细胞培养的基本方法

细胞实验的基本操作方法
细胞实验的基本操作方法可以包括以下步骤：
1. 细胞培养：将待实验的细胞株从冷冻保存中取出，放入无菌培养皿内，并加入适宜的培养基。

设置适当的培养条件，如温度、湿度和二氧化碳浓度等。

定期观察细胞生长情况并进行细胞的传代。

2. 细胞传代：当细胞培养达到一定密度时，将细胞通过酶消化方法从培养皿中取出，然后转移到新的培养皿中重新培养。

该方法可以获得更多的细胞数量，以维持细胞培养的供应。

3. 细胞分离：对于某些实验需要用到单独的细胞的情况，可以采用细胞分离的方法，如通过胰蛋白酶消化细胞外基质、抑制细胞黏附等，使细胞单个分散。

4. 细胞检测：使用显微镜观察细胞的形态变化，细胞生长情况和细胞颜色等。

也可以利用荧光显微镜观察细胞内的特定荧光标记物，如细胞核染色剂、蛋白质荧光探针等。

5. 细胞培养基交换：定期更换细胞培养基，以保持细胞的生长状态和代谢活性。

6. 细胞处理：根据实验需要，在培养皿中添加不同浓度或种类的化合物，如药物、抗生素等，对细胞进行处理。

7. 细胞采集：根据实验需求，利用细胞刮刀、吸球等方法将细胞从培养皿中收集起来。

8. 细胞冻存：将细胞保存在液氮中，以便长时间保存和后续使用。

9. 细胞裂解：对于某些实验需要提取细胞内的特定分子或蛋白质，可以使用细胞裂解液将细胞内组分释放出来。

10. 细胞计数：通过显微镜或细胞计数仪等方法，对细胞数量进行计数和测定。

请注意，具体细胞实验的操作方法可能因不同的实验目的和细胞类型而有所差异，上述仅为一般的基本操作方法。

在进行细胞实验时，应严格遵守相关实验室规范和安全操作指南。

一．发展概况组织培养(Tissue culture)是在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下。

使从体内取出的组织生存、生长繁殖和传代，并维持原有的结构和功能特性。

广义的组织培养与体外培养同义。

体外培养(Invitro)包括所有结构层次的培养，即：组织培养、细胞培养和器官培养。

所谓细胞培养(Cell culture)是指细胞包括单个细胞在体外条件的生长。

组织培养的发展史已有近百年，最初的组织培养是胚胎学和微生物学的引申，建立于无菌原则上，用天然体液（如胎汁、血浆）来维持从整体切下的组织块，对细胞进行形态和功能的观察。

通过许多学者大的改进和革新，培养基由天然动物血浆改为合成培养基，促进细胞生长物质从胎汁改为动物血清。

现在全世界贮存的细胞约有万种以上。

组织培养不仅是细胞生物学必需的技术，也是分子生物学、肿瘤学、遗传学和免疫学等学科必要的方法。

二．基本原理和方法体外培养细胞的生存条件：(一)营养。

体外培养细胞所需的营养物质与体内相同，主要有糖、氨基酸和维生素三大类。

目前市面上销售的合成培养基如1640、199等所含的氨基酸已足够，但在使用合成培养基时，仍需加入一些天然成份，如人或动物的血清、血浆和胎汁等。

目前主要使用血清，以牛血清为主。

血清的生物效应早已证明，它含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质等。

不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁。

不同血清对细胞作用不同。

以小牛血清最好，成年牛和马血清次之。

合成培养基中不加血清也能维持细胞生存，但不能很好生长，加入5%的血清，对大多数细胞来说，能维持细胞不死和缓慢生长，要使细胞正常生长，一般需加10～15%的小牛血清。

每个批号血清使用前要加热处理，一般灭活于56℃水浴中30分钟，每个批号血清使用前要加热处理，一般灭活于56℃水浴中30分钟，每5分钟摇一次。

10%血清营养液能促进细胞增殖称为生长液，2～5%血清培养液不能使细胞增殖而只能维持其生存称为维持液。

细胞培养基本操作细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。

细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。

一、实验前准备实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。

取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。

消毒双手和超净台。

取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。

水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。

整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。

注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。

然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。

二、制备细胞悬液吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。

上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。

离心：1000rpm，室温离心3min。

注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。

三、细胞培养离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。

向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。

培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。

24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。

四、注意事项1、解冻速度要快在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。

动植物细胞培养的基本原理和操作技巧动植物细胞培养是一种重要的生物学技术，可以用来研究细胞生物学，生长发育，细胞分化，细胞遗传学等方面的问题。

其基本原理是将动植物组织中的细胞分离，并通过合适的培养基和条件来促进细胞的增殖和分化，使其在体外生长和繁殖。

1.细胞分离：首先将动植物组织样品进行无菌处理，然后将其分离成单个的细胞，可以通过机械切割，酶解、搅拌、过滤等方法进行。

2.细胞培养基：细胞培养需要合适的培养基，其中包含生长所需的营养物质，如糖类、氨基酸、维生素等。

同时，还需要添加适当的生长因子和激素，以促进细胞的增殖和分化。

3.细胞培养条件：细胞培养需要适宜的环境条件，如温度、pH值、湿度等。

一般来说，细胞培养的温度范围是20-30°C，pH值在6-8之间，无菌操作和生物安全措施也是重要的。

1.无菌操作：细胞培养需要在无菌条件下进行，否则会导致细胞的感染和杂交。

无菌操作包括对培养器具、培养基、工作表面进行消毒，使用无菌技术操作，以及避免感染源等。

2.细胞分离：细胞分离是细胞培养的关键步骤，需要根据组织类型和目的选择适当的方法。

对于植物细胞，可以使用酶解法将组织切割成小块，然后用酶解液消化细胞壁。

对于动物细胞，可以使用组织切割器具进行机械分离，或者用酶解液消化细胞间粘连。

3.细胞培养：将分离的细胞均匀地放置在含有适当培养基的培养器具上，继续培养。

培养器具可以是培养皿、试管等，培养基可以根据需要选择不同种类。

在培养过程中，需要定期观察细胞生长情况，及时补充培养基。

4.细胞增殖和分化：通过添加适当的生长因子和激素，可以促进细胞的增殖和分化。

生长因子可以是植物激素、生长因子，如植物生长素、激素等。

激素可以是动物生长激素、血清、培养基中的成分等。

这些因子能够模拟细胞在体内的生长环境，促进细胞发育和分化。

5.细胞传代：当细胞生长至密集，容器中细胞数量过多时，需要进行细胞传代，将细胞重新分离和培养。

细胞传代可以通过机械分离、酶解分离等方法进行，然后将细胞悬浮于新的培养基中继续培养。

一、实验目的1. 熟悉细胞培养的基本操作流程。

2. 掌握原代细胞培养和传代细胞培养的方法。

3. 了解细胞培养在生物学研究中的应用。

二、实验原理细胞培养是指将生物体中的组织或细胞取出，在人工条件下模拟其生理环境，使其生存、生长、繁殖或传代的技术。

细胞培养技术具有操作简便、可控性强、成本低等优点，在生物学、医学、药物研发等领域具有广泛的应用。

三、实验材料1. 仪器：显微镜、培养皿、移液枪、离心机、超净工作台等。

2. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、抗生素等。

3. 组织：动物组织（如小白鼠胚胎组织）。

四、实验方法1. 原代细胞培养（1）取动物组织，用无菌手术刀切成小块。

（2）将组织块放入含有胰蛋白酶的离心管中，37℃水浴消化30分钟。

（3）消化结束后，用移液枪吹打组织块，使细胞分散。

（4）加入适量胎牛血清终止消化，用离心机离心去上清液。

（5）加入DMEM培养基重悬细胞，接种于培养皿中。

（6）将培养皿放入细胞培养箱中培养，观察细胞生长情况。

2. 传代细胞培养（1）待原代细胞生长到一定密度后，用胰蛋白酶消化细胞。

（2）加入胎牛血清终止消化，用离心机离心去上清液。

（3）加入DMEM培养基重悬细胞，按1:2的比例接种于新的培养皿中。

（4）将培养皿放入细胞培养箱中培养，观察细胞生长情况。

五、实验结果1. 原代细胞培养：细胞呈圆形，排列紧密，生长较快。

2. 传代细胞培养：细胞形态与原代细胞相似，生长速度略慢。

六、实验讨论1. 细胞培养过程中，无菌操作至关重要，避免细菌、真菌等污染。

2. 培养基的成分和pH值对细胞生长有重要影响，需严格控制。

3. 细胞培养技术广泛应用于生物学、医学、药物研发等领域，具有广阔的应用前景。

七、实验总结通过本次实验，我们掌握了细胞培养的基本操作流程，了解了细胞培养在生物学研究中的应用。

在实验过程中，我们体会到无菌操作的重要性，以及培养基成分和pH值对细胞生长的影响。

细胞一细胞培养（一）原代培养○1胰蛋白酶消化法1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块用细胞筛过滤，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养○2组织块法1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（二）传代培养○1贴壁细胞1.先将含10%血清和1%双抗的培养基、0.25%EDTA-胰蛋白酶在37℃水浴锅中预热20min2.观察细胞融合率是否达到80%-90%3.将所需用品放入紫外照射30min的超净工作台中，物品放入前需用75%酒精擦拭或放入后立即用酒精擦拭4.吸去培养基，加入PBS冲洗两遍，洗去残留培养基，加入胰蛋白酶至刚好覆盖培养皿底 （6㎝培养皿约1ml），放入培养箱中消化0.5-2分钟5.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，轻轻吹打混匀，吸入离心管中，1000r/min离心5min6.离心后，小心吸去上清夜，加入5ml培养基轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml7.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养○2悬浮细胞1.将培养皿中的培养基吸至离心管中，1000r/min离心5分钟2.离心后吸去上清液，加入5ml培养基，轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml3.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（三）细胞冻存○1贴壁细胞冻存1.配置细胞冻存液2.吸去培养基，加入0.25%EDTA-胰蛋白酶刚好覆盖培养皿底，放入培养箱中消化0.5-2min3.消化后的细胞，转移至离心管中，1000r/min离心5min4．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml5.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中○2悬浮细胞冻存1.配置细胞冻存液2.将细胞转移至离心管中，1000r/min离心5min3．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml4.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中仪器：15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、倒置显微镜、程序性降温盒、液氮罐试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM（高糖）培养基、胎牛血清、二甲基亚砜（四）细胞复苏1.将冻存的细胞从液氮中小心取出，快速在37℃水浴锅中摇晃解冻，一般在1min内完成，若离水浴锅较远可将细胞放置在干冰上2.将冻存管内液体转移至离心管中，1000r/min离心5min3.去除上清液，加入培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至5×105个/ml4.每个6㎝培养皿加入5ml复苏后的细胞，放入37℃，5%CO2培养箱中培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）。