最优考马斯亮蓝染色Protocol

质谱酶解protocol固定染色1、跑胶结束。

2、固定液（50%水+40%冰乙酸+10%甲醇），固定半小时以上.3、纯水洗4次，每次洗10min。

4、考马斯亮蓝染色过夜（6小时以上）。

5、倒染色液回回收瓶，纯水洗4次，每次10min。

切胶6、平行切胶（对照、实验组同一水平线）。

7、50%甲醇（200ul）清洗胶块1次。

酶解溶液配制：25mM 碳酸氢铵：先配置100 mM 碳酸氢铵（储液，称取79.6mg溶于10ml Q水混匀溶解），稀释四倍即可；脱色液：25mM 碳酸氢铵+50乙腈+Q水；还原试剂：10mM DTT（可先配制100mM 浓度的储液，称取15.42mg 溶解在1ml 25mM 碳酸氢铵中,稀释10倍体积用）烷基化试剂：55mM IAA （可先配制550mM 浓度的储液）口罩，帽子，工作服一件都不能少！！尽可能避免人为污染酶解脱色8、25mM 碳酸氢铵洗掉甲醇，9、脱色：50%乙腈+25/50mM碳酸氢铵振荡30s，室温静止15min。

10、加入100%乙腈11、重复8、9、10 直到胶块成无色.12、加50ul ，25mM 碳酸氢铵，吸胀胶，吸净buffer。

13、加100ul 100%乙腈脱水后，吸净乙腈，存放4℃14、100ul 100%乙腈脱水（不过夜可省略）。

15、100mM，DTT 50ul（用50mM 碳酸氢铵配），56℃，1h。

16、55mM碘乙酰胺（IAA）室温45min（避光）17、洗干净后，25mM 碳酸氢铵洗1次。

18、50%乙腈+50mM碳酸氢铵洗1次。

19、100%乙腈脱水（100ul）。

20、50ul ，25mM 碳酸氢铵，吸涨。

21、17、18、19步骤重复2次。

22、100%乙腈脱水(尽可能脱干)。

7加酶覆盖液：10乙腈+Q水；酶液：覆盖液中加入质谱级胰酶，工作浓度为10nmol 。

23、加酶（胰酶，EDTA）20ul-10ul依胶大小而定，吸胀后，除去多余酶液24、加适量覆盖液（60ul-100ul，视胶块大小），37℃水浴过夜。

考马斯亮蓝G250染液的配制
1R250。

2100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90%乙醇中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。

此溶液在常温下可放置一个月。

310mg G-250，溶于5mL的95%乙醇中，此时溶液为蓝色，再加入了10mL的85%的磷酸，溶液为血红色，可是加水定容到100mL时又成为了蓝色，据文献说应该是褐色，原因：配置溶液的容器未洗干净，可能沾有蛋白质类药品。

用乙醇把容器全部认真的洗干净后重配，不过配好之后需要过滤才可以用。

4中文名为考马斯亮蓝G250，简称G250，分子式为C47H48N3O7S2Na，分子量为854.02，分析纯。

考马斯亮蓝G250是常用蛋白染色剂，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。

蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质一色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。

5中文名为考马斯亮蓝R250，简称R250，分子式为C45H44N3O7S2Na，分子量为825.97，考马斯亮蓝R250是常用蛋白染色剂，可用于染色丙烯酰氨凝胶和琼脂糖凝胶中的蛋白质。

6、考马斯亮蓝G250和R250都可以作为染色剂，不同的配方、不同的染色方法适合于不同性质的蛋白质。

7、考马斯亮蓝分为G250、R250和R350等，R为红蓝色，G为蓝绿色。

例如考马斯亮蓝G250即二甲花青亮蓝。

考马斯亮蓝染色的原理和方法考马斯亮蓝染色的原理和方法在蛋白质染色方法中，目前以考马斯亮蓝染色最为常用。

因为它既克服了氨基黑染色灵敏度不高的限制，又比银染简便易操作。

考染的历史考马斯亮蓝染色最早由Fazekas等在1963年用于醋酸纤维素膜电泳，并认为同样可用于纸电泳，琼脂糖电泳和淀粉凝胶电泳。

1965年Meyer等将此方法应用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。

考染的灵敏度考马斯亮蓝染色可以达到0.2~0.5 μg（200~500 ng），最低可检出0.1 μg蛋白；银染的灵敏度比考染高将近100倍，最低可以检出2 ng蛋白。

通过考染条带的深浅粗细，可以大致判断该条带有多少蛋白，如在8.6×6.8 cm（W×L）?.75 mm厚的胶上15~20 μg蛋白大约是下面这样的条带：考马斯亮蓝染料的种类考马斯亮蓝分为R-150、R-250、R-350、G-250等。

其中R-350最为灵敏，R为红蓝色，G 为绿蓝色。

R-250即三苯基甲烷，每个分子含有两个SO3H基团，偏酸性，与氨基黑一样也是结合到蛋白质的碱性基团上。

G-250即二甲花青亮蓝，是一种甲基取代的三苯基甲烷。

推荐一种考染的方法⑴电泳后的凝胶立即浸泡在固定液（500 ml 乙醇，100 ml 冰醋酸，400 ml 蒸馏水）中至少30 min，如有必要可在固定液中浸泡过夜；⑵将固定后的凝胶在热的染色液（0.29 g 考马斯亮蓝溶解在250 ml 脱色液中，在使用前边搅拌边加热至60℃）中浸泡10min，然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次；⑶多次变换脱色液（250 ml 乙醇，80 ml冰醋酸，加蒸馏水至1 L），直至凝胶背景脱净为止，为加快脱色，可略加温度；以上各步最好用振荡器（摇床）震荡染色皿。

⑷为了防止凝胶干燥后的龟裂，脱去背景色的凝胶在保存液（25 ml 87% 甘油加225 ml 脱色液）中浸泡30min。

然后将凝胶放在玻璃板上，再用保存液浸湿玻璃纸包住凝胶在室温下晾干。

考马斯亮蓝染色推荐选用前三种染色方法,另有传统考马斯亮蓝染色法和网上经验,染色效果不好,不推荐使用,仅供参考;见后页比对照片操作步骤：1、取出SDS-PAGE凝胶,经超纯水漂洗；以下每步操作皆在摇床上进行;2、固定：将凝胶放入相应的固定液中,固定1小时；3、染色：取出凝胶,放入相应的染色液中,过夜染色；也可依实际情况缩短时间4、脱色胶体法&改良法：凝胶放入纯水中洗脱,换液数次；脱色Neuhoff法：取出凝胶,用M Tris-H3PO4缓冲液漂洗2分钟;再用25%乙醇淋洗＜1 min;然后再用10%乙酸中在室温脱色2小时即可;试剂的配制：1、胶体考马斯亮蓝染色法colloidal Coomassie brilliant blue,cCBB：固定液：40%甲醇、10%乙酸染色液：%磷酸、8%硫酸铵、% CBB-G250、20%乙醇脱色液：H2O2、改良考马斯亮蓝染色法modified Coomassie brilliant blue,mCBB：固定液：40%甲醇、10%乙酸染色液：10%磷酸、10%硫酸铵、% CBBG250、20%乙醇着色1小时即可;脱色液：H2O3、Neuhoff染色法：固定液：12%三氯醋酸染色液：2%磷酸、10%硫酸铵、% CBB-G250、使用前振摇;染色时,取一定体积的染色液,加入1/4体积的甲醇;脱色所需：M Tris-磷酸缓冲液、25%乙醇、10%醋酸4、传统考马斯亮蓝染色法：固定液：%甲醇、%乙酸染色液：%甲醇、%乙酸、% CBB-G250脱色液：5%甲醇、%乙酸5、网上方法：固定液：40%甲醇、10%乙酸染色液：30%甲醇、10%乙酸、% CBB-G250脱色液：30％甲醇,10％乙酸比对照片：每块胶左道是Marker质量原因,未跑开ˇˇ 上样量5μl,右道是BSA分子量68kDa,上样量为3μg.-Neuhoff法传统法胶体法改良法网上法。

考马斯亮蓝染色总结考马斯亮蓝染色是一种广泛应用于生物学实验中的染色技术，它可以用于检测许多不同的分子和细胞类型。

这种染色方法是法国生物学家Louis-Charles Malassez于1867年发明的，后由德国生物学家Richard Kuhn于1933年进行改良，使其成为现代生物学实验的标准技术之一。

本文将对考马斯亮蓝染色的方法、应用以及优缺点进行总结。

一、方法考马斯亮蓝染色的原理是，亮蓝染料可以与DNA的碱基对结合而形成复合物。

这种染色技术需要一些基本试剂，包括亮蓝染料、甲醛、醋酸以及石蜡等。

具体操作步骤如下：1. 取需要染色的细胞或组织样本，用生理盐水进行清洗；2. 将样本固定在载玻片上，用甲醛和醋酸进行固定处理；3. 将载玻片在70％乙醇和95％乙醇中依次浸泡，以去除固定剂；4. 在50％和75％醇溶液中浸泡数分钟，使样本逐渐变暗；5. 用亮蓝染料染色，通常需要在100倍和400倍低倍镜下观察。

二、应用考马斯亮蓝染色可以用于检测DNA、RNA、核蛋白和细胞质等细胞成分。

在分子生物学实验中，考马斯亮蓝染色被广泛应用于检测DNA条带的大小、纯度和含量。

此外，它还可以用于细胞形态和结构的观察，如观察细胞核、染色质和核仁等。

在医学领域中，考马斯亮蓝染色可以用于检测肿瘤、癌细胞、炎症细胞和血液样本等。

从组织样本中提取DNA或RNA 时，也会使用该染色技术。

三、优缺点优点：1.对许多不同类型的细胞和分子具有高度灵敏度和特异性。

2.操作简便，仅需要一些基本试剂和设备。

3.观察结果清晰，可以展示细胞组织的形态和结构。

4.染色技术稳定性好，结果可复制性高。

缺点：1.过程中可能会使样本遭到破坏或溶解。

2.亮蓝染料可能与背景杂质结合，导致结果不准确。

3.需要专业人员进行染色和观察，较为复杂。

4.染色后，样品无法再进行分子生物学的使用，比如PCR 反应等。

结语：考马斯亮蓝染色是一种简便、灵敏并且重要的分子生物学实验技术。

考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
原理:考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后,染料的最大吸收从465nm变为596nm,蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数,因此蛋白质测定的灵敏度较高,最低检出量为1ug蛋白质.染料与蛋白质的结合,大约只需2min,结合物的颜色在1h内是稳定的.一些阳离子乙醇等物质不干扰测定,但去污剂严重干扰测定,少量的去污剂可通过用适当的对照而消除,犹豫染色法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高,现已广泛用于蛋白质含量的测定.
试剂:○1标准蛋白质溶液：可用牛血清清蛋白。

或根据牛血清清蛋白的紫外消光系数来确定
○2蛋白染色剂的配置：取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%愚蠢，假如100ml85%磷酸，将溶液用水稀释到1000ml。

试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%磷酸
操作：1.标准曲线的绘制
（1）取7支试管，分别假如0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，
1.4ml，1.6ml标准蛋白质溶液，用水不足到2ml
（2）去8支试管，0号加入0.1ml蒸馏水，1~7号试管一次加入0.1ml步骤（1）的标准蛋白质稀释液，然后各加入5ml
蛋白染色剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收
值。

以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标
准曲线作为定量的依据。

2.样品的测定
去样品溶液0.1ml，用制定标准曲线的方法测595nm光吸度，用标准曲线计算蛋白质的含量。

实验结果
测定所用的标准曲线方程为：v=0．1296x＋0．0907。

考马斯亮蓝G-250法测量蛋白质含量与凯氏定氮法相比较误差范围3％～8％。

考马斯亮蓝快速染色液产品编号产品名称包装P0017 考马斯亮蓝快速染色液 250ml产品简介：考马斯亮蓝快速染色液(Commassie Blue Fast Staining Solution)是以考马斯亮蓝G250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳胶的快速、高灵敏染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。

本考马斯亮蓝快速染色液是一种无毒，无刺激性气味的高度环保型染色液。

普通的常规方法需使用剧毒的甲醇及强刺激性的乙酸，而碧云天生产的考马斯亮蓝快速染色液则采取全新配方，实现了无毒和无刺激性气味。

本考马斯亮蓝快速染色液只需一小时或更短时间就可以检测到低达100ng的蛋白电泳条带，而常规方法需3小时以上。

本试剂盒可以进行高灵敏染色，最低可以清楚检测到10ng的蛋白电泳条带，参考图1。

蛋白上样量： 10μg 5μg 2μg 1μg 500ng 200ng 100ng 50ng 20ng 10ng 5ng 2ng 1ng图1. 使用碧云天的考马斯亮蓝快速染色液对不同上样量的BSA蛋白样品用10% SDS-PAGE胶电泳后的两次染色结果。

无需对蛋白和凝胶进行固定，可以不进行脱色，操作更加简单。

本染色液和质谱分析兼容，即经过本染色液染色的蛋白条带或蛋白点可以用于后续的质谱分析。

包装清单：产品编号产品名称包装P0017 考马斯亮蓝快速染色液250ml—说明书1份保存条件：4℃保存，一年有效。

注意事项：本染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，使用时请作必要防护。

如果使用微波炉加热，请特别注意避免沸腾。

以免因暴沸而导致凝胶碎裂。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：1. 电泳结束后，取胶放入约50-100ml蒸馏水中，在摇床上摇动5分钟，倒弃液体，再重复两次，共洗涤三次。

注：本步骤的目的是为了洗去凝胶中的SDS等干扰物质。

如果不能充分去除SDS会导致背景较高，如果胶非常厚，每次的洗涤时间需适当延长并且洗涤次数也需适当增加。

考马斯亮蓝染色总结考马斯亮蓝染色法是一种广泛应用于生物学及医学领域的染色技术，其主要作用是使细胞和组织的结构、形态和组成成分可见，从而帮助科学家们更好地进行观察、研究和分析。

在本文中，我们将对考马斯亮蓝染色法进行详细的介绍和总结。

1. 染色原理考马斯亮蓝染色法是以亮蓝G和甲基绿为主要染色剂，通过它们与细胞结构中的核酸和蛋白质发生亲和作用从而染色的。

亮蓝G主要染色细胞核及细胞质内的核糖体、蛋白质及其它细胞结构，而甲基绿则主要染色细胞质囊泡、线粒体等细胞质结构。

2. 染色方法考马斯亮蓝染色法的染色方法一般分为几个步骤：处理标本、脱水、清洗、染色、除色和封片。

下面我们将详细介绍每个步骤。

（1）处理标本：首先需要将待染标本进行处理，可以选择切片或制片方法制备，一般采用的是石蜡切片，用甲醛或卡尼液（一种带有防腐功能的溶液）固定标本，然后用甲醇或乙醇进行脱水。

（2）脱水：脱水是将固定的标本从水溶液中转移到乙醇（酒精）中，这个过程需要逐渐进行，不可以用高浓度酒精来快速脱水。

脱水的目的是防止固定的标本因含水过多而膨胀变形。

（3）清洗：将标本从酒精中取出后，需要清洗干净，以防止其中残留的酒精对染色的影响。

（4）染色：将标本浸入考马斯亮蓝染液中进行染色。

染色时间一般在几分钟至半小时之间，具体时间根据标本的大小和厚薄来决定。

（5）除色：染色过程结束后，需要将标本进行除色，以清除过多的染液，防止染色过重。

除色是用95%至100%的酒精进行。

（6）封片：染色和除色结束后，需要将标本封装在玻璃片上。

封装通常使用覆盖片和封片胶，将标本与玻璃片粘合在一起。

3. 染色结果经过考马斯亮蓝染色后，标本中的不同细胞结构会被染上不同颜色。

细胞核染成深蓝色，细胞质染成浅蓝色或颜色较浅，细胞质囊泡、线粒体等细胞质结构则呈现深绿色。

通过染色结果，我们可以清楚地观察到样本中不同结构之间的分布情况。

4. 应用领域考马斯亮蓝染色法广泛应用于生物学、医学及其它相关领域。