基因表达系统大肠杆菌表达系统共44页文档
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大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展,外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心,常用表达系统一般为模式生物,包括真核表达系统和原核表达系统,其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统,原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统,也是最早进行研究的外源基因表达系统,其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高,相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性,是商业生产中应用最广泛的表达系统,取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品,包括:重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计,1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时,目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段,如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等,其中大肠杆菌 BL21( DE3)菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一,BL21(DE3)是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型,以保证外源蛋白在表达过程中不被降解,维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值,但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键,包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步,对表达活性和表达量影响很大,理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型,避免蛋白酶过多引起的产物不稳定,常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因,外源基因决定了是否可获得目的产物,原核基因可在大肠杆菌中直接表达,而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
大肠杆菌表达系统本文主要介绍了大肠杆菌蛋白表达原理、具体操作步骤、大肠杆菌表达系统及其与其他系统的比较等。
诱导原理:Lac阻遏物是一种具有4个相同亚基的四级结构蛋白,都有一个与诱导剂结合的位点。
在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态,Lac阻遏物能与操纵基因O结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。
而当有诱导剂与阻遏蛋白结合后,其蛋白构象就发生变化,导致阻遏物从操纵基因O上解离下来,RNA聚合酶不再受阻碍,发生转录。
大肠杆菌表达系统步骤不包括基因构建等上游操作和蛋白纯化部分。
基因构建参考密码子优化,蛋白纯化参考蛋白纯化专题。
以下内容主要包括蛋白表达鉴定:1.表达鉴定第一天的任务,常用抗性选择根据感受态细胞选择•拿到质粒,离心(3000r/min;2min)•在质粒中加入TE(使质粒最终加入到110μL感受态细胞中的量为80-100ng,据此确定加入TE的量),一般为(1μg质粒加20μLTE;2μg质粒加50μLTE;5μg质粒加100μL TE)•将质粒与TE混匀,加入2μL混液于感受态细胞中•将感受态细胞放入冰箱(4℃)中,30min•取出后立即放入水浴锅中(42℃),热激90s,•再次放入冰箱(4℃)中,3min•拿出后取200μL的LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中•放入摇床(37℃; 195r)中, 30nim至60min; (最佳45min)•取出离心(3000r/min;2min)•去掉200μL的上清,留100μL左右上清悬浮沉淀,吸取50μL 悬液涂平板,(先将对应抗性的平板放入培养箱(37℃)中预热20min)•把平板放入培养箱(37℃),过夜(12h至16h)2. 表达鉴定第二天的任务,注意Pcold的表达温度•每个平板挑取单菌落至4支对应抗性的L(4ml)试管中,编号为“0”“1”“2”“3”•将试管放入摇床(37℃;195r)中,(单抗3h左右;双抗4左右;刚开始用可见分光光度计测OD值;熟练后可目测(背光下,以试管中的枪头为例,刚刚看不见枪头即可)),测OD值(0.6至0.8)•从“0”号管中取700μL悬液加入到100μL(C=80%)的保种甘油中,震匀,放入冰箱(-20℃)冻存•在每组菌的“1”“2”“3”号试管中分别加入2μL的IPTG(终浓度0.5mM最适)•视不同的载体选择适合的表达环境(PET/PGEX:15℃表达过夜;25℃表达6h;37℃表达3h至4h(4支试管,“0”“1”号试管15℃表达过夜;“2”“3”试管37℃表达3h至4h)。