酚羟基的两性生物碱类似于亲脂性生物碱,且可溶于苛性碱溶液,如药根碱、吗啡等。含羧基的两性生物碱常形成分子内盐,其溶解性类似于水溶性生物碱,如那碎因等。具有碱性的生物碱能和酸结合生成盐,生物碱盐一般易溶于水,难溶或不溶于亲脂性有机溶剂,可溶于甲醇或乙醇。有些生物碱盐又可溶于亲脂性有机溶剂,如奎宁、小檗碱等一些卤代季酸盐。

2.3.2莲子心的生物碱

关于莲子心的生物碱的研究从19世纪末开始就一直不断,富田真雄等人从荷叶里提取分离得到三个单体:荷叶碱、莲碱以及O-去甲基荷叶碱[3]。早在60年代 , 国外就报道了莲子心中含有莲心碱,异莲心碱,荷叶碱,莲心季铵碱,甲基莲心碱,除生物碱外,还有木犀草素、芦丁等黄酮类化合物。八十年代我国学者们,郭毛娣等对大陆产莲子心中酚性生物总碱进行研究,分离得到了莲心碱、莲心季铵碱、异莲心碱、荷叶碱以及前荷叶碱。还有潘竞先等从莲心中分离到2个新的化合物,经过鉴定,确定为S-N-甲基乌药碱,以及dl-杏黄罂粟碱[10]。

在分离提取莲子心生物碱方面,董兰等采用乙醇从莲子心中提取莲心总碱,经正交实验确定醇提取法提取的最佳工艺条件。刘产明等采用正交试验设计法,以莲子心总生物碱产率为指标,同时考察了其他7个条件因素,得出了莲子心总生物碱最佳提取工艺条件[11]。黄先菊等用2%HCl的酸液渗漉法提取莲心碱,简化了工艺,总收率为6%。用该方法提取得到的莲心碱与醇提法(0.57%)相当,减少了醇提时甲醇、乙醚等有机试剂对人体的危害,更符合工业化生产的要求,

但提取物有较多杂质,需有成熟的柱色谱分离方法配合,才能有高纯度产品[11]。

在测定莲子心生物碱含量方面,张先洲等用高效液相测定了莲子心中3种主要生物碱的含量,其中莲心碱、甲基莲心碱含量高于异莲心碱。寿国香等建立离子对RP—HPLC法测定十个产地莲子心中甲基莲心碱的含量,以莲心碱、异莲心碱和甲基莲心碱各峰都达到基线分离的基础,大大缩短了分析的时间[11]。2.3.3莲子心生物碱的药理作用

关于莲子心的研究,关于莲子心生物碱的研究是最多的,迄今为止,文献报道从莲子心中分离出11个生物碱类化合物, 且多为异喹啉生物碱[12-13]。莲子心的生物碱主要的活性成分是莲心碱、甲基莲心碱、莲心季铵碱、异莲心碱,我们就着重介绍一下莲子心这四种主要活性成分的药理作用。

(1)莲心碱的药理作用

莲心碱属于双苄基异喹啉类生物碱,有很好的抗心律失常[14]的作用。能显著预防乌头碱诱发的大鼠及哇巴因诱发的豚鼠心律失常;对抗肾上腺素所致豚鼠室颤发生;还对抗心肌缺血复灌所致大鼠心律失常有效。在莲心碱的酚羟基上引入亲脂性基团,经过其它修饰,抗心律失常的活性将显著增强。莲心碱有短时的降压作用, 若转变成季铵盐后, 降压作用能明显增强, 作用时间会延长。莲心碱能有效地抑制血管平滑肌细胞增殖,经研究表明与癌基因调控的分子生物学机制有关[14]。能显著减少缺血再灌注大鼠神经功能障碍和梗死体积比,保护实验性缺血。它还具有一定的抗艾滋病的活性[11]。

(2)甲基莲心碱的药理作用

甲基莲心碱是从睡莲科植物莲成熟种子的芽胚中提取的一种双苄基异喹啉生物碱。主要药理作用集中在保护心肌缺血、抗心律失常、再灌注损伤和抗血小板聚集等血管药理方面。同时,甲基莲心碱称得上是有效的植物来源抗氧化剂,具有清除氧自由基的功能,能保护氧自由基带来的血管内皮细胞损伤。在抑制多种诱聚剂诱导高脂血症患者和健康成人血小板聚集的功效上,甲基莲心碱的作用效果明显强于阿斯匹林。甲基莲心碱以浓度依赖方式显著抑制体外培养的瘢痕成纤维细胞的增殖,表现为潜在的抗增性瘢痕作用[15]。

(3)莲心季铵碱的药理作用

莲心季铵碱是一种水溶性单苄基异喹啉类季铵生物碱 ,化学式为 1 -二

甲基-6-羟基-7-甲氧基-10-苄基(对-羟基)四氢异喹啉。莲心季铵碱有强而持久的降压作用[16-17],机制可能是增加L型通道的可利用度,从而促钙内流。莲心季铵碱剂量依赖性地增加离体心肌的收缩力,其正肌作用机制除与PDE Ⅲ抑制有关外,还与延长动作电位时程,促钙内流有关。它还具有扩张血管,提高血小板环核苷酸的含量,也能提高心肌及阴茎海绵体的环核苷酸含量的功能。莲心季铵碱无明显的抗心律失常作用,但对绿脓杆菌有一定的抑菌作用。

(4)异莲心碱的药理作用

异莲心碱是从中药莲子心分离出来的双苄基喹啉生物碱单体,主要的药理作用也是集中在心血管方面。异莲心碱改善了结扎性的左心室肥大的纤维化、心脏重量、心功能等,表明其能够有效地减轻心脏肥厚程度和保护心脏[18}。异莲心碱能清除氧自由基,有体外抗氧化效能,能减轻脂质过氧化损伤的作用。王辉等人的实验研究表明对红细胞和肝组织细胞及亚细胞膜性结构有保护作用[19]。2.3.4莲子心总生物碱的提取

传统的生物碱的提取方法是建立在生物碱的理化性质,尤其是对于不同溶剂包括:碱、酸等的溶解性能的基础上的。一般来说,绝大多数生物碱是利用溶剂提取法和离子交换树脂法进行提取的,少数具有挥发性的生物碱可用水蒸气蒸馏法,具有升华性的生物碱可采用升华法。

(1)溶剂法

溶剂法是常用的方法,一般包括:水或酸水-有机溶剂提取法,醇-酸水-有机溶剂提取法,碱化-有机溶剂提取法等等。

水或酸水-有机溶剂提取法:提取原理是生物碱盐类易溶于水,难溶于有机溶剂;而游离碱易溶于有机溶剂,难溶于水。可直接用0.5%?1%的无机酸水来提取。常用的酸有盐酸、醋酸、硫酸或酒石酸等。可用浸渍法、渗漉法,提取液浓缩到一定体积后,再用石灰乳或氨水等碱化,使生物碱游离出,然后用苯或氯仿萃取,再浓缩萃取液得到亲脂性总生物碱。该提取法简单易行,但是水溶性杂质较多,浓缩纯化较困难[20]。

醇-酸水-有机溶剂提取法[21]:本方法是依据生物碱及其盐类易溶于甲醇或乙醇,实验室或工业一般采用乙醇,提取方式可以是浸渍法、渗漉法或回流法[22]。

先将提取液浓缩至一定体积,加酸水酸化,过滤,所得的滤液分别用氨水或石灰乳碱化,用氯仿、苯等有机溶剂萃取,浓缩萃取液得到中等碱性或强碱性总生物碱。对于酚性生物碱,也可以在酸水溶液分别加1%?2%氢氧化钠,碳酸氢钠溶液处理,然后用有机溶剂萃取,从而达到初步分离的效果。醇提法的优点:醇提取液易浓缩[23]。

碱化-有机溶剂提取法:将植物材料用10%氨水或石灰乳充分润湿,使其以盐形式存在的生物碱游离出来,然后用有机溶剂(氯仿等)提取,再浓缩回收溶剂,得到亲脂性总生物碱。弱碱性总生物碱的提取除是用水或稀有机酸润湿外,其余操作都相同。本法所得的总生物碱较纯净,但是存在提取时间较长、溶剂毒性大、易燃,有时候提取不完全的缺点。

(2)离子交换树脂法

离子交换树脂法有很重要的实用价值。许多药用植物如奎宁、东莨菪碱、咖啡因等都是应用此法生产的。该提取法的过程是将酸水提取液与磺酸型阳离子树脂交换,使生物碱盐类的阳离子被交换而吸附,一些不能离子化的杂质则随溶液流出,从而分离出来,交换后的树脂,用碱水或10%氨水碱化。再用有机溶剂如乙醚、氯仿等进行洗脱,回收溶剂,得总生物碱。

(3)沉淀法

季铵生物碱极性大,易溶于水和碱水中,除离子交换树脂法外,往往很难用一般溶剂法将其提取出来,此时常常采用沉淀法提取。该法提取过程:将季铵生物碱水溶液调至弱酸性,加入新鲜配制的雷氏铵盐至不再出现沉淀为止,再过滤取沉淀,抽干后溶于丙酮或乙醇,过滤,滤液中加饱和Ag2SO4,形成雷氏生物碱复盐沉淀,再一次过滤,于滤液中加入适量氯化钡溶液,过滤除去沉淀,最后所得滤液即为季铵生物碱的盐酸盐。

(4)超临界流体萃取法(SFE)

该法的提取原理:由于超临界CO2是非极性溶剂,所以能够很好的溶解非极性和分子量较低的极性物质,但是较难溶解极性比较强的物质。为降低成本,所以在实际操作过程当中,常常会在超临界CO2中加入另一种能够改变其极性物质。被加入的这种物质称为夹带剂。日用使用的夹带剂有主要有甲醇、水、乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯等不同极性的物质。该法提取效率更高,而且不

会有残留溶剂污染的危险,尤其是活性成分和热不稳定成分不会被分解破坏,还可以有选择性的提取和分离纯化,而且溶剂和溶质便以分离。

(5)大孔吸附树脂法

大孔吸附树脂法近年来广泛用于天然产物有效成分的分离、纯化,是分离有机化合物尤其是水溶性化合物的有效手段[23]。一般操作为:将植物原料用醇类溶剂或酸水提取后,回收溶剂,加水溶解,通过大孔吸附树脂柱,用少量水洗柱体,然后用含酸水或水醇洗脱,浓缩洗脱液,得到总生物碱。

2.3.5莲子心生物碱的分离

采用上述方法提取得到的总生物碱,大多数情况下是一些结构十分相似的生物碱混合物,如果想了解莲子心中生物碱的种类和结构,往往需要进一步的分离。我们主要是利用待离分生物碱之间的结构、理化性质差异来进行生物碱单体的分离。例如:利用生物碱碱性的差异进行分离,如:pH梯度萃取;利用生物碱及其盐的溶解度不同进行分离;利用生物碱的特殊官能团进行分离等等。

由于莲子心原料中所含生物碱种类繁多,而且它们的结构和性质又比较相近。采用上述的方法往往不能完全地分离,需利用色谱分离法得到生物碱单体。以下就是常用的色谱分离法。

(1)薄层层析法(TLC)

薄层层析法一般可分为离心薄层层析和制备型薄层层析,离心薄层层析可以在较短时间内快速分离大量的物质,还可以替代制备型的薄层层析,甚至在一些情况下还能替代柱层析;相对离心薄层层析而言,制备型薄层层析较常使用在小量的纯化处理上。

(2)硅胶柱层法

硅胶为一多孔性物质,分子中具有硅氧烷的交链结构,同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅胶柱层析法是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离,一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附,极性较弱的物质不易被硅胶吸附,整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。硅胶柱层析法的操作步骤:装柱(柱子必须装平整、均匀),加样,洗脱剂的选择(根据根据TLC方法筛选好洗脱剂,使两相邻物质Rf值之

差最大化),样品的收集,最后的处理。

(3)高效液相色谱法(HPLC)

HPLC正相系统的固定相一般是硅胶柱和氨基柱,反相系统的固定相则有C2 柱、C8 柱、C18柱、苯基柱及氨基柱等。由于乙腈有剧毒,所以一般会选择使用甲醇—水系统作为流动相,并添加少量的酸 (乙酸、甲酸) 用来改善分离的效果,防止出现拖尾。虽然跟纸色谱、柱色谱、薄层色谱相比较,HPLC的分离效果更理想,但HPLC分离的成本比上述几种方法要高得多,所以HPLC更多时候是应用在生物碱类化合物的定量分析、定性检测或少量样品的制备等方面。

在实际工作中,往往由于植物中生物碱种类很多、结构相似,仅仅依靠某一种方法很难得到生物碱单体,一般需要采用几种方法配合应用才能取得良好的分离效果。

3 .实验部分

3.1药材

实验药材:莲子心药材(10. 5kg)

3.2 化学试剂

乙醇,盐酸,氨水,二氯甲烷,甲醇(以上试剂均为分析纯);色谱甲醇(色谱纯),超纯水。

3.3 仪器原理介绍

表3.3主要实验仪器

名称型号/规格生产厂家

TD低温微型提取浓缩机组TD-200中国温州天众机械制造有限公司超声清洗器KQ-5200E昆山市超声仪器有限公司

高压四元泵带真空脱气机DGU-20A5日本岛津仪器有限公司

高压泵LC-20AT日本岛津仪器有限公司

系统控制器CBM-20A日本岛津仪器有限公司

自动进样器SIL-20A日本岛津仪器有限公司

旋转蒸发仪EYELA上海亚荣生化仪器

循环水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)巩义市子华仪器有限责任公司高效液相色谱仪LC-20AT日本岛津仪器有限公司

3.3.1超声清洗器

超声清洗器应用广泛,在生化,物理,化学,医学,科研及大专院校的实验中可作提取,脱气,混匀,细胞粉碎等等之用。主要由超声波清洗槽和超声波发生器两部分构成。超声波清洗槽用坚固弹性好、耐腐蚀的优质不锈钢制成,底部安装有超声波换能器振子。超声波发生器产生高频高压,通过电缆联结线传导给换能器,换能器与振动板一起产生高频共振,从而使清洗槽中的溶剂受超声波作用对污垢进行洗净。

工作原理:由超声波发生器发出的高频振荡信号,通过换能器转换成高频机械振荡而传播到介质清洗溶剂中,超声波在清洗液中疏密相间的向前辐射,存在于液体中的微小气泡在声场的作用下振动。这些气泡在超声波纵向传播的负压区形成、生长,而在正压区,当声压达到一定值时,气泡迅速增大,然后突然闭合。

并在气泡闭合时产生冲击波,在其周围产生上千个大气压,破坏不溶性污物而使分散于清洗液中,当团体粒子被油污裹着而黏附在清洗件表面,油被乳化,从而达到清洗件净化的目的。在这种被称之为“空化”效应使物件的表面及缝隙中的污垢迅速剥落,从而达到物件表面清洗净化的目的。

3.3.2旋转蒸发仪

旋转蒸发器主要用于医药、化工和生物制药等行业的浓缩、结晶、干燥、分离及溶剂回收。其结构为:蒸馏烧瓶是一个带有标准磨口接口的梨形或圆底烧瓶,通过一个高度回流蛇形冷凝管与减压泵相连,回流冷凝管另一开口与带有磨口的接收烧瓶相连接,用于接收被蒸发的有机溶剂。在冷凝管与减压泵之间有一个三通活塞,当体系与大气相通时,可以将蒸馏烧瓶,接液烧瓶取下,转移溶剂,当体系与减压泵相通时,则体系应处于减压状态。

工作原理:通过电子板控制,使蒸发烧瓶在最恰当的速度下,恒速旋转用来增大蒸发面积。同时,通过抽真空水泵使蒸发烧瓶处在负压状态。将蒸发烧瓶放在水浴锅中恒温加热并旋转,瓶内溶液处在负压状态下在旋转烧瓶内进行加热扩散蒸发。旋转蒸发器系统可以密封减压至400~600毫米汞柱;用加热浴加热蒸馏瓶中的溶剂,加热温度可非常接近该溶剂的沸点;此外,在高效冷却器作用下,可将热蒸气迅速液化,加快蒸发速率。

3.3.3高效液相色谱仪

高效液相色谱仪是使用高效液相色谱法对物质进行定性检测以及定量分析的一种仪器。它的填料颗粒虽然相对较小但每粒都较均匀,小颗粒会引起高柱效应,但也会增加较高的阻力,所以要用到高压来输送流动相,因此才又被称高压液相色谱。

高效液相色谱法是现在最经常应用的一种色谱分析方法,高效液相色谱的系统是由流动相储液体瓶、检测器、输液泵、色谱柱、进样器和记录仪构成,它的整体构造跟气相色谱很相似,但由于其流动相是液体,所以在很多方面都进行了改良。因为液体流动相的粘度远比气体的要大的多,所以为了能够控制柱压,高效液相色谱的色谱柱会显得更粗大,但长度却要远比气相色谱柱小得多。

工作原理:高压泵将储液器中的流动相送入到系统,用进样器将样品溶液送