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真核细胞诱导表达系统研究进展主要内容一．选题背景二．原核生物表达真核蛋白的缺点三．常见的几种真核表达系统四．总结与展望一、选题背景•随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段，但由于通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，因此，组成型表达系统的应用受到一定限制。
•基因工程的发展使许多微量蛋白得以大量表，使许多难以制备的蛋白得以表达。
大肠杆菌Ecoli表达系统是目前为止最为有效的和方便的表达系统，可以进行许多异源蛋白的高效表达，但在进行一些蛋白的表达时，会产生许多困难。
二、原核生物表达真核蛋白的缺点1、外源蛋白在E.coli中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在于细胞内，而包涵体的分离破碎通常会造成目的蛋白的失活；2、真核基因通常含有内含子，在E.coli中是不能进行正确的剪切和拼接的，因此必须表达它的cDNA序列；3、真核生物的许多蛋白都是糖蛋白，用E.coli作为表达宿主，不能对真核蛋白进行正确的糖基化等翻译后加工，很难得到有活性的真核表达系统。
三、常见的几种真核表达系统1、四环素诱导表达系统2、蜕皮激素诱导表达系统3、生物素诱导表达系统4、哺乳动物细胞表达系统1、四环素诱导表达系统此系统的作用依赖于四环素调控的反式作用因子(tTA/rtTA)和反式作用因子依赖的启动子两个成分。
四环素反式激活蛋白(tTA)是一个包含大肠杆菌TN10四环素耐药操纵子阻遏物和单纯疱疹病毒p16蛋白(VP16)C端部分的融合蛋白,tTA依赖启动子由融合有RNA聚合酶Ⅱ启动子的四环素操纵子(tet O)基因序列构成,这种融合使真核细胞中的tet阻遏物成为很强的翻译激活物。
作用机理：在缺乏四环素及其衍生物的条件下tTA与tetO序列结合，使tTA依赖启动子的转录过程被激活；而在存在四环素及其衍生物的条件下，tTA无法与其靶位点相互作用，转录也就无法进行。
PART Ⅰ基因（略）PART Ⅱ原核基因表达体系第五章细菌转录1、简介：转录产生的RNA链代表了DNA双链的一条链。
新合成的RNA链为5’-3’，而模板链为3’-5’。
转录出来的RNA 排列与编码链相同。
RNA合成由RNA聚合酶催化。
转录起始于RNA聚合酶与DNA上的特定区域的结合——启动子（promoter），这作为转录的开始。
从启动子开始，RNA聚合酶沿着模板链移动合成RNA，直到到达终止子（terminator）序列。
这一反应决定了转录单位的形成，即从启动子至终止子的序列均为转录单位，这一区域可能包含不止一个基因。
序列优先从起始点（转录RNA的第一个碱基）。
起始点以上的被称为上游，以下的被称为下游。
转录的直接产物被称为初始转录本。
它包含了从启动子至终止子的5’-3’的全部信息。
然而，转录起始本通常被直接修饰。
原核细胞中，它直接被降解（mRNA），或者切割成为成熟的tRNA或者rRNA。
转录只是基因表达以及调控的第一阶段。
调控蛋白决定了到底是哪一部分的基因能够被RNA聚合酶转录。
这一步骤决定了基因的转录与否。
本章需要谈论的问题主要有两个。
1、RNA聚合酶究竟是怎样找到DNA上的启动子序列的？推广这一问题为：究竟蛋白质是怎样阅读DNA上的序列来找到特定的结合位点的？2、调控蛋白是怎样与RNA聚合酶相互作用来启动或者抑制转录的起始、延长、或者终止过程的？2、转录发生在转录泡中：在通常意义上的转录过程中，RNA一般合成于“转录泡”中，转录泡为解开双螺旋的DNA 双链。
RNA链沿着5’-端向3’-端合成。
游离核苷酸的3’-OH与DNA链上的核苷酸的5’-P相互作用，合成RNA链。
RNA 聚合酶与启动子结合后就会解离DNA双链形成转录泡。
当RNA聚合酶沿着DNA模板移动时，其沿着解旋点（unwinding point）解开DNA双螺旋，并且在重旋点（rewinding point）重旋DNA。
转录泡的长度一般为12-14bp，但是RNA-DNA 杂交链区域的长度为8-9bp。
原核、真核生物基因及表达调控引言现代生物学中“基因”一词甚为流行，细胞学、遗传学、生物化学等，以及各种生物学课本中，都涉及到“基因”一词。
甚至象典型的宏观生物学科——生态学，也把一片森林称为一个“基因库”[1]。
现代生物学已经完全证明，DNA 分子是由称为核普酸的有机分子线性聚合而成。
基因就是核普酸按一定顺序排列而成的DNA分子片段，它携带着遗传信息。
基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
其实质就是遗传信息的转录和翻译。
在个体生长发育过程中，生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）[2]。
原核生物和真核生物的基因及表达过程有着差异。
随着世界分子生物学研究不断深入，基因表达技术有了很大的提高。
迄今为止，人们已经研究开发出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白[3]。
一．原核、真核生物基因结构原核生物基因分为编码区与非编码区，所谓的编码区就是能转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，非编码区位于编码区的上游及下游。
[4]在调控遗传信息表达的核苷酸序列中最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。
RNA聚合酶是催化DNA转录为RNA，能识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
真核生物基因结构见图1：图1 真核生物基因结构二．原核、真核生物基因结构的区别最主要的在于真核基因是不连续的,而原核基因是连续的。
所谓真核基因的不连续，即一个基因的编码序列也叫外显子，被一个或多个非编码序列，又叫内含子所间隔。
[5]这些内含子和外显子同属一个转录单位，转录形成前体。
经过转录的加工，即切去内含子，重新连按外显子，从而得到成熟。
而绝大多数的原核基因是连续的，没有内含子的间隔，转录产生成熟。
不仅如此，而且凡在代谢途径上功能有关的多个基因可能紧密相联，与它们的调控基因一起组成一个操纵子，转录到一条链。
真核生物的基因表达调控染色质基因激活转录和转录后加工翻译和翻译后加工一、染色质水平基因表达调控（一）染色质结构与功能：常染色质（euchromatin）：，对DNase I敏感，DNA可降解为约200 bp 或其倍数的片断；基因表达处于活性状态。
异染色质（heterochromatin）：结构高度致密处于凝聚状态的染色质，对DNase I不敏感。
基因表达活性处于阻遏状态。
组成性异染色质：所有细胞，整个细胞周期都存在的异染色质。
其DNA不含基因，因而一直保持凝聚状态。
兼性异染色质（facultative heterochromatin）：在特定细胞，生长发育的特定阶段，由常染色质凝聚转变成的异染色质。
（二）染色质重塑：染色质重塑（chromatin remodeling）：与转录相关的染色质局部结构的改变称之。
主要有：核小体重塑、DNA甲基化、组蛋白共价修饰。
1、核小体重塑：（nucleosome remodeling）核小体重塑：ATP依赖性酶蛋白复合体参与的核小体的移位、替换和去组装改变。
核小体重塑过程：基因活化蛋白结合；ATP依赖性酶蛋白复合体结合转录活性区；ATP依赖性酶水解A TP，提供能量；移去或替换核小体。
2、DNA的甲基化：常见真核生物DNA5’-CpG-3’序列，即CpG岛(CpG-rich islands)胞嘧啶第5位C被甲基化。
甲基化程度使DNA结构稳定。
甲基化程度与基因表达活性呈反比关系。
3、组蛋白共价修饰:使组蛋白与DNA双链的亲和力改变，染色质的局部结构改变。
共价修饰方式：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。
最常见：乙酰化和甲基化。
3、组蛋白共价修饰:使组蛋白与DNA双链的亲和力改变，染色质的局部结构改变。
共价修饰方式：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。
最常见：乙酰化和甲基化。
组蛋白的乙酰化与去乙酰化酶：组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyl transferases HATs ) 组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase HDAC）修饰位点：核心组蛋白外周结构域，氨基末端Lys残基的NH3。
真核生物基因表达调控的机制
真核生物基因表达调控的机制
真核生物中的基因表达调控是一个复杂而且受多种影响的过程，其机制也极为复杂，主要包括以下七个方面。
一、基因结构调控
基因的结构调控可以通过改变基因的翻译或者转录起始点，改变基因的拷贝数量，改变基因的外显子结构等，从而调节基因表达。
这种机制也称为“结构调控”。
二、编码序列调控
基因编码序列可以用来调节基因表达。
包括基因内部的种类多样性，基因突变等，都会影响基因编码序列，从而影响基因表达。
三、转录因子调控
转录因子可以调节基因转录的开始时间，结束时间，影响基因转录的效率，从而影响基因表达。
四、mRNA加工调控
当mRNA处于加工过程中，其加工过程也会受到调控，这种调控会影响mRNA的翻译效率，从而影响基因的表达。
五、mRNA翻译调控
翻译调控是一种比较常见的调控机制，它可通过影响mRNA的结构、翻译初始效率以及翻译开始时间来调节基因的表达。
六、蛋白质稳定性调控
蛋白质稳定性的调控是指通过改变蛋白质的稳定性，来影响基因
的表达。
七、基因激活与抑制
基因激活与抑制是指通过外界影响，改变激活因子或者抑制因子的表达，来影响基因表达。
以上就是真核生物基因表达调控的七个机制，同时，也是基因组学研究中需要重点关注的重要机制。
真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。
简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。
1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。
甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。
甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。
大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。
甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。
2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。
杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。
杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。
目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。
与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。
虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
真核生物基因表达调控的特点及主要调控环节真核生物基因表达调控是一个复杂而精密的系统，涉及到多种调控机制和调控环节。
通过这些调控机制和环节，真核生物能够在不同的细胞类型和不同的发育阶段中表达特定的基因，从而实现细胞功能的多样化和分化。
下面我们将详细介绍真核生物基因表达调控的特点以及主要调控环节。
首先，真核生物基因表达调控具有高度的精细性和特异性。
在真核生物细胞中，每个细胞都包含着相同的基因组，但不同细胞类型和组织会表达不同的基因。
这种差异性主要是通过转录调控来实现的，即通过对特定基因的转录进行调控，使得只有需要的基因在特定的时间和空间表达。
这种精细性和特异性的调控是真核生物细胞功能多样化和分化的重要基础。
其次，真核生物基因表达调控涉及多种调控机制和调控因子。
在真核生物细胞中，基因表达的调控是一个复杂的过程，需要多种调控机制和调控因子的参与。
其中，转录因子是最为重要的调控因子之一，它们可以结合到基因的启动子区域，促进或抑制该基因的转录。
此外，还有一些非编码RNA、表观遗传学修饰等调控机制也在基因表达调控中扮演着重要角色。
这些调控机制和调控因子相互作用，共同调控着基因的表达。
另外，真核生物基因表达调控还存在着复杂的信号传导网络。
在细胞内部，存在着多种信号通路和信号分子，它们可以感知外界环境的变化，并将这些信息传递给细胞核，从而影响基因的表达。
这些信号传导网络可以通过激活或抑制转录因子的活性，改变基因的表达水平。
通过这种方式，细胞可以根据外界环境的变化做出相应的调整，保持内部稳态。
综上所述，真核生物基因表达调控具有高度的精细性和特异性，涉及多种调控机制和调控因子，以及复杂的信号传导网络。
这些特点和调控环节共同构成了真核生物基因表达调控系统的核心。
通过深入研究这些调控机制和调控环节，可以更好地理解细胞功能的多样化和分化过程，为疾病的治疗和生命科学研究提供重要的理论基础。
蛋白表达形式
蛋白表达形式主要有以下几种：
1. 原核表达系统：原核表达系统是最早被开发的蛋白表达途径之一，主要利用大肠杆菌（E.coli）作为宿主细胞。
该系统具有操作简单、表达量高等优点，适用于小分子量蛋白的表达。
在原核表达系统中，常用的表达载体包括质粒和噬菌体。
质粒表达途径通过将目标蛋白编码基因插入质粒中，然后将质粒导入宿主细胞，利用宿主细胞的代谢机制表达目标蛋白。
噬菌体表达途径则利用噬菌体感染宿主细胞，将目标蛋白编码基因插入噬菌体基因组中，然后利用宿主细胞的机制表达目标蛋白。
原核表达系统的主要限制是无法表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。
2. 真核表达系统：真核表达系统利用真核细胞作为宿主细胞，可以表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。
常用的真核表达系统包括酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
酵母表达系统主要利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)等作为宿主细胞。
除此之外，还有分泌型表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体等多种表达形式，并且每种表达形式都有其独特的特点和应用场景。
真核表达系统原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利，eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN)，降低了本钱，扩大了来源，也缩短了生产周期。
可是由于原核细胞中没有转录后加工系统，不能识别、剪除内含子，因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达；另外，原核细胞缺乏翻译后加工系统，不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。
因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后，尽管一样形成蛋白质具有抗原性，却因为不能糖基化，而不产生功能。
例如，C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基)，因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径，是一种极好的补体抑制剂，若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE)，表现为全身水肿，尤其是喉头水肿，能够输血，以正常人血中的C1INH来补充医治，但长期输血价钱高，易引发副反映，故可用基因工程产品来医治HANE，但因C1INH为高度糖基化蛋白，在中表达没有活性，现已有人利用CHO表达C1INH，拟用于医治。
一、优势1.具转录后加工系统；2.具翻译后修饰系统；3.可实现真正的分泌表达，分泌至细胞外简化了纯化工艺。
二、真核基因结构及表达调控特点：(一)、基因结构特点：1.DNA极为丰硕，具全能性——mRNA丰度(选材)克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA，反转录合成为cDNA。
尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同，但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题，基因在不同细胞中转录情形不一样，产生不同的功能蛋白，才表现出各类细胞的丰硕多样性。
故应选择mRNA丰度高的细胞为材料，eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。
2.结构复杂，DNA与组蛋白结合，并在其外有核膜——真核生物转录、翻译不可能持续进行。
3.不持续性：内含子、外显子。
内含子可能参与基因调控，不同剪切方式产生不同蛋白质。
