(优选)细胞培养基本方法从体内到体外

研究细胞功能的方法细胞是生物体的基本单位，细胞功能的研究对于理解生命的基本原理和治疗疾病具有重要意义。

为了研究细胞功能，科学家们开发了多种方法和技术，以下将介绍其中一些常用的方法。

1. 显微镜观察显微镜是研究细胞的基本工具之一，可以通过放大细胞和细胞器的形态和结构来研究细胞功能。

光学显微镜可以观察到细胞的形态、大小和内部结构，而电子显微镜则可以更高分辨率地观察到细胞的超微结构，如细胞核、线粒体和内质网等。

2. 细胞培养细胞培养是一种将细胞从体内或体外获取，并在营养液中培养和繁殖的方法。

通过细胞培养，可以研究细胞的生长、分化、增殖和死亡等基本生理过程，以及细胞对外界刺激的响应和反应。

3. 细胞染色技术细胞染色技术通过染色剂与细胞的特定结构或分子相互作用，使其在显微镜下可见。

常用的细胞染色技术包括荧光染色、免疫染色和核酸染色等。

荧光染色可以通过标记特定抗体或荧光探针来观察特定蛋白质或核酸的分布和表达水平。

免疫染色则可以通过特定抗体与细胞表面或内部蛋白质的结合来研究细胞的功能和相互作用。

核酸染色可以用来观察细胞的DNA或RNA含量和分布情况。

4. 分子生物学技术分子生物学技术是研究细胞功能的重要手段之一，包括DNA克隆、PCR、基因敲除和基因表达等技术。

DNA克隆可以用于获取目标基因的大量复制，以便进行后续的研究；PCR技术可以在体外扩增特定DNA片段，用于基因分型、检测和定量等；基因敲除技术可以通过人为干预细胞的基因组，研究特定基因的功能和调控机制；基因表达技术可以通过转染外源基因到细胞中，研究目标基因的功能和表达水平。

5. 蛋白质组学蛋白质组学是研究细胞中蛋白质的种类、结构和功能的方法。

通过质谱技术可以鉴定和分析细胞中的蛋白质组成，进而研究细胞的代谢途径、信号传导和蛋白质相互作用等。

蛋白质组学还可以用于研究细胞的蛋白质修饰和翻译后修饰等重要生理过程。

6. 基因组学基因组学是研究细胞中基因组的组成、结构和功能的方法。

细胞培养技术与应用细胞培养技术是生物学研究和生物技术应用中的重要工具之一。

通过体外培养细胞，可以实现对细胞特性和功能的研究，为疾病治疗、药物筛选和组织工程等方面的应用提供基础。

本文将介绍细胞培养技术的基本原理及其在生物研究和应用中的重要性。

一、细胞培养技术的基本原理细胞培养技术是将细胞从体内或体外取出，在适当的培养基中提供所需的养分、激素和生长因子等，使细胞在体外环境下继续分裂和增殖的一种技术手段。

其基本原理包括以下几个方面：1. 培养基：培养细胞所需的培养基中包含葡萄糖、氨基酸、维生素、盐和生长因子等营养物质，以提供细胞生长和分裂所需的能量和物质基础。

2. 温度和气体环境：细胞在体外培养时需要适宜的温度和气体环境。

常用的培养温度为37摄氏度，培养箱内需控制紧闭状态与外界绝对统一的紧闭状态，以保持适宜的氧气和二氧化碳浓度。

3. 细胞传代：细胞在培养过程中会不断分裂和增殖，但过多的细胞会导致营养不足和细胞凋亡。

为了保持细胞的健康和活性，需要适时进行细胞传代，将细胞分离并接种到新的培养基中。

二、细胞培养技术的应用1. 生物学研究细胞培养技术在生物学研究中发挥着重要作用。

通过培养和传代细胞，可以研究细胞的特性和功能。

例如，通过体外培养肿瘤细胞，可以研究癌细胞的生物学特性和抗癌药物的有效性；通过培养干细胞，可以研究干细胞的分化和再生能力，为组织工程和再生医学提供理论基础。

2. 药物筛选细胞培养技术可以用于药物的筛选和评价。

通过体外培养细胞，可以评估药物对细胞的毒性和药效。

特别是在新药研发中，细胞培养技术可以节省时间和成本，提高药物筛选效率。

例如，通过培养股骨头坏死细胞，可以筛选对病变细胞具有保护作用的药物，为股骨头坏死的治疗提供新的药物途径。

3. 组织工程细胞培养技术对组织工程的发展起到了至关重要的作用。

通过培养和扩增体细胞，可以获得大量的细胞来源，为组织工程提供源源不断的细胞资源。

利用细胞培养技术，可以将细胞加载到生物支架材料上，并培养出具有生物学功能的组织工程构建物，如人工骨骼、人工血管等。

生物技术知识点生物技术是一门综合性的学科，涉及生物学、化学、物理学等多个学科的知识。

它利用生物体的自然功能和生物体的特殊性质，通过改变生物体的遗传物质和代谢过程，来实现对生物体的改良、利用和控制。

下面将介绍几个生物技术的重要知识点。

1. DNA重组技术DNA重组技术是生物技术的核心技术之一。

它通过将来自不同生物体的DNA片段进行切割、连接和复制，实现对DNA的重组。

这样可以将具有特定功能的基因导入到目标生物体中，使其表达出所需的特性。

DNA重组技术在农业、医学和工业等领域具有广泛的应用，如转基因作物的培育、基因治疗和生物制药等。

2. PCR技术PCR（聚合酶链式反应）技术是一种快速、高效的DNA复制技术。

它通过反复进行DNA的变性、引物结合和DNA合成，可以在短时间内扩增特定的DNA片段。

PCR技术在分子生物学研究、疾病诊断和法医学等领域有着重要的应用，如DNA指纹鉴定和病原体检测等。

3. 基因测序技术基因测序技术是对生物体遗传物质（DNA或RNA）进行测序的技术。

它通过对DNA或RNA的序列进行分析，可以揭示生物体的遗传信息和功能。

随着测序技术的不断发展，高通量测序技术的出现使得大规模基因组测序成为可能，推动了基因组学和生物信息学的发展。

4. 细胞培养技术细胞培养技术是将细胞从体内或体外分离出来，在含有营养物质和适宜环境条件的培养基中进行培养和繁殖的技术。

细胞培养技术广泛应用于细胞生物学、生物医学研究和生物制药等领域。

它不仅可以研究细胞的生理功能和代谢过程，还可以用于生产重组蛋白和病毒疫苗等生物制品。

5. 蛋白质工程技术蛋白质工程技术是通过改变蛋白质的氨基酸序列和结构，来改变其功能和性质的技术。

蛋白质工程技术在药物研发、酶工程和生物催化等领域有着广泛的应用。

通过蛋白质工程技术，可以设计和合成具有特定功能的蛋白质，用于治疗疾病、生产工业化合物和改良农作物等。

6. 基因编辑技术基因编辑技术是一种精确修改生物体基因组的技术。

体外培养：将活体细胞成分（活体组织、活体器官、活体细胞）甚至活的个体（病原微生物）从体内或寄生体内取出放在类似于体内生存环境的体外环境，让其生长发育的过程。

2、器官培养：将活体器官或器官原基放在体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的过程。

3.器官的体外培养：值整个器官、器官的一部分或器官原基放在体外环境中，让其生存和生长的过程。

4、组织培养：将活体组织放在体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的过程。

5、细胞培养：将活体细胞（分散的细胞）放在体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的过程。

6.体内培养：将活体结构成分，从生物体内或寄生虫体内取出放在另一种生物体内然后进行生长发育的过程。

7.细胞系：原代培养植物经首次培养后获得的种群。

8、细胞株：通过选择法或克隆法，从原代细胞器中或培养物中获得的具有特殊性质或标志的培养物称为细胞株。

9、原代培养：指第一次培养将培养物放置在体外培养环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。

10、传代培养：指培养物长满培养空间，并发生相互接触性抑制现象，需要将培养物分割成小部分，重新将培养物放入另外的培养器皿内进行培养的过程。

11、生长基质：泛指培养物附着的各种介质。

狭义特指在塑料或玻璃表面涂布一层能够促进培养物吸附，帖壁与铺层的生物活性物质。

12、复苏：以一定的复温速率将冻存培养物恢复到常温的过程。

13、动物细胞大规模培养技术：人工条件下（设定PH值，温度溶氧，培养工艺等）在动物细胞生物反应器中高密度大量的培养有用动物细胞，以生产珍贵生物制品的技术。

14、悬浮培养：质细胞在生物反应器中自由悬浮培养的过程。

15、固定化培养：将动物细胞与水不溶性载体结合起来在进行培养的过程。

16、结缔组织：是动物体内主要的支持性组织，由结缔组织和大量间质构成。

17、寄生虫的体外培养：模拟宿主体内环境，对寄生虫某一生活史阶段的虫体或细胞进行离体培养过程。

间充质细胞：各种结缔组织细胞的干细胞。

培养细胞的流程
细胞培养是生物学实验中非常重要的一项技术，它可以用于细胞生物学研究、药物筛选、疾病模型建立等多个领域。

下面将介绍一般细胞培养的流程。

首先，准备工作。

在进行细胞培养前，需要准备培养皿、培养基、细胞传代所需的胰酶等材料。

同时需要消毒工作台和培养箱，确保实验环境的无菌。

接着，解冻细胞。

如果是从冷冻状态中取出细胞进行培养，首先需要将冻存管放入37摄氏度的水浴中迅速解冻，解冻后将细胞转移到预先加热的培养基中。

然后，传代细胞。

当细胞生长到一定密度时，需要进行传代操作，以保证细胞的健康生长。

传代操作需要用到胰酶等酶类物质，可以将细胞从培养皿中剥离出来，然后转移到新的培养皿中。

接下来，细胞培养。

将细胞悬浮在培养基中，放入培养箱中进行培养。

培养箱中需要保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，以提供良好的生长环境。

最后，细胞观察和实验。

在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和生长状态，确保细胞的健康生长。

同时可以进行相关的实验，如药物处理、基因转染等。

综上所述，细胞培养是一个复杂而又重要的实验技术，需要严格控制实验条件，确保细胞的健康生长。

通过以上流程，可以有效地进行细胞培养，并为后续的实验提供可靠的细胞基础。

离体培养操作流程
离体培养是指在人工控制环境下，将植物或动物组织、细胞从生物体内取出，在无菌条件下进行培养的技术。

其操作流程大致如下：
1. 材料准备：选取健康组织或细胞，准备无菌培养基和器械。

2. 无菌操作：在超净台内，使用消毒剂处理材料，然后用无菌水清洗多次。

3. 取材分割：使用无菌器械将组织切割成适合培养的小块或分散成单细胞悬液。

4. 接种培养：将处理过的组织或细胞接种到无菌培养皿中的培养基上。

5. 培养观察：放入恒温恒湿培养箱中进行培养，定期更换新鲜培养基，并观察记录细胞生长状况和形态变化。

6. 孵育扩增：必要时进行传代培养，以获得足够数量的细胞或组织用于后续实验研究。

实验室细胞培养的一般步骤细胞培养是一项重要的实验室技术，广泛应用于生命科学研究以及医药产业中。

下面将为您介绍一般的细胞培养步骤，希望能为您提供一些指导意义。

第一步：制备培养基细胞培养的第一步是制备适合细胞生长的培养基。

培养基通常包括营养物质、氨基酸、维生素、生长因子等，可以为细胞提供足够的养分和环境条件。

根据不同的细胞类型和实验目的，制备不同种类和浓度的培养基。

第二步：分离细胞在细胞培养之前，需要将细胞从组织、器官或已有培养物中分离出来。

通常采用酶消化、机械剪切或离心等方法来分离细胞。

分离后，细胞可以在培养基中生长和繁殖。

第三步：细胞接种将分离出的细胞接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中。

接种密度要适当，不宜过稀或过密。

同时，需要将培养基中的氧气和二氧化碳平衡，通常使用CO2培养箱来提供适宜的气体环境。

第四步：细胞培养经过接种后，细胞开始在培养基中生长和分裂。

在培养过程中，需要控制细胞的温度、湿度和pH值，保持适宜的生长条件。

此外，定期更换新鲜的培养基可以提供足够的营养物质，维持细胞的正常生长。

第五步：细胞检测和观察细胞培养的过程中，需要定期对细胞进行检测和观察。

包括细胞数量的计数、形态的观察和生长曲线的绘制等。

通过这些检测和观察，可以了解细胞的健康状态、增殖速率以及其他相关参数。

第六步：细胞应用或冻存根据研究或实验的需要，可以选择将细胞用于进一步的实验、传代培养或冻存保存。

冻存细胞需要使用适当的冻存液，将细胞缓慢冷冻并存放在液氮罐中，以便长期保存。

细胞培养是一项需要耐心和细心的工作，每一步都需要严格控制条件和遵循操作规范。

只有如此，才能获得可靠的实验结果和高质量的细胞培养。

希望本文能为您提供参考，更好地开展细胞培养工作。

细胞培养相关知识点
细胞培养是指将细胞从体内或体外来源中采集到培养基中，通过提供合适的营养物质和环境条件使其在体外无限制地生长和繁殖的一种生物学实验技术。

常见的细胞培养技术包括原代细胞培养和细胞系培养。

1. 培养基：细胞培养中使用的培养基是包含多种营养物质的液体或固体培养基。

常见的培养基种类包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，并根据细胞的类型和特殊需要进行相应的改制。

2. 细胞分离：通过一系列的操作将组织中的细胞分离出来，常用的方法有机械剪切、酶消化和离心等。

3. 细胞传代：细胞的传代是指将细胞从旧的培养皿中转移到新的培养皿中，以保持细胞的生长状态和增殖能力。

细胞传代的方法有裂解法、胶原酶法和选择性黏附法等。

4. 培养条件：细胞的生长需要适宜的温度、湿度、pH值和气体环境。

常见的培养条件为37℃、5% CO2和95%湿度。

5. 防止细胞污染：细胞培养中常见的污染源有细菌、真菌和支原体等。

常用的防止污染的方法包括消毒培养器具和介质、使用无菌操作等。

6. 细胞检测：常用的检测方法包括细胞形态观察、细胞数量计
数、细胞活力测定、染色体核型分析和细胞分化等。

7. 细胞培养的应用：细胞培养技术在生物医学研究中有广泛的应用，如药物筛选、疾病模型建立、组织工程和基因工程等。

注：以上所列举的知识点为细胞培养的基本内容，具体的细胞培养操作方法和技巧可根据具体实验需求和细胞类型进行进一步学习。

第二十二章培养箱一、名词解释1.细胞培养：从体内组织取出细胞，在体外模拟体内生理环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种体外培养技术。

2.细胞培养箱：细胞培养箱通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境，对细胞、组织进行体外培养。

3.HEPA滤器：高效空气过滤器4.内门加热系统：大部分的细胞培养箱还具备内门辅助加热系统，这个系统能加热内门，有效防止内门形成冷凝水，以保持培养箱内的湿度和温度，降低污染。

5.染色体：是细胞内具有遗传性质的物体，易被碱性染料染成深色，所以叫染色体。

6.肿瘤药敏：在体外测定经不同浓度的化疗药物直接杀伤的培养肿瘤细胞的活性和数量，进而判断该肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度。

7.手套操作箱：其前面有塑料手套，操作者双手经手套伸入箱内操作，使操作箱与外界隔绝。

操作箱内侧门与缓冲室相通，有操作者用塑料手套控制开启。

当标本、培养基等在缓冲室内变成厌氧状态时，便可打开内门将它们移入工作室。

操作工作室内附有小型细胞培养室。

二、选择题【A型题】在五个选项中选出一个最符合题意的答案。

1.二氧化碳培养箱结构的核心部分，主要是（D）A.湿度调节装置B.湿润的含水托盘C.温度调节器D.二氧化碳调节器、温度调节器和湿度调节装置E.气体保护器装置2.二氧化碳培养箱调节CO2浓度范围为（A）A.0%~20%B.20%~40%C.10%~20%D.20%~30%E.30%~40%3.厌氧培养箱通过自动连续循环换气系统保持箱内的厌氧状态，其换气过程是（E）A.气体排空—净化—气体净化—N2净化—气压平衡B.气体排空—N2净化—气压平衡C.N2净化—气体排空—N2净化—气压平衡D.N2净化—气体排空—N2净化—气体排空—气压平衡E.气体排空—N2净化—气体排空—N2净化—气体排空—气压平衡4.厌氧培养箱内厌氧菌的最佳气体生长条件是（D）A.80%N2、5%CO2、15%H2B.80%N2、15%CO2、5%H2C.80%N2、10%CO2、10%H2D.85%N2、5%CO2、10%H2E.85%N2、10%CO2、5%H25.厌氧培养箱催化除氧系统箱内采用钯催化剂，其作用是（B）A.催化箱内氧气与氢气反应生成水后再由干燥剂吸收B.催化无氧混合气体内的微量氧气与氢气反应，生成水后再由干燥剂吸收C.除去箱内CO2D.除去箱内充满的氧E.除去箱内H2S6.下列能用于二氧化碳气体减压的减压阀是（A）A.二氧化碳减压阀B.氧气减压阀C.氢气减压阀D.氮气减压阀E.都可以7.细胞培养箱不适用与（B）A.普通的细菌培养和封闭式细胞培养B.厌氧细胞培养C.病毒培养D.衣原体培养E.开放式细胞培养8.二氧化碳培养箱的CO2压力不能超过（A）A.0.1MPaB.0.08MPaC.0.2MPaD.0.25MPaE.0.05MPa9.当培养箱的设定工作温度为37℃时，环境温度不能高于（D）A.40℃B.37℃C.34℃D.31℃E.环境温度不影响使用10.厌氧菌培养的三层催化剂第一层活性炭使用寿命为（C）A.一个月B.二个月C.三个月D.四个月E.可长期使用【X型题】每题有两个或两个以上正确答案。

医学实验中细胞培养的基本操作教程细胞培养是医学实验中常用的技术手段，可以通过培养细胞体外研究细胞结构、功能、代谢以及疾病的发病机制。

本文将介绍医学实验中细胞培养的基本操作教程，包括无菌操作、细胞传代和细胞培养基的制备。

一、无菌操作1. 器具准备：将工作区域和培养器具用70%乙醇喷雾消毒，将所需器具放入无菌工作台，待干燥后再进行后续操作。

2. 细胞培养基准备：将所需的细胞培养基放入无菌环境中，根据实验需求添加适量的血清、抗生素等。

3. 细胞取样：取出培养物中所需的细胞，使用吸管或移液器将细胞转移到无菌的培养基中。

4. 细胞传播：将细胞和培养基混合均匀后，转移到培养皿或培养瓶中，注意避免皿壁的污染。

5. 无菌操作结束：将使用过的培养器具进行无菌处理，清理工作区域并进行必要的消毒。

二、细胞传代1. 始代细胞收获：当细胞在培养器中达到一定密度后，使用细胞解离液将细胞从底物上解离下来。

2. 离心：将解离的细胞转移到离心管中，以适当的转速离心沉淀细胞。

3. 上清液去除：倒掉离心管中上清液，注意尽量不要干扰到细胞沉淀。

4. 细胞悬浮液制备：使用无菌PBS洗涤离心沉淀的细胞，再添加适量的细胞培养基将其悬浮均匀。

5. 细胞传代操作：将悬浮细胞转移到新的培养器具中，注意避免气泡的产生，并将培养基置于CO2孵化箱中培养。

三、细胞培养基的制备1. 培养基组成：根据实验需求，制备含有特定成分的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。

2. 液体消毒：将容器进行高温高压灭菌，确保培养基的无菌。

3. 配方调整：按照实验需求向培养基中添加适量的血清、抗生素、谷氨酸等。

4. 混合均匀：使用无菌器具将添加好成分的培养基搅拌均匀，确保各成分充分溶解。

5. 培养基保存：将制备好的培养基用无菌器具装入培养瓶中，标明日期和成分，存放于4℃的冰箱中，避免阳光直射。

以上就是医学实验中细胞培养的基本操作教程，从无菌操作、细胞传代到培养基的制备，这些基本技术对于医学实验中的细胞研究至关重要。

细胞培养实验步骤细胞培养是一种常用的实验技术，用于研究和培养人类及动物细胞以及微生物细胞，以便进行细胞生物学、免疫学、生物药剂学等领域的研究。

下面是细胞培养的一般步骤，供参考：1.预备培养物品：包括培养基、生长因子、惰性气体（例如二氧化碳、乙烷等）等。

2.消毒操作：将培养器皿、培养板、培养液等较小的物品放入70%乙醇中浸泡，或用高温高压灭菌。

3.培养基配制：根据需要的培养细胞类型选择相应的基础培养基（例如DMEM、RPMI-1640等），根据实验要求添加适当的补充物质（如胎牛血清、抗生素等），调节pH值。

4.细胞分离和传代：a）将需要培养的细胞从体内或体外取出；b）用消化酶（如胰蛋白酶）或化学脱附剂（如牛血清白蛋白）处理细胞；c）通过离心等操作，去除胶原颗粒、纤维素等杂质；d）将细胞悬浮于培养基中，数量适量；e）将细胞装入培养皿中，加入适量的培养基。

5.细胞观察：使用显微镜观察细胞的生长状态、数量、形态特征等。

6.细胞培养环境控制：a）保持恒定的温度：多数细胞培养在37℃下进行；b）提供合适的湿度：使用培养器内的水槽或加入水来增加湿度；c）提供适度的无菌环境：在洁净工作台或无菌箱内进行，注意操作无菌技术，避免细菌等污染细胞。

7.细胞培养的传代：细胞的生长速度快，细胞排列紧密，细胞密度太高会使细胞分泌代谢产物过多，阻碍细胞增殖，因此需要定期传代。

传代前要先将细胞分散（用胰蛋白酶或牛胰酶等处理），将培养皿中的细胞悬液分装到新的培养皿内。

8.细胞培养的净化：细胞培养过程中，细胞环境容易被菌落污染，因此需要进行细胞净化。

方法有：检测培养液的菌落数目，观察培养皿内是否有细菌、真菌等的生长，如发现污染现象，立即停止使用被污染的培养皿和培养液。

9.细胞培养的冻存：细胞培养过程中，保留一部分细胞进行冻存，以备后续的实验使用。

常用方法是将细胞悬液和DMSO混合后，存放在液氮中保存。

以上是细胞培养的一般步骤。

但不同类型的细胞具有不同的培养要求，实验者还需根据实际情况进行具体调整和处理。

细胞一细胞培养（一）原代培养○1胰蛋白酶消化法1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块用细胞筛过滤，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养○2组织块法1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（二）传代培养○1贴壁细胞1.先将含10%血清和1%双抗的培养基、0.25%EDTA-胰蛋白酶在37℃水浴锅中预热20min2.观察细胞融合率是否达到80%-90%3.将所需用品放入紫外照射30min的超净工作台中，物品放入前需用75%酒精擦拭或放入后立即用酒精擦拭4.吸去培养基，加入PBS冲洗两遍，洗去残留培养基，加入胰蛋白酶至刚好覆盖培养皿底 （6㎝培养皿约1ml），放入培养箱中消化0.5-2分钟5.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，轻轻吹打混匀，吸入离心管中，1000r/min离心5min6.离心后，小心吸去上清夜，加入5ml培养基轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml7.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养○2悬浮细胞1.将培养皿中的培养基吸至离心管中，1000r/min离心5分钟2.离心后吸去上清液，加入5ml培养基，轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml3.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（三）细胞冻存○1贴壁细胞冻存1.配置细胞冻存液2.吸去培养基，加入0.25%EDTA-胰蛋白酶刚好覆盖培养皿底，放入培养箱中消化0.5-2min3.消化后的细胞，转移至离心管中，1000r/min离心5min4．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml5.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中○2悬浮细胞冻存1.配置细胞冻存液2.将细胞转移至离心管中，1000r/min离心5min3．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml4.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中仪器：15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、倒置显微镜、程序性降温盒、液氮罐试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM（高糖）培养基、胎牛血清、二甲基亚砜（四）细胞复苏1.将冻存的细胞从液氮中小心取出，快速在37℃水浴锅中摇晃解冻，一般在1min内完成，若离水浴锅较远可将细胞放置在干冰上2.将冻存管内液体转移至离心管中，1000r/min离心5min3.去除上清液，加入培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至5×105个/ml4.每个6㎝培养皿加入5ml复苏后的细胞，放入37℃，5%CO2培养箱中培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）。

36细胞培养旳过程及注意事项细胞旳培养过程及注意事项；根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种；1.组织块培养法；(1)基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪；2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞旳培养过程及注意事项根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。

一、原代培养（一）过程原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种及培养等环节。

原代培养旳措施诸多, 基本和最常用旳是组织块培养法和分离细胞法。

1.组织块培养法(1)基本操作过程1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪将附在其上旳脂肪和结缔组织清除洁净。

再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利旳眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks液漂洗多次, 直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。

2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养瓶皿中, 并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上, 量不要过多, 要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一侧旳对侧面加足培养液, 勿使组织块与培养液接触, 塞紧瓶塞；4）、将种植了组织块旳一侧朝上, 静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1 h到3h后翻瓶, 使贴壁旳组织块浸没与培养液中, 静置；5）、每隔2到3天更换一次培养液, 或者根据培养瓶种颜色旳变化确定换液时间。

2.注意事项1）、组织块接种后旳前3天, 从组织块向外迁徙旳细胞数很少, 组织块旳黏附不牢固, 在观测和移动旳过程中, 注意不要引起液体旳振荡。

要防止常常翻动和振动, 否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。

2）、加入旳培养液不适宜过多, 防止浸泡旳组织块受轻微旳波动而脱落下来。