细胞培养的基本操作

细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。

细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。

1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。

6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。

通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。

这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。

细胞培养基本操作技能无菌操作基本技术1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。

每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。

实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。

操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。

实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。

实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。

3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。

勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。

容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。

对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。

操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。

5. 定期检测下列项目：5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。

5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。

实验用品1. 种类︰1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。

细胞培养无菌操作基本技术细胞培养是现代生物学研究中常用的一种实验技术，能够使细胞在体外条件下生长和繁殖。

无菌操作是细胞培养过程中非常重要的一项技术手段，可以保证细胞培养环境的无菌纯净，避免细胞被外部微生物污染。

本文将介绍细胞培养中常用的无菌操作基本技术，并结合实例进行详细说明。

无菌操作基本技术主要包括以下几个方面：1.实验前准备在进行无菌操作前，首先需要准备好实验所需的培养基、培养器具和其他实验工具。

这些器具和工具需要经过高温高压灭菌处理，以确保其无菌。

此外，实验人员还需佩戴无菌手套、穿戴无菌实验服，并对实验台面进行彻底的清洁消毒，保持实验环境的无菌。

2.灭菌操作在进行无菌操作前，需要对培养器具进行灭菌处理。

常用的灭菌方法有干热灭菌和湿热灭菌两种。

干热灭菌是将培养器具置于高温烘箱中，持续加热若干小时，以达到灭菌目的。

湿热灭菌则是将培养器具置于高压高温的蒸汽中，进行高压灭菌。

此外，对于一些无法耐受高温高压的培养器具，还可使用化学灭菌方法，如使用过氧化氢和酒精进行消毒。

3.无菌操作技术在进行无菌操作时，需要遵循一定的操作规范。

首先，实验人员应将实验器具放入无菌工作台中，在UV灯的照射下进行灭菌处理。

然后，实验人员需要将自己的双手放入无菌手套中，并使用无菌皮培养工具进行操作。

接下来，需要准备好含有培养基的培养皿，并用无菌注射器将细胞转移到培养皿中。

在操作过程中，需要注意避免造成培养基的污染，尽量减少对培养基的接触时间，以防止细菌或其他微生物的污染。

4.维持无菌操作环境在进行细胞培养过程中，需要维持无菌操作环境。

实验人员应避免在实验台面上散落细胞培养基、细胞碎片或其他可能造成污染的物质。

细胞培养箱和无菌安全柜的门不可长时间打开，以防止空气中的微生物进入工作区域。

并且需要定期对无菌安全柜和细胞培养箱进行清洁和消毒。

同时，实验室人员需要经常进行手部清洁，并定期更换无菌手套和实验服，保持实验环境的无菌。

细胞培养中的无菌操作是进行细胞培养实验的基础，能够产生可靠的实验数据，并在细胞学研究中发挥重要作用。

细胞培养室操作规程1. 引言在细胞培养室进行实验时，需要遵循一定的操作规程，以确保实验的顺利进行并保护实验人员和细胞的安全。

本文档旨在提供详细的细胞培养室操作规程。

2. 实验前准备在进行细胞培养室实验前，需要做好以下准备工作：- 穿戴实验室制定的个人防护装备，如实验服、手套、口罩和护目镜。

- 检查实验室设备和操作台的清洁度，并确保工作区域整洁无杂物。

- 准备实验所需的培养基、细胞培养物和实验器材，并进行必要的消毒处理。

- 检查培养器具和实验器材的完整性和干净程度。

3. 实验操作在进行细胞培养室实验时，需按照以下操作规程进行：- 打开细胞培养室的门时，先用消毒剂擦拭手部，然后使用洗手液洗手并彻底冲洗干净。

- 进入细胞培养室后，先进行操作台和培养器具的消毒处理，使用消毒剂彻底擦拭工作面和器具表面。

- 进行各项实验操作前，务必佩戴好手套，勿将裸露的手部接触培养物或实验器材。

- 操作过程中，避免发生剧烈动作和摇动，以防止细胞培养物的污染。

- 操作完成后，彻底清洁和消毒操作台、培养器具和实验器材，确保无残留。

4. 废弃物处理细胞培养室中产生的废弃物需按照以下要求进行处理：- 生物废弃物和污染物应放入专用的标有生物危险标志的中，严禁随意丢弃。

- 已消毒处理的实验器皿和培养器具应单独收集，放入装有消毒液的中浸泡，待处理完毕后进行干燥和垃圾分类处理。

5. 安全措施在细胞培养室实验中，请注意以下安全措施：- 不得在实验室内饮食、吸烟或使用化妆品。

- 注意保持良好的个人卫生，经常洗手、勤换手套，避免感染的交叉传播。

- 遇到实验室事故或异常情况时，应立即向负责人报告，并按照相关应急预案进行处理。

6. 总结细胞培养室操作规程的遵守对于实验的成功和细胞的安全至关重要。

在进行实验前准备、实验操作、废弃物处理和安全措施等方面都需要严格按照规程执行。

保持实验室整洁和个人卫生，是保证实验可靠性和重复性的基础。

36细胞培养旳过程及注意事项细胞旳培养过程及注意事项；根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种；1.组织块培养法；(1)基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪；2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞旳培养过程及注意事项根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。

一、原代培养（一）过程原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种及培养等环节。

原代培养旳措施诸多, 基本和最常用旳是组织块培养法和分离细胞法。

1.组织块培养法(1)基本操作过程1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪将附在其上旳脂肪和结缔组织清除洁净。

再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利旳眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks液漂洗多次, 直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。

2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养瓶皿中, 并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上, 量不要过多, 要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一侧旳对侧面加足培养液, 勿使组织块与培养液接触, 塞紧瓶塞；4）、将种植了组织块旳一侧朝上, 静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1 h到3h后翻瓶, 使贴壁旳组织块浸没与培养液中, 静置；5）、每隔2到3天更换一次培养液, 或者根据培养瓶种颜色旳变化确定换液时间。

2.注意事项1）、组织块接种后旳前3天, 从组织块向外迁徙旳细胞数很少, 组织块旳黏附不牢固, 在观测和移动旳过程中, 注意不要引起液体旳振荡。

要防止常常翻动和振动, 否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。

2）、加入旳培养液不适宜过多, 防止浸泡旳组织块受轻微旳波动而脱落下来。

细胞培养常规操作流程英文回答：Cell culture is a fundamental technique in biological research, allowing scientists to study and manipulate cells in a controlled environment. The standard procedure forcell culture involves several key steps.First, I need to prepare the culture medium. This is the nutrient-rich solution that provides cells with the necessary nutrients and growth factors to survive and multiply. The medium is usually composed of a basal medium, such as DMEM or RPMI, supplemented with fetal bovine serum, antibiotics, and other additives. I carefully measure and mix the components to ensure a proper balance of nutrients.Next, I sterilize all the equipment and materials that will come into contact with the cells. This includes the culture dishes, pipettes, and media bottles. Sterilization can be achieved by autoclaving, which uses high-pressuresteam to kill any microorganisms present. Alternatively, I can use a filter to remove bacteria and fungi from the media.Once everything is sterilized, I can start the cell culture process. I thaw frozen cells or obtain fresh cells from a tissue sample. I then count the cells using a hemocytometer or an automated cell counter. This step is important to determine the cell density and ensure that I seed the appropriate number of cells for the experiment.After counting the cells, I seed them into the culture dishes or flasks. The dishes are usually coated with a substance that promotes cell attachment, such as collagen or gelatin. I carefully distribute the cells evenly across the surface and place the dishes in an incubator set at the appropriate temperature and CO2 concentration. The incubator provides a controlled environment that mimics the conditions inside the body.Over the next few days, I regularly check the cells under a microscope to monitor their growth and health. Ialso change the culture medium every 2-3 days to provide fresh nutrients and remove waste products. This process is known as feeding the cells.Sometimes, I need to subculture the cells to maintain their health and prevent overcrowding. This involves detaching the cells from the culture dish using an enzyme called trypsin, and then transferring them to a new dish with fresh medium. Subculturing allows the cells to continue growing and dividing without becoming too dense.Throughout the cell culture process, I need to maintain aseptic technique to prevent contamination. This means working in a clean and sterile environment, wearing gloves, and using sterile tools. Contamination can lead to the growth of unwanted microorganisms and compromise the experiment.In conclusion, cell culture is a meticulous processthat involves preparing the culture medium, sterilizing equipment, seeding the cells, maintaining them in the incubator, and regularly feeding and monitoring theirgrowth. It requires attention to detail, patience, and aseptic technique to ensure successful cell culture experiments.中文回答：细胞培养是生物研究中的一项基本技术，允许科学家在受控环境中研究和操作细胞。

细胞培养常规操作流程英文回答：Cell culture is a fundamental technique used in biological research and biotechnology. It involves the growth and maintenance of cells in a controlled environment, providing a platform for studying cellular behavior, drug discovery, and tissue engineering. Here, I will outline the general workflow of cell culture operations.1. Cell Line Selection:The first step in cell culture is to select an appropriate cell line for the study. This can vary depending on the research objectives. For example, if I am interested in studying cancer cells, I might choose a well-established cancer cell line like HeLa cells.2. Preparation of Culture Medium:Next, I prepare the culture medium, which provides the necessary nutrients and growth factors for the cells. The medium composition can vary depending on the cell type. For example, I might use DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) supplemented with fetal bovine serum, antibiotics, andother additives.3. Sterilization and Aseptic Technique:To maintain a sterile environment, I sterilize all the equipment and materials that will come into contact withthe cells. This includes the culture dishes, pipettes, and media bottles. I also follow aseptic techniques, such as working in a laminar flow hood and wearing gloves, to minimize the risk of contamination.4. Cell Seeding and Passage:Once the cells are ready, I seed them onto a culture dish or flask. The seeding density can vary depending onthe cell type and experimental requirements. After acertain period of growth, the cells reach confluence andneed to be passaged. This involves detaching the cells from the culture vessel, usually using trypsin, and transferring them to a new dish or flask.5. Monitoring and Maintenance:During the cell culture process, I regularly monitor the cells for their growth and overall health. This includes checking for signs of contamination, such as bacterial or fungal growth. I also maintain the cells by regularly changing the culture medium, adjusting the pH level, and providing fresh nutrients.6. Experimental Manipulations:Once the cells have reached the desired confluence and are in a healthy state, I can perform various experimental manipulations. This can include treatments with different drugs or chemicals, genetic modifications, or exposure to specific environmental conditions.7. Cell Harvesting:At the end of the experiment or when I need to collect the cells for downstream analysis, I harvest them. This involves detaching the cells from the culture dish or flask and collecting them in a centrifuge tube. The harvested cells can then be used for further analysis, such as protein or RNA extraction.中文回答：细胞培养是生物研究和生物技术中的一项基本技术。

细胞培养基本操作细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。

细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。

一、实验前准备实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。

取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。

消毒双手和超净台。

取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。

水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。

整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。

注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。

然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。

二、制备细胞悬液吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。

上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。

离心：1000rpm，室温离心3min。

注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。

三、细胞培养离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。

向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。

培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。

24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。

四、注意事项1、解冻速度要快在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。

细胞培养的基本操作方法
1. 制备培养基：按照实验需求配制好所需的培养基，并进行质量控制和滤过处理。

2. 细胞的筛选与取样：选择适合实验需要的细胞进行培养，并从中分离出所需数量的细胞。

3. 细胞的接种：将取出的细胞均匀地分布到培养皿或培养板上，并加入足量的培养基使其充分生长。

4. 细胞的观察和记录：观察细胞在培养基中的生长情况，并及时记录。

5. 细胞的维护和传代：在适当的时间点及条件下，通过传代将细胞扩增并保持其良好的生长状态。

6. 细胞的冻存：在一定的条件下，将细胞进行保存和冻存，以备后续实验使用。

7. 细胞的再生：在需要时，重新接种冻存细胞并恢复其生长状态。

8. 细胞的应用：根据实验需求，将细胞用于不同的实验设计中。