吸去旧培养基， PBS清洗 加入胰酶消化 终止胰酶消化并 吹打
细胞冻存的注意事项：
（1）冻存液要最先配置。 原因一：二甲基亚砜（DMSO）在加入血清时会产热损伤细胞。 原因二：如果先用血清重悬细胞，再加入DMSO，则局部DMSO浓度过高，会 对细胞造成严重损伤（DMSO在室温下对细胞有害），影响日后的复苏。 （2）冻存时要求细胞状态良好，最好是取对数期细胞冻存，以保证复苏后的存活率。 （3）最大限度的减少DMSO在室温下和细胞接触的时间。 （4）冻存时要缓慢降温（慢冻），用细胞冻存盒可以做到每分钟降低1℃，细胞冻 存盒应先放在4 ℃预冷，以减少细胞和DMSO在室温接触的时间；如果没有冻 存盒，则采用程序降温法。（4℃冰箱40min， -20℃冰箱30-60min， 置于-80 ℃ 过夜，次日转入液氮。）
（5）加入适量培养基重悬细胞，分装入培养瓶中，补足培养基。
（6）培养：置于37℃，5%CO2温箱培养。
原代组织块培养法
（1） 剪切：用Hanks液漂洗二三次以去掉组织块表面血污，剪成1mm3小块。 （2） 摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml 培养瓶底可摆布20~30块。 （3） 轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞， 置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 （4） 培养：从微箱中取出培养瓶，46度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少 许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。 置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
细胞培养主要的设施器材
设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、冰柜、恒温 水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。 器材： 一、玻璃器材 玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，（现已较少使用）。 二、塑料器材 多孔培养板（ 6,12,24,48,96）、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管。 2 三、橡皮器材 橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。 四、金属器材 剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头 五、其他物品 纱布、注射器、针头、滤头
