真核基因表达系统资料
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真核生物的基因表达调控染色质基因激活转录和转录后加工翻译和翻译后加工一、染色质水平基因表达调控(一)染色质结构与功能:常染色质(euchromatin):,对DNase I敏感,DNA可降解为约200 bp 或其倍数的片断;基因表达处于活性状态。
异染色质(heterochromatin):结构高度致密处于凝聚状态的染色质,对DNase I不敏感。
基因表达活性处于阻遏状态。
组成性异染色质:所有细胞,整个细胞周期都存在的异染色质。
其DNA不含基因,因而一直保持凝聚状态。
兼性异染色质(facultative heterochromatin):在特定细胞,生长发育的特定阶段,由常染色质凝聚转变成的异染色质。
(二)染色质重塑:染色质重塑(chromatin remodeling):与转录相关的染色质局部结构的改变称之。
主要有:核小体重塑、DNA甲基化、组蛋白共价修饰。
1、核小体重塑:(nucleosome remodeling)核小体重塑:ATP依赖性酶蛋白复合体参与的核小体的移位、替换和去组装改变。
核小体重塑过程:基因活化蛋白结合;ATP依赖性酶蛋白复合体结合转录活性区;ATP依赖性酶水解A TP,提供能量;移去或替换核小体。
2、DNA的甲基化:常见真核生物DNA5’-CpG-3’序列,即CpG岛(CpG-rich islands)胞嘧啶第5位C被甲基化。
甲基化程度使DNA结构稳定。
甲基化程度与基因表达活性呈反比关系。
3、组蛋白共价修饰:使组蛋白与DNA双链的亲和力改变,染色质的局部结构改变。
共价修饰方式:乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。
最常见:乙酰化和甲基化。
3、组蛋白共价修饰:使组蛋白与DNA双链的亲和力改变,染色质的局部结构改变。
共价修饰方式:乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。
最常见:乙酰化和甲基化。
组蛋白的乙酰化与去乙酰化酶:组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyl transferases HATs ) 组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase HDAC)修饰位点:核心组蛋白外周结构域,氨基末端Lys残基的NH3。
真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒/昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。
简而言之,酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高,生产成本低,但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同;哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质,但其表达量低、操作烦琐。
1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母,后来相继出现其他种类酵母,其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。
甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志,可在大肠杆菌大量扩增。
甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列,容易整合入酵母染色体中。
大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1),在强启动子作用下,以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。
甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平,实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。
2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达,其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。
杆状病毒系统蛋白表达量很高,而且大部分蛋白质能保持可溶性。
杆状病毒基因组较大(130kb),可容纳大的外源DNA片段;杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性,安全性较高。
目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体,能快速有效地产生重组杆状病毒。
与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比,大大简化了操作步骤,缩短了鉴定重组病毒的时间,适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠,它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰,在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质,几乎都能在细胞内准确定位,在医学研究中得到广泛应用。
虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大,更耗时,成本更高,但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
真核细胞基因表达
真核细胞基因表达是指真核细胞中基因转录、转译、翻译和调控的过程。
真核细胞具有细胞核,基因组较大,其中包含了大量的非编码RNA和调控元件。
基因表达调控是通过转录因子和多种调控蛋白质进行的。
在真核细胞中,转录后的前mRNA需要通过剪接形成成熟的mRNA,然后进入细胞质,翻译成蛋白质。
翻译过程中还存在调控,如翻译后修饰、蛋白质降解等。
基因表达的细节和调节机制非常复杂,但是对于理解生物学和疾病机理非常重要。
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真核表达系统原核表达系统因其工艺简单、速度快而为人类带来许多便利,eg制药业由原先的脏器提取→发酵制备(IFN),降低了本钱,扩大了来源,也缩短了生产周期。
可是由于原核细胞中没有转录后加工系统,不能识别、剪除内含子,因此很多真核基因就无法在原核细胞中表达;另外,原核细胞缺乏翻译后加工系统,不能对翻译的蛋白质进一步修饰加工。
因此许多糖蛋白在原核细胞中表达后,尽管一样形成蛋白质具有抗原性,却因为不能糖基化,而不产生功能。
例如,C1INH是一种高度糖基化的单链蛋白(49%分子量为糖基),因其不可逆结合C1q而阻断补体活化途径,是一种极好的补体抑制剂,若是C1INH缺点可致使遗传性血管神经性水肿(HANE),表现为全身水肿,尤其是喉头水肿,能够输血,以正常人血中的C1INH来补充医治,但长期输血价钱高,易引发副反映,故可用基因工程产品来医治HANE,但因C1INH为高度糖基化蛋白,在中表达没有活性,现已有人利用CHO表达C1INH,拟用于医治。
一、优势1.具转录后加工系统;2.具翻译后修饰系统;3.可实现真正的分泌表达,分泌至细胞外简化了纯化工艺。
二、真核基因结构及表达调控特点:(一)、基因结构特点:1.DNA极为丰硕,具全能性——mRNA丰度(选材)克隆真核基因的经常使用方式是提取细胞mRNA,反转录合成为cDNA。
尽管真核生物各类细胞中基因含量、种类相同,但却不是选择任一细胞提取其mRNA就可反转录合成出目的基因cDNA,因不同细胞间存在mRNA的丰度问题,基因在不同细胞中转录情形不一样,产生不同的功能蛋白,才表现出各类细胞的丰硕多样性。
故应选择mRNA丰度高的细胞为材料,eg. TNFα基因的克隆是以前髓细胞或早幼粒细胞为材料来源(Alice,1985)。
2.结构复杂,DNA与组蛋白结合,并在其外有核膜——真核生物转录、翻译不可能持续进行。
3.不持续性:内含子、外显子。
内含子可能参与基因调控,不同剪切方式产生不同蛋白质。
真核基因转录调控(讲课内容,缺图)张俊武一.基因表达概述基因表达就是储存遗传信息的基因通过转录及翻译等步骤产生具有一定生物功能的蛋白质的整个过程。
典型的细菌基因组包括约4,000个蛋白质基因,人基因组包括约10万个蛋白质基因,但在某一时刻仅有一部分基因表达。
例如大肠杆菌中通常有5%的基因处于高水平转录活性状态。
一些基因产物需要以很大的数量存在于细胞中来行使其功能,例如蛋白质生物合成的延伸因子在细胞内含量极其丰富。
有些基因产物在细胞内的含量则很少,如修复DNA损伤的有关酶在一个细胞中可能仅含几个分子。
对于同一基因产物的需要也可能随时间而改变,例如细菌中一些代谢途径所需的酶可随食物源泉的变化或消耗而增减。
在多细胞真核生物发育过程中,一些影响细胞分化的蛋白质仅在一部分细胞中存在短暂时间。
一些具有特殊功能细胞的特异化可能极大地影响了对某种基因产物的需要,最典型的例子就是在红细胞中的血红蛋白具有极高的浓度。
总之在细胞代谢调节、细胞分化以及个体发育过程中,基因表达调节都是一个非常重要的组成部分。
正象细胞对不同蛋白质的需要变化一样,各个基因表达调控的机制也是变化的。
一些基因产物总被需要,并且它们的基因在一种生物或有机体的全部细胞中基本上以恒定的水平表达,这些基因被称作管家基因(housekeeping genes)。
例如,许多催化中心代谢途径(如柠檬酸循环)各步骤的酶的基因、肌动蛋白(actin)基因都是管家基因。
恒定的、似乎不被调节的基因表达被称作基本的基因表达(constitutive gene expression)。
实际上,基本的基因表达也是在一定的机制控制下进行的。
一些基因产物的数量在应答分子信号时增加或减少。
在特定条件下表达产物增加的基因称为可诱导(inducible)基因。
可诱导基因在特定条件下增强表达的过程叫诱导(induction)。
例如,许多编码DNA修复酶的基因,在应答高水平的DNA损伤时被诱导。