基因工程 第七章 酵母基因表达体系(55P)
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酵母菌的遗传工程和表达系统酵母菌是一种常见的单细胞真菌,广泛存在于自然界中。
由于其易于培养、生长速度快、基因组较小、剪接机制类似于哺乳动物细胞等优点,酵母菌成为了功能基因组学、代谢工程学、蛋白质工程学等领域中的重要模型生物。
而酵母菌的遗传工程和表达系统则为这些研究提供了基础和保障。
酵母菌的遗传工程主要包括基因克隆、拷贝数调控、基因敲除、基因组编辑、基因表达调控、代谢通路调控等方面。
其中,基因克隆是构建目的基因载体的重要步骤,一般通过 PCR 扩增或基于荧光报告基因的克隆方法来实现。
而拷贝数调控则指通过操纵载体的拷贝数,达到目的蛋白在酵母细胞中表达量的控制。
酵母菌具有高度重组能力以及泛素降解酶机制,因此基因敲除和基因组编辑等操作在酵母菌中较为容易实现。
基因表达调控则是酵母细胞酿酒业中的重要应用,通过调节转录、翻译后修饰等环节来实现产品的调控。
代谢通路调控则是通过调节酵母菌内一系列代谢酶的表达量或活性来增加特定产物的产量。
酵母菌的表达系统则包括基于质粒的表达和基于基因组的表达两种方式。
质粒表达是将目的基因克隆至质粒中,然后将质粒转化至酵母细胞中,通过调控拷贝数和选择适当的启动子及终止子等措施实现表达。
而基因组表达则是将基因克隆至某一位点上,在酵母菌表达生命周期较长的时期内带来更稳定的表达效果,尤其适用于连续表达大规模生物分子的场合。
同时,可以采用多个方面的策略来处理表达过程中可能出现的问题,从而进一步优化表达效率和表达质量。
例如在 translational initiation 上加入特定元件、利用内质网信号肽将蛋白定向到内质网,从而利用内质网发生的翻译后修饰增加表达质量等等。
总之,酵母菌的遗传工程和表达系统为现代生物技术研究和产业化提供了重要的平台,无论从理论研究还是实践应用的角度来看,都具有广泛的前景和应用价值。
我们期待,基于酵母菌的遗传工程和表达系统将吸引更多的生物学家、遗传学家、代谢工程师、蛋白质化学家等多个领域的专家和研究人员的关注,一起推进这一新兴领域的发展和进步。
酵母表达体系毕赤酵母是甲醇营养型,甲醇代谢的第一步是:醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性,甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行,使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2 的结合率较低,因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
毕赤酵母含有两种醇氧化物酶,AOX1 AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达,为Mut+菌株,可占可溶性蛋白的30%以上。
AOX2 基因与AOX1 基因有97%的同源性,但在甲醇中带AOX2 基因的菌株比带AOX1 基因菌株慢得多,通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts 菌株。
毕赤酵母表达外源蛋白:分泌型和胞内表达。
利用含有α因子序列的分泌型载体即可。
翻译后修饰:酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型,毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度(平均每个支链8-14 个甘露糖残基)比酿酒酵母中的(50-150 个甘露糖残基)短得多。
菌株:GS115 ( Mut+, Muts)和 KM71(Muts)分泌型载体:pPICZα A,B,and C(5’AOX1启动子,紧密型调节,甲醇诱导表达,α分泌信号介导的分泌表达,Zeocin抗性基因,C端含有6XHis标签)胞内表达型载体:pPICZ A,B,and C,一:分子克隆1.设计引物分泌型载体图谱:见酵母表达说明书(p13-pPICZ A,p14-pPICZ B,p15-pPICZ C)2.PCR扩增基因PCR反应体系(50μl)模板DNA 1μlForward Primer(10μM)1μlReverse Primer(10μM)1μldNTP Mixture(各2mM): 4μl5×PrimerSTAR buffer(Mg2+ plus)10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μlddHO up to 50μl2PCR 反应流程预变性98℃ 2min变性98℃ 10sec退火56℃ 10sec 30个循环延伸72℃ 30sec完全延伸72℃ 10min保存4℃3.双酶切及其回收双酶切反应体系(40μl)DNA(空载体或目的基因) 30μlBamHⅠ 1.5μlXholⅠ 1.5μl10×Buffer K 4.0μl4.酶连接首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收,按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间,一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl,在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ,16℃连接4-6h。
基因工程刘夫锋2019.11.27基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化7.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌的分类学特征酵母菌(Yeast )是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物,分属于子囊菌纲(子囊酵母菌)、担子菌纲(担子酵母菌)、半知菌类(半知酵母菌),共由56个属和500多个种组成。
如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统,则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。
7.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序,基因表达调控机理比较清楚,遗传操作相对简单能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素,美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统,食品工业有数百年历史酵母菌是最简单的真核模式生物7.2 酵母菌的宿主系统7 外源基因在酵母菌中的表达7.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌7.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌7.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括:酵母属如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis )毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris )裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )汉逊酵母属如多态汉逊酵母(Hansenula polymorpha )裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )如解脂耶氏酵母(耶氏酵母属Yarrowia lipolytica )如腺嘌呤阿氏酵母(阿氏酵母属Arxula adeninivorans )其中芽殖型酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽。