下载文档原格式
真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。
随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。
该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。
其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。
但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制;②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及;③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。
真核细胞诱导表达系统研究进展主要内容一．选题背景二．原核生物表达真核蛋白的缺点三．常见的几种真核表达系统四．总结与展望一、选题背景•随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段，但由于通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，因此，组成型表达系统的应用受到一定限制。
•基因工程的发展使许多微量蛋白得以大量表，使许多难以制备的蛋白得以表达。
大肠杆菌Ecoli表达系统是目前为止最为有效的和方便的表达系统，可以进行许多异源蛋白的高效表达，但在进行一些蛋白的表达时，会产生许多困难。
二、原核生物表达真核蛋白的缺点1、外源蛋白在E.coli中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在于细胞内，而包涵体的分离破碎通常会造成目的蛋白的失活；2、真核基因通常含有内含子，在E.coli中是不能进行正确的剪切和拼接的，因此必须表达它的cDNA序列；3、真核生物的许多蛋白都是糖蛋白，用E.coli作为表达宿主，不能对真核蛋白进行正确的糖基化等翻译后加工，很难得到有活性的真核表达系统。
三、常见的几种真核表达系统1、四环素诱导表达系统2、蜕皮激素诱导表达系统3、生物素诱导表达系统4、哺乳动物细胞表达系统1、四环素诱导表达系统此系统的作用依赖于四环素调控的反式作用因子(tTA/rtTA)和反式作用因子依赖的启动子两个成分。
四环素反式激活蛋白(tTA)是一个包含大肠杆菌TN10四环素耐药操纵子阻遏物和单纯疱疹病毒p16蛋白(VP16)C端部分的融合蛋白,tTA依赖启动子由融合有RNA聚合酶Ⅱ启动子的四环素操纵子(tet O)基因序列构成,这种融合使真核细胞中的tet阻遏物成为很强的翻译激活物。
作用机理：在缺乏四环素及其衍生物的条件下tTA与tetO序列结合，使tTA依赖启动子的转录过程被激活；而在存在四环素及其衍生物的条件下，tTA无法与其靶位点相互作用，转录也就无法进行。
真核细胞常见表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
1、pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN 载体特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔B -球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo 基因以及pBR322 骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sall、BamHI和EcoRI位点。
注意在此载体中有二个EcoRI 位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点： pEGFP 表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo 抗性盒由SV40 早期启动子、Tn5 的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK 基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin 抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途：该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV 启动子,Acet1-Nhe1) 。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆B -肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin 使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
真核细胞罕睹表黑载体之阳早格格创做真核细胞, 表黑载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特性:该真核细胞表黑载体分子量为6600碱基对于，主要由CMVp开用子、兔β-球蛋黑基果内含子、散腺嘌呤、氨青霉素抗性基果战抗neo基果以及pBR322骨架形成，正在大普遍真核细胞内皆能下火稳牢固天表黑中源手段基果.更要害的是，由于该真核细胞表黑载体中抗neo基果存留，转染细胞后，用G418筛选，可修坐宁静的、下表黑手段基果的细胞株.拔出中源基果的克隆位面包罗Sal1、BamH1战EcoR1位面.注意正在此载体中有二个EcoR1位面存留.2、pEGFP, 巩固型绦色荧光蛋黑表黑载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特性: pEGFP表黑载体中含有绿色荧光蛋黑，正在PCMV 开用子启动下，正在真核细胞中下火仄表黑.载体骨架中的SV40origin使该载体正在所有表黑SV40 T抗本的真核细胞内举止复造.Neo抗性盒由SV40早期开用子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基果以及HSV-TK基果的散腺嘌呤旗号组成，能应用G418筛选宁静转染的真核细胞株.别的，载体中的pUC origin 能包管该载体正在大肠杆菌中的复造，而位于此表黑盒上游的细菌开用子能启动kanamycin抗性基果正在大肠杆菌中的表黑.用途: 该表黑载体EGFP上游有Nde1、Eco47111战Age1克隆位面，将中源基果扦进那些位面，将合成中源基果战EGFP的混合基果. 借此可决定中源基果正在细胞内的表黑战/或者构造中的定位.亦可用于检测克隆的开用子活性(与代CMV开用子,Acet1-Nhe1).3、pEGFT-Actin, 巩固型绿色荧光蛋黑/人肌动蛋黑表黑载体特性:pEGFP-Actin表黑载体中含有绿色荧光蛋黑战人胞浆β-肌动蛋黑基果，正在PCMV开用子启动下，正在真核细胞中下火仄表黑.载体骨架中的SV40origin使该载体正在所有表黑SV40 T抗本的真核细胞内举止复造.Neo抗性盒由SV40早期开用子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基果以及HSV-TK基果的散腺嘌呤旗号组成，能应用G418筛选宁静转染的真核细胞株.别的，载体中的pUC origin 能包管该载体正在大肠杆菌中的复造，而位于此表黑盒上游的细菌开用子能启动kanamycin抗性基果正在大肠杆菌中的表黑.用途: pEGFP-Actin载体正在真核细胞表黑EGFP-Actin混合蛋黑，该蛋黑能调整到胞内正正在死的肌动蛋黑，果而正在活细胞战牢固细胞中瞅察到细胞内含肌动蛋黑的亚细胞结构.4、pSV2表黑载体特性：该表黑量粒是以病责SV40开用子启动正在真核细胞手段基果举止表黑的，克隆位面为Hind111.SV40开用子具备构造/细胞的采用特同性.此载体没有含neo基果，故没有克没有及用去筛选、修坐宁静的表黑细胞株.5、CMV4 表黑载体特性:该真核细胞表黑载体由CMV开用子启动，多克隆天区酶切位面采用性较多.含有氨苄青霉素抗性基果战死少基果片段以及SV40复造本面战fl单链复造本面.但是值得注意的是，该表黑载体没有含有neo基果，转染細胞后没有克没有及用G418筛选宁静的表黑细胞株. 其余时常使用克隆Vector：pBluscript II KS DNA 15 ugpUC18 DNA 25 ugpUC19 DNA 25 ug证明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体符合于DNA片段的克隆、DNA测序战对于中源基果举止表黑等.那些载体由于正在lacZ基果中含有多克隆位面，当中源DNA片段扦进，转移lacZ基果缺累细胞，并正在含有IPTG战X-gal的培植基上培植时，含有中源DNA载体的细胞将为红色菌降，而无中源DNA片段载体的细胞则为兰色菌降，由此易于筛选有无中源DNA片段的载体.别的，那些载体中有便于测序的M13、T7战T3的通用引物举止DNA测序. 保存液: TE BufferTE Buffer组成: 10mM Tris.HCL(Ph 8.0) 1mM EDTA用途: 克隆中源DNA片断. 举止基果表黑. 使用M13、T7战T3引物举止测序. 存留的问题细胞的死命活动是一个搀纯的调控历程，有些死命活动的机理还没有真足浑晰，由于插人的手段基果分歧，载体构修栗用的逆式组件分歧，组拆的空间位子分歧，采与的表黑系统分歧，手段基果表黑火仄易阳性克隆筛选率皆市有很大好别.其余，由于所有的逆式元件存留种属战构造特同性，所构修的下效表黑载体纷歧定正在所有细胞株中均下效表黑.再者，细胞死少状态的好别，转染要领的分歧培植时阉的少短，筛选药物浓度的下矮，对于表黑量皆有很大效率.所以，需要概括评介一个表黑载体战表黑系统，排除一些没有定果素，筛选出最好拉拢真核表黑载体趋背于既有好处扩删手段基果又有好处筛选阳性克隆的载体的构修.许多灵验的应用范畴广的强开用子战巩固子被人创造并应用于载体中，大大普及了手段基果的表黑量，其余一些强的组成型开用子，如SV40早期开用子+PHTLv，已应用于大规模死产的细胞系中. 应用以GS为筛选标记的表黑载体可兼有筛选战扩删手段基果二种功能，是暂时钻研的沉面.以IRES连交的单逆反子表黑载体已成为核表黑载体的主体.正在共一开用子把持下，筛选基果或者报告基果与手段基果转录正在共一mRNA上通过IRES的效率，表黑出二种蛋黑，果而正在表面上可认为，通过了筛选或者表黑了报告基果的克隆必为阳性克隆，即表黑手段基果的克隆，有报导道那种单逆反子的共表黑率为90％.那便大大普及了筛选率，简化了真验历程. 将强开用子、巩固子战可扩删的筛选标记组拆正在共一载体上，构修下效表黑战筛选的表黑载体并将其使用于最符合的表黑系统中，是现正在真核表黑载体构修钻研死少目标.。
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签:真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要: 原核表达系统就是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
原核表达系统就是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
自上世纪70年代基因工程技术诞生以来,基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
并随着人类基因组计划实施的进行,在技术方法上得到了很大发展,时至今日已取得令人瞩目的成就。
随着人类基因组计划的完成,越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因就是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
在各种表达系统中,最早被采用进行研究的就是原核表达系统,这也就是目前掌握最为成熟的表达系统。
该项技术的主要方法就是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的就是大肠杆菌),通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。
其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉。
但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应,目的蛋白常以包涵体形式表达,导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足,许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点就是:①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计,而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制;②能诱导基因高效表达,可达105倍,为其她系统所不及;③能严格调控基因表达,即不仅可控制基因表达的“开关”,还可人为地调控基因表达量。
因此,利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。
目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统与哺乳动物细胞表达系统。
1、酵母表达系统最早应用于基因工程的酵母就是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等,其中,甲醇酵母表达系统就是目前应用最广泛的酵母表达系统。
目前甲醇酵母主要有H Polymorpha,Candida Bodini,Pichia Pastris3种。
以Pichia Pastoris应用最多。
甲醇酵母的表达载体为整合型质粒,载体中含有与酵母染色体中同源的序列,因而比较容易整合入酵母染色体中。
大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1(A0x1),在该基因的启动子(PAXOI)作用下,外源基因得以表达。
PAXOI就是一个强启动子,在以葡萄糖或甘油为碳源时。
甲醇酵母中AOx1基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时PAXOI可被诱导激活,因而外源基因可在其控制下表达,将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。
此外甲醇酵母的表达载体都为E、coli/Pichia Pastoris的穿梭载体,其中含有E、coli复制起点与筛选标志,可在获得克隆后采用E、coli细胞大量扩增、目前,将质粒载体转入酵母菌的方法主要有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等。
甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。
培养至高浓度。
再以甲醇为碳源。
诱导表达外源蛋白。
这样可以大大提高表达产量。
利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。
与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞,不会发生超糖基化。
利用PAXOI表达外源蛋白时,一般需很长时间才能达到峰值水平,而甲醇就是高毒性、高危险性化工产品。
使得实验操作过程中存在不小的危害性。
且不宜于食品等蛋白生产。
因此那些不需要甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多种。
利用三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子代替PAXOI,不需要甲醇诱导。
培养过程中无需更换碳源,操作更为简便,可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间。
酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统,由于兼具原核以及真核表达系统的优点,正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。
2、昆虫细胞表达系统杆状病毒表达系统就是目前应用最广的昆虫细胞表达系统,该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)作为表达载体。
在AcNPV感染昆虫细胞的后期,核多角体基因可编码产生多角体蛋白,该蛋白包裹病毒颗粒可形成包涵体。
核多角体基因启动子具有极强的启动蛋白表达能力,故常被用来构建杆状病毒传递质粒。
克隆入外源基因的传递质粒与野生型AcNPV共转染昆虫细胞后可发生同源重组,重组后多角体基因被破坏,因而在感染细胞中不能形成包涵体,利用这一特点可挑选出含重组杆状病毒的昆虫细胞但效率比较低,且载体构建时间长,一般需要4～6周。
此外,昆虫细胞不能表达带有完整N联聚糖的真核糖蛋白。
在病毒感染晚期,由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解,胞质内的物质释放出来,与目的蛋白混在一起,从而使蛋白的纯化工作变得很困难,另外水解酶的释放会降解重组蛋白。
为了克服以上这些困难,科学工作者先后尝试用丝蛾肌动蛋白基因启动子或杆状病毒ie-1基因启动子表达外源蛋白,但效果都不明显。
Farrel等介绍了一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统,该系统主要包括3个调节外源蛋白表达序列:(1)Bombyx mori的肌动蛋白基因启动子;(2)Bombyx mori的核型多角体病毒(BmNPV)的立早基因ie-1(编码俄IE-1蛋白,该蛋白就是种转录激活因子,可在体外激活肌动蛋白基因启动子);(3) BmNPV的同源重复序列3(HR3)可作为肌动蛋白基因启动子的增强子。
三者协同作用,可使转录活性提高1000倍以上,从而大大地提高外源蛋白的表达水平。
另外目前还有一种新型的宿主范围广的杂合核多角体病毒(HyNPV)被应用于昆虫细胞表达系统的构建,该病毒由AcNPV及Bni'qP发展而来。
一般情况下杆状病毒表达系统所能表达的外源蛋白只有少部分就是分泌性的,大部分为非分泌性。
为了解决这个问题将Hsp70(热休克蛋白70)与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平,这就是因为分泌性多肽被翻译后必须到达内质网进行加工才能被分泌至胞外。
如果到达内质网前,前体多肽就伸展开来,暴露出疏水残基,残基间的相互作用可引起多肽的凝聚,这对最终的表达水平有很大影响。
而Hsp70就是一种分子伴侣,能够与新翻译的多肽结合,抑制前体肽的凝聚使前体肽顺利到达内质网进行加工,从而提高蛋白的分泌水平。
最近,人们又构建了杆状病毒-S2表达系统,该系统能将重组杆状病毒转染果蝇S2细胞,以前人们认为杆状病毒仅能在鳞翅目昆虫细胞(如sf9、sf21)中复制,不能在其她昆虫细胞(如果蝇细胞)中复制,然而目前研究表明在一定条件下,杆状病毒也能感染果蝇细胞。
在果蝇细胞中,杆状病毒的多角体基因启动子几乎不发生作用。
杆状病毒-S2表达系统的表达载体利用的就是果蝇启动子如Hsp70启动子、肌动蛋白5C启动子、金属硫蛋白基因启动子等,其中,Hsp70启动子的作用最强。
重组杆状病毒感染S2细胞后不会引起宿主细胞的裂解,且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似,因此,杆状病毒-S2系统就是一个很有应用前景的昆虫细胞表达系统。
昆虫细胞表达系统,特别就是杆状病毒表达系统由于其操作安全,表达量高,目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。
3、哺乳动物细胞表达系统由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质,在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统,更接近于天然蛋白质。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子与多聚核苷酸信号等。
将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过2类方法:一就是感染性病毒颗粒感染宿主细胞,二就是通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。
外源基因的体外表达一般采用质粒表达载体,如将重组质粒导入CHO细胞可建立高效稳定的表达系统,而利用COS细胞可建立瞬时表达系统。
目前,病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具,在临床基因治疗的探索中也发挥了重要作用。
痘苗病毒由于其基因的分子量相当大(约187kb),利用它作为载体可同时插入几种外源基因,从而构建多价疫苗。
另外,逆转录病毒感染效率高,某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因,但要注意的就是逆转录病毒可整合入宿主细胞染色体,具有潜在的危险性。
由于腺病毒易于培养、纯化,宿主范围广,故采用该类病毒构建的载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒与包装载体之间的同源重组。
但就是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很低,利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高,即将外源基因插入到腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒,将其线性化后与腺病毒包装质粒共转化大肠埃希菌。
另一种方法就是通过CrelaxP系统构建重组腺病毒载体,在转移质粒与包装质粒中都插入laxP位点,然后将两个质粒共转染表达Cre重组酶的哺乳动物细胞,通过Cre介导两个laxP 位点之间的DNA发生重组,可获得重组腺病毒,这种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。
最近,人们在杆状病毒中插入巨细胞病毒的启动子建立了高效的基因转移载体。
由于杆状病毒就是昆虫病毒,在哺乳动物细胞中不会引起病毒基因的表达,而且载体的构建容易,因而利用杆状病毒进行基因转移为我们提供了很好的途径。
利用哺乳动物细胞表达外源基因时,大多数情况下不需要诱导,但当表达产物对细胞有毒性时应采取诱导,这样可避免表达产物产生早期就对细胞产生影响。
哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与启动子有关如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导,还有重金属、糖皮质激素诱导的启动子。
但这些系统存在一些共同的缺陷,如诱导表达特异性差;当系统处于关闭状态时表达有泄漏诱导剂本身有毒性,常对细胞造成损伤等。
为此,Gossen等构建了受四环素负调节的Tet-on基因表达系统,该系统由调节质粒与反应质粒组成。
调节质粒中具有编码转录激活因子(fIA)的序列,在没有四环素或强力毒素存在的情况下tTA可引起下游目的基因表达。
随后Gossen等又对tTA的氨基酸序列进行了改造,构建了受四环素正调节的Tet-on基因表达系统,该系统在没有四环素的情况下启动子不被激活,而在加入四环素或强力毒素后目的基因高效表达。
四环素诱导的基因表达系统就是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统,该系统具有严密、高效可控制性强的优点。
