基因表达系统大肠杆菌表达系统

大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。

表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。

大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。

大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。

据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。

与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。

常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。

该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。

大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。

宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。

其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。

原核大肠杆菌蛋白表达系统是一种常用的表达系统，它基于细菌细胞（通常为大肠杆菌）对外源基因的转录和翻译过程。

在表达载体中，包含有启动子、激活子和选择子等元件，这些元件使得外源基因能够被细菌细胞识别、转录成mRNA，并通过翻译过程合成目标蛋白。

大肠杆菌表达载体的要求如下：
1. 操纵子以及相应的调控序列，因为外源基因产物可能会对大肠杆菌有毒害作用。

2. SD序列，即核糖体识别序列，一般SD序列与起始密码子之间间隔7\~13bp翻译效率最高。

3. 多克隆位点以便目的基因插入到适合位置。

此外，目的基因在大肠杆菌表达体系中要表达的基因即外源基因，包括原核基因和真核基因。

原核基因可以在大肠杆菌中直接表达出来，但是真核基因含有内含子不能直接表达，大肠杆菌不能对mRNA进行剪切，从而形成成熟的mRNA，所以真核基因一般以cDNA的形式在大肠杆菌表达系统中表达。

同时还需要提供大肠杆菌能识别的且能转录翻译真核基因的元件。

以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询生物学家。

大肠杆菌表达系统的研究大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统。

大肠杆菌表达系统的发展历史可追溯到二十年前，Struhl等（1976）、Vapnek等（1977）和Chang等（1978）分别将酿酒酵母DNA片段、粗糙链孢霉DNA片段和哺乳动物cDNA片段导入大肠杆菌，引起其表型的改变，证明了外源基因在大肠杆菌中可以使现有功能的活性表达。

这些研究工作为大肠杆菌表达系统的发展奠定了理论基础。

Guarante等（1980）在Science杂志上发表了以质粒、乳糖操纵子为基础建立起来的大肠杆菌表达系统，这一发展构成了大肠杆菌系统的雏型。

随着80年代后期分子生物学技术的不断发展，大肠杆菌表达系统也不断得到发展和完善。

与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点。

在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。

1 表达载体大肠杆菌质粒是一类独立于染色体外自主复制的双链、闭环DNA分子，大肠杆菌质粒可分为结合转移型和非结合转移型两种，非结合转移型质粒在通常培养条件下不在宿主间转移，整合到染色体上的频率也很低，具有遗传学上的稳定性和安全性。

又因其大小一般在2－50kb范围内，适合于制备和重组DNA的体外操作，因此几乎所有的大肠杆菌表达系统都选用非结合转移型质粒作为运载外源基因的载体，这些表达载体通过对天然质粒的改造获得。

理想的大肠杆菌表达载体要求具有以下特征：（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于大肠杆菌细胞内。

（2）具有显性的转化筛选标记。

（3）启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低。

（4）启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制。

（5）具备适用于外源基因插入的酶切位点。

复制子、筛选标志、启动子、终止子和核糖体结合位点是构成表达载体的最基本元件。

大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系是一种广泛应用于生命科学领域的基因表达系统。

大肠杆菌表达体系的主要特点包括以下几个方面。

首先，大肠杆菌表达体系具有高效的表达能力。

大肠杆菌是一种常见的细菌，具有快速繁殖和高表达的特点，使其成为一种理想的表达宿主。

此外，大肠杆菌中有许多表达小分子的系统，在外源基因表达后能够迅速转录和翻译，使其具有高度的表达效率。

其次，大肠杆菌表达体系具有方便的操作性。

在大肠杆菌表达体系中，外源基因通常以质粒的形式存在于大肠杆菌细胞中。

这种质粒可以通过大肠杆菌的经典转化方法，如热激转化、电转化等，便捷地进行基因克隆。

此外，大肠杆菌表达体系在诱导表达等方面也具有简单可行的特点，使其在实验室中得到广泛的应用。

第三，大肠杆菌表达体系具有良好的调控性能。

大肠杆菌表达体系可以通过调控诱导体的种类、浓度和诱导时间等条件来控制外源基因的表达水平。

因此，可以根据需要调节目标蛋白的表达水平，实现定量和定向表达等目的。

最后，大肠杆菌表达体系具有广泛的适用范围。

大肠杆菌表达体系适用于各种规模的实验，从小规模酶活性测定到大规模蛋白制备均可。

此外，大肠杆菌表达体系还可以用于生产大量细胞因子、酶及其他蛋白质，以用于制药及其他领域的应用。

综上所述，大肠杆菌表达体系是一种高效、方便、可调控和广泛适用于生命科学研究的基因表达系统，其表达方式的特点为基因克隆简便、操作方便、表达率高、表达水平可调节、适用范围广泛等。

⼤肠杆菌表达系统与蛋⽩表达纯化8.⼤肠杆菌表达系统与蛋⽩表达纯化⼤肠杆菌表达系统遗传背景清楚，⽬的基因表达⽔平⾼，培养周期短，抗污染能⼒强等特点, 是分⼦⽣物学研究和⽣物技术产业化发展进程中的重要⼯具。

因此熟练掌握并运⽤⼤肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每⼀个研究⽣来说是⾮常必要的。

本章节介绍了实验室常⽤的⼤肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利⽤⼤肠杆菌表达系统纯化重组蛋⽩的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。

8.1⼤肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动⼦的不同这些载体⼤致可以分为热诱导启动⼦，如λPL，cspA 等和另外⼀类就是⼴泛使⽤的IPTG诱导的启动⼦，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。

根据表达蛋⽩质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。

融合表达是在⽬标蛋⽩的N端或C端添加特殊的序列，以提⾼蛋⽩的可溶性，促进蛋⽩的正确折叠，实现⽬的蛋⽩的快速亲和纯化，或者实现⽬标蛋⽩的表达定位。

常⽤的⽤于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。

其中His-Tag 和GST-Tag 是⽬前使⽤最多的。

His Tag ⼤多数是连续的六个His 融合于⽬标蛋⽩的N端或C端，通过His 与⾦属离⼦：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作⽤⽽实现亲和纯化，其中Ni2+是⽬前使⽤最⼴泛的。

His 标签具有较⼩的分⼦量，融合于⽬标蛋⽩的N端和C端不影响⽬标蛋⽩的活性，因此纯化过程多不需要去除。

⽬前常使⽤的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。

除了His 标签外，还原性⾕胱⽢肽S-转移酶是另⼀种实验室常⽤的融合标签。

它可以通过还原性⾕胱⽢肽琼脂糖亲和层析⽽快速纯化。

简述基因工程中常用的的表达系统及其优缺点
常用的的表达系统：
大肠杆菌表达体系
酵母表达体系
哺乳动物细胞表达体系
优点：
遗传背景清晰、成本低廉、可选载体及宿主多
细胞生长快、易于培养、遗传操作简单、使用穿梭质粒载体、能对蛋白质进行正确加工、修饰、合理的空间折叠
产物最接近于天然蛋白、易纯化、扩增和表达能力高、耐较高的剪切力和渗透压力、内源蛋白分泌少
缺点：
缺乏翻译后修饰加工，信号肽不能切掉，不能分泌表达、不能糖基化产物蛋白质不均一、信号肽加工不完全、内部降解、易形成多聚体技术要求高、生产成本高、生产规模小。