腺苷脱氨酶参考系统的建立及临床应用

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血清腺苷脱氨酶

一、血清腺苷脱氨酶（ADA）临床意义：血清ADA活性增高见于：①肝脏疾病：急性黄疸性肝炎，肝细胞出现损伤，在黄疸尚未出现前，可见增高，因ADA分子量较ALT小，当肝细胞轻度受损时ADA比ALT先释入血内，慢性肝炎活动期，慢性迁延性肝炎升高明显；肝硬化，原发性肝癌时，ADA活性也升高。

②肿瘤引起的阻塞性黄疸，前列腺癌和膀胱癌，网状细胞瘤，淋巴瘤，溶血性贫血，风湿热，伤寒，痛风，重症地中海贫血，骨髓性白血病，结核，自身免疫性疾病，传染性单核细胞增多症和心力衰竭等均可引起此酶升高。

③结核性胸腹水ADA活性显著增高，癌性胸腹水不增高，而血清中ADA活性二者无明显差别，故测定胸腹水中ADA活性有助于将两者鉴别。

④结核性脑膜炎ADA显著增高，而病毒性脑膜炎则不增高，颅内肿瘤及中枢神经系统白血病稍增高，所以脑脊液ADA检测可以作为中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断的重要指标。

血清ADA活性降低见于：见于重度免疫缺陷症状。

二、血清单胺氧化酶（MAO）临床意义血清中MAO和结缔组织中的MAO性质相似，能促进结缔组织的成熟，在胶原形成过程中，参与胶原成熟的最后阶段架桥形成，使胶原和弹性硬蛋白结合。

临床上测定血清MAO主要用于诊断肝硬变。

肝硬变时，血清MAO活性常明显增高，阳性率可高达80%以上。

三、前白蛋白(PA) 临床意义PA 降低：1.诊断和监测营养不良：血清PA在无感染情况下，是儿童营养不良的灵敏指标，在蛋白质-热卡不足型营养不良（PCM）中随着营养状况的改善，多数病人血清PA水平显著升高而血清TP、Alb未见明显升高。

2.诊断肝病：肝脏疾病时血清PA变化较Alb早，有30％肝病患者血清Alb正常而PA降低。

各型肝炎患者（病毒性肝炎、乙醇性肝炎和药物性肝炎）血清PA水平均有不同程度降低，以肝硬化和重症肝炎降低最著。

对重型肝炎预后有较大的参考价值，PA 明显上升，预后良好，ＰＡ持久降低者，预后险恶。

3.诊断急性时相反应，PA可作为癌症的筛选指标。

腺苷脱氨酶检测及对相关性疾病的临床意义

腺苷脱氨酶检测及对相关性疾病的临床意义摘要】目的通过阐述腺苷脱氨酶（ADA）检测的方法以及在临床上的实际应用，分析ADA检测在诊断和辅助诊断疾病中所发挥的作用，从而了解ADA活性的高低在肝脏疾病、免疫疾病、血液疾病、肿瘤、神经系统疾病以及浆膜腔积液的鉴别等诊断，为鉴别诊断提供了有用的信息和实验室诊断指标。

【关键词】腺苷脱氨酶检测意义1 ADA生物特性ADA广泛分布于人体各组织中，以胸腺、脾和其他淋巴组织中含量最高，肝、肺、肾和骨胳肌等处含量较低。

血液中ADA主要存在于红细胞、粒细胞和淋巴细胞，其活性约为血清的40～70倍，T淋巴细胞比B淋巴细胞该酶活性更高。

人ADA基因位于第20对染色体上，并呈现出遗传多态性现象，其同工酶有3种，分别为ADA1，ADA1＋CP和ADA2。

ADA1分子量为35kD，为一种单链蛋白质；ADA1＋CP分子量为280kD，实际上是由2条单键的ADA1分子和1个不具酶活力的200kD结合蛋白结合而成；ADA2分子量为100kD。

3种同工酶具有不同的动力学性质。

ADA同工酶在各类组织和细胞中的分布不同，ADA1在脾脏、红细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞中占优势，ADA1+CP在肝脏、肺、胰、肾组织和骨骼中占优势，ADA2只存在于单核细胞，目前在其他组织细胞中尚未检出。

是嘌呤核苷代谢中重要的酶类，能催化腺嘌呤核苷转变为次黄嘌呤核苷，再经核苷磷酸化酶作用生成次黄嘌呤，其代谢缓和终产物为尿酸。

ADA是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶，测定血液、体液中的ADA及其同工酶水平对某些疾病的诊断、鉴别诊断治疗及免疫功能的研究日趋受到临床重视。

2 ADA测定在临床上的应用2.1肝病：ADA是反映肝损伤敏感指标，可作为肝功能常规项目之一，与AIT或GGT等组成肝酶谱。

2.1.1用于判断急性肝损伤及残留病变。

2.1.2协助诊断慢性肝病。

2.1.3有助于肝纤维的诊断。

2.1.4有助于黄疸的鉴别。

腺苷脱氨酶的临床意义

结核性胸腹水与肿瘤性胸腹水的鉴识诊疗惯例方法之外观、凝结性、李凡他试验、蛋白定量及细胞计数并分类等方法进行鉴识，特异性和敏感性低，鉴识较为困难，抗酸染色查抗酸杆菌阳性率不高，结核分支杆菌的培育需时长，均影响临床诊疗和治疗。

所以本文将ADA 、LDH 和 CRP 应用于惯例胸腹水检测来鉴识结核性胸腹水和肿瘤性胸腹水拥有较高的特异性和敏感性。

ADA 是人体嘌呤核苷分解代谢过程中起重点作用的水解酶，它能催化腺嘌呤核苷降解为次黄嘌呤核苷，后经核苷磷酸化酶催化成次黄嘌呤，最后氧化成代谢终产物尿酸。

并且ADA 宽泛存在于人体各组织中，以胸腺、脾和淋巴组织中活性最高，它与T 淋巴细胞的分化和增殖亲密有关。

本文检测结果表示：结核性胸腹水中的ADA 活性明显增高，可能是结核性胸腹水中T 淋巴细胞和单核 -巨噬细胞被分支杆菌激活，进而惹起ADA 活性高升。

此外间皮细胞可主动吞噬分支杆菌，产生多种特异性细胞因子，进而可引诱产生ADA 活性高升 [1] 。

文件报导腹水 ADA>30u/L ，诊疗 TBP 的敏感性和特异性均超出90%，临床荟萃剖析显示，将ADA 值定为 36-40u/L 诊疗 TBP 的敏感性为100%，特异性为 97%[2] 。

但肿瘤性胸腹水组ADA 活性不高，可能是肿瘤性胸腹水中的T 淋巴细胞增殖受克制致使的。

LDH 是一种 H+ 传达氧化复原酶，宽泛散布于组织器官，组织中含量显然高于血清[3] 。

本文检测结果表示，肿瘤性胸腹水组LDH 活性明显高于结核性胸腹水组，两组比较有显著性差异 (P<0.01) 。

肿瘤性胸腹水中 LDH 增高，可能是因为组织损坏零落伤害和肿瘤组织中酶的无氧酵解上涨促进糖酵解重点酶使LDH 高升。

用胸腹水确诊肿瘤患者的重要依照是从胸腹中查出肿瘤细胞，但因为阳性率较低，给临床诊疗带来了必定的困难。

所以，胸腹水 LDH 活性高低能够作为肿瘤性胸腹水和结核性胸腹水鉴识诊疗的一个依照。

腺苷脱氨酶和癌胚抗原检测的临床应用价值

２患者胸腔积液与血清中ＡＡＣＡ比值的测定ＡＡ．２ＤＥＤ和ＣＡ在胸腔积液和血清中含量比值的计算结果显示，Ｅ在结核性胸腔积液组，ＤＡＡ结果高于恶性胸腔积液组，有统计学意义（＜．１：恶性胸腔积液组，表２Ｐ０（）在）见。表２患者胸腔积液与血清中ＡＡ和ＣＡ比值的测定．ＤＥ
Ｃｅｔ１９，０（）１８ — ４８ｈｓ，９３１４５：４６１８．
［】２彭娟，陈纬，吴英松，．等液相芯片技术定量检测人血清ＣＡ、Ｅ
ＡＦＰ和ＮＥＪ热带医学杂志．０７，（）１— ３Ｓ［．］２０７１：９２
［】ｒｌＺｔａＭ，ｔｎ，ｔ１Ｔｅｉｃｄｎｅｏｌｕａｅｆ— １ＭａｅＭ，ｍｓｖＳａｙＢｅ．ｈｉｅｃｆｅｒ１ｆｏｓａｎｐｕ
ｓｏｎａｗｅｌｄｅｎｄｒｇｏｅｄｅｏｏｉｔｄｎｃｎｒｌＢｈｅａｉｎｉｌ — ｆｅｅｉｎ：ｐｉｍｉｌｇｃｓｕｙｉｅｔａｏｍｉ．ｉ
２结果
２１两组胸腔积液中ＡＡ和ＣＡ含量测定结核性及恶．ＤＥ性胸水中ＡＡ和ＣＡ的测定结果显示，核性胸水中ＡＤＥ结 —
ＤＡ含量明显高于恶性胸水患者，两者相比有统计学意义（＜．１。性胸水患者胸水ＣＡ含量高于结核性胸水患Ｐ０）恶０Ｅ者，者相比有统计学意义（＜．１。见表１两Ｐ０）０表１两组胸腔积液中ＡＡ和ＣＡ含量测定．ＤＥ

结核性胸膜炎患者腺苷脱氨酶检查的临床意义

结核性胸膜炎患者腺苷脱氨酶检查的临床意义【摘要】目的探讨胸水腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)检查在结核性胸膜炎诊断中的临床意义及应用价值。

方法回顾确诊的50例结核性胸膜炎及32例恶性胸腔积液中胸水ADA的水平。

结果结核性胸膜炎的胸水ADA值平均为49.08±8.62，恶性胸腔积液的胸水ADA值平均为16.6±8.45，两者之间差异有统计学意义(P＜0.01)。

结论胸水腺苷脱氨酶对结核性胸膜炎有一定的特异性，可作为参考指标。

【关键词】腺苷脱氨酶(ADA)；结核性胸膜炎；胸腔积液胸腔积液是临床常见的征象，其原因多种多样，以结核性胸膜炎及恶性胸腔积液较为常见，但既往所应用的胸水细菌学及细胞学等常规方法阳性率低，且结果回报时间相对较长，不利于及早诊断，因此鉴别结核性和恶性胸腔积液有着重要的临床意义1］。

而胸水腺苷脱氨酶操作简便，已在临床广泛应用，本文对50例结核性胸膜炎及32例恶性胸腔积液胸水中ADA的结果进行分析，观察其在结核性胸腔积液诊断中的临床意义。

1 资料与方法1.1 对象选取2004年1月至2010年1月于我院呼吸科就诊的82例患者，其中结核性胸膜炎50例，诊断方法，有明显的发热、盗汗、咳嗽、乏力、消瘦等结核中毒症状，PPD强阳性，经抽胸水及抗结核治疗有效者，同时排除了其他可能的疾病，其中男29例，女21例，平均年龄(31.02±10.35)岁。

恶性胸腔积液32例，诊断方法:肺CT可见典型的肿瘤影像学表现，胸水找到瘤细胞。

其中男20例，女12例，平均年龄(68.09±14.37)岁。

1.2 方法胸腔B超定位后初步诊断有胸水者行胸腔穿刺抽液，胸水标本送检ADA检查，其测定方法是采用Giusti比色法，以ADA≥45 U/L为阳性界值。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.统计软件，组间比较采用t检验及χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结核性脑膜炎脑脊液腺苷脱氨酶检测的临床意义及应用分析

结核性脑膜炎脑脊液腺苷脱氨酶检测的临床意义及应用分析【摘要】目的：探讨结核性脑膜炎脑脊液腺苷脱氨酶检测的临床意义及应用分析，为早期患者治疗提供参考意见。

方法：对50例结核性脑膜炎患者采用酶显色法检测，48例化脓性脑膜炎患者以及52例病毒性脑膜炎腺苷脱氨酶水平。

结果：结核性脑膜炎组、化脓性脑膜炎组、病毒性脑膜炎腺苷脱氨酶水平分别是（16.51±6.53）、（5.62±2.57）、（3.25±1.3）u/l；结核性脑膜炎脑脊液腺苷脱氨酶水平明显低于患者入院初期的水平，差异具有统计学意义（p<0.05）；在不断的治疗过程中，腺苷脱氨酶水平也随之不断下降（p<0.05）。

结论：脑脊液中的腺苷脱氨酶检测有利于结核性脑膜炎的提早发现和鉴别诊治，进行动态监测可以对治疗的效果进行正确的评估，为临床治疗提出了指导意见。

【关键词】结核性脑膜炎；脑脊液；腺苷脱氨酶结核性脑膜炎是由结核分枝杆菌引起的中枢神经系统的炎症，在结核病中占6%，近些年的发病率和死亡率明显增加，人们将研究的重点放到了结核性脑膜炎的早期诊断、鉴别诊断以及指导临床治疗上。

腺苷脱氨酶和机体细胞的免疫功能联系密切，而结核分枝杆菌的感染会致使腺苷脱氨酶升高[1]。

本文对50例结核性脑膜炎患者、48例化脓性脑膜炎患者以及52例病毒性脑膜炎患者脑脊液中腺苷脱氨酶进行检测并分析，仔细观察治疗中的变化情况并做详细记录，现将记录情况报道如下。

1 资料与方法1.1一般资料选择50例结核性脑膜炎患者，其中男25例，女25例，年龄在24岁与68岁之间，平均年龄（46.7±12.1）岁。

脑脊液检测到结核分枝杆菌，其他的真菌、细菌、肿瘤细胞学检查的结果都为阴性。

选择48例化脓性脑膜炎患者，其中男28例，女20例，年龄在21岁与71岁之间，平均年龄（49.4±13.4）岁。

脑脊液细菌培养为阳性，涂片找到的细菌或见白细胞增多，以多形核白细胞为主，经过细胞学的检测没有发现结核分枝杆菌、肿瘤细胞以及真菌。

腺苷脱氨酶生理和临床应用

腺苷脱氨酶生理和临床应用
高旭军
【期刊名称】《中国社区医师：综合版》
【年(卷),期】2012(28)29
【摘要】腺苷脱氨酶（ADA）是嘌呤核苷代谢中重要的酶类,属于巯基酶,每分子至少含2个活性巯基。

近十几年来,随着对ADA的深入研究和临床检测方法的不断改进,为临床常规开展ADA检测及应用创造了有利条件。

【总页数】1页(P193-193)
【作者】高旭军
【作者单位】浙江金华市婺城区雅畈镇社区卫生服务中心，321051
【正文语种】中文
【中图分类】R561.3
【相关文献】
1.腺苷脱氨酶生理和临床应用 [J], 高旭军
2.结核感染 T 细胞斑点试验和腺苷脱氨酶在结核性胸膜炎诊断中的临床应用价值[J], 吴瑕;仇海兵
3.血清胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸联合测定在肝病诊断中的临床应用 [J], 张欢
4.腺苷脱氨酶在肝脏疾病中的临床应用 [J], 姜冉冉;徐杨;宁丽;郭慧
5.《现代电生理学杂志》第五届编委会及创刊20周年庆典会、《现代电生理学杂志》全国脑象图协作研究中心成立大会、《现代电生理学杂志社》全国巡回(天津站)脑象图临床应用学术研讨会暨河北省电生理学会第四届代表大会在天津召开 [J],
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腺苷脱氨酶测定的临床应用

腺苷脱氨酶测定的临床应用【摘要】腺苷脱氨酶(ADA)为一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶，其作用是催化腺嘌呤核苷转变为次黄嘌呤核苷，再经核苷磷酸化酶作用生成次黄嘌呤，其代谢缓和终产物为尿酸。

本文着重探讨了腺苷脱氨酶的临床应用。

【关键词】腺苷脱氨酶(ADA) 临床应用诊断腺苷脱氨酶(ADA)为一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶，广泛分布于人体各组织中，以胸腺、脾和其他淋巴组织中含量最高，肝、肺、肾和骨胳肌等处含量较低。

肝脏含量约为小肠的7%～10%。

肝内ADA90%存在与细胞浆水溶性部分，其余在细胞核内。

此外，血液中ADA主要存在于红细胞、粒细胞和淋巴细胞，其活性约为血清的40～70倍，T淋巴细胞比B淋巴细胞该酶活性更高。

ADA增高是T淋巴细胞对某些特殊病变局部刺激产生的一种反应，其与T 淋巴细胞增殖、分化和数量有密切关系。

因此ADA的检测在某些疾病的诊断、治疗及发病机制的研究颇受关注。

1 肝胆疾病的诊断ADA是反映肝损伤敏感指标，可作为肝功能常规项目之一，肝实质损害时，血清ADA活力升高。

血清中ADA主要来源于肝脏，因为它是肝细胞的胞浆酶，所以任何原因造成的肝细胞损伤，其肝细胞膜的通透性就会增强，致使血清中的ADA酶的活性升高，故该酶可以作为反映肝实质损伤的指标。

1.1 判断急性肝损伤及残存病变研究表明，在急性肝炎时血清ADA活性增高，其阳性率高于谷丙转氨酶(ALT)和γ-谷氨酰转肽酶(γ2GT)。

而且由于ADA恢复正常较迟，较ALT、γ2GT更能正确反映急性肝实质损害，并有助于探测急性肝炎的残存病变。

但重症肝炎发生酶胆分离时，尽管ALT不高，而ADA常明显升高。

急性肝炎后期ADA升高率高于ALT，其恢复正常时间也较后者迟，并与组织学恢复一致。

ALT 恢复正常而ADA持续升高者，常易复发或易迁延为慢性肝炎。

1.2 协助诊断慢性肝病在反映慢性肝损伤时ADA较ALT为优。

许多研究中都发现，慢性活动性肝炎(CAH)、肝硬化患者血清中ADA值显著升高，且较持久，因而可判断慢性肝病的程度。

血清腺苷脱氨酶检测及在肝病中的临床应用

学杂志 2004 ,36(7):538- 539.
[6] 建榕，朱起云，云.IgA肾病49 例临床与病理的田华黄关系 .中
肾脏病杂志， 1996, 12(2):108.
年6 月在本院住院的患者，男55 例，女25 例，年龄分布在
25- 76 岁之间，平均年龄40.2 岁;其中急性肝炎20 例，慢性肝炎15 例，肝硬化16 例，肝癌29 例，均为临床确诊病例。
化分析仪。 ADA 活性检测试剂盒由宁波美康生物有限公司提供，试剂配套定标品;ALT 活性检测试剂由日本奥林巴斯诊断产品有限公司提供。 1.3 标本采集、处理与检测取早晨空腹静脉血 1次，置于真空未抗凝生化类试管中， 1小时内分离血清，在剔除溶血、脂血、黄疽标本，严格在监控状态下进行检测，并于2 小时内
3 讨论
降快，显著异(P<0.05)，此显 D 比A T能更很有性差由示A A L
好地反映肝内病变情况。
血清中的ADA 是肝细胞的胞浆酶，任何原因的肝细胞
损伤，其肝细胞膜的通透性就会增强，血清中的ADA酶的活性升高，故该酶可以作为反映肝实质损伤的指标 1 正常人体 2 1。血清ADA活性很低，平均水平为8.48U几，生物参考区间为 (1.18- 14.98)U几。在传统的肝功能试验中，是反映肝实 ALT 质细损伤的要酶我研究过程中合检测ALT活胞主类。们在联性并与之比较，具体分析在各种肝病中的临床意义。从检测结果来看，各组肝病患者血清中ADA活性均明显高于对照组(P<0.01) ，其敏感度肝硬化>肝癌>慢性肝炎>急性肝炎。血清ADA活性升高，其敏感度不如ALT(急性肝炎时ADA是正常组的2 倍， T是正常而AL 组的89 倍但在期A 的 )。恢复 LT

胸腔积液腺苷脱氨酶(ADA)检测的临床应用

胸腔积液腺苷脱氨酶（ADA）检测的临床应用发表时间：2013-07-18T16:00:02.873Z 来源：《医药前沿》2013年第14期供稿作者：贾琳魏成翠[导读] 胸腔积液是临床常见的胸膜病变，其病因复杂，可原发于胸膜自身疾病，也可继发于肺部疾病。

贾琳魏成翠（沈阳市胸科医院辽宁沈阳 110044）【摘要】目的探讨腺苷脱氨酶（ADA）在胸腔积液鉴别诊断中的临床应用和疗效观察。

方法检测78例结核性胸膜炎及56例癌性胸膜炎患者胸腔积液中的ADA活性。

比较两组检测结果及结核性胸膜炎患者组治疗前后ADA活性变化。

结果结核性胸腔积液的ADA明显高于癌性胸腔积液。

治疗后结核性胸腔积液ADA明显下降。

结论胸腔积液ADA检测对结核性胸膜炎具有诊断价值，并可作为抗结核治疗效果的观察指标，值得临床广泛应用。

【关键词】胸腔积液 ADA 结核性胸膜炎【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）14-0213-01 Pleural effusion adenosine deaminase (ADA) detection of clinical applications jialin weichengcui Shenyang chest hospital Shenyang 110044,China 【Abstract】 Objective: To investigate the effect of ademinase(ADA) in clinical application and curative effect observation in the differential diagnosis of pleural effusion. Methods : ADA activity was detected in 78 cases of tuberculous pleurisy and 56 cases of carcinomatous pleurisy patients of pleural effusion. Changes of ADA activity were compared in the two groups before and after the test results and the patients with tuberculous pleurisy therapy . Results : the ADA of tuberculous pleural effusion was significantly higher than that in malignant pleural effusion. tuberculous pleural effusion ADA decreased significantly after treatment. Conclusions: pleural effusion ADA detection is valuable in the diagnosis of tuberculous pleurisy,observation index and can be used as anti-TB treatment effect,it is worthy of wild clinical application. 【Key words】Pleural effusion ADA Tuberculous pleurisy 胸腔积液是临床常见的胸膜病变，其病因复杂，可原发于胸膜自身疾病，也可继发于肺部疾病，其中以结核性和癌性最为常见。

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腺苷脱氨酶参考系统的建立及临床应用腺苷脱氨酶(Adenosine Deaminase,ADA)为机体重要的核酸分解代谢酶,其活性的检测对于结核、恶性肿瘤、中枢神经系统疾病、肝病和伤寒等的诊断与鉴别诊断具有重要意义,其总检测数在我国已开展的1000多项检验项目中排名96位。

然而,目前ADA活性的测量方法众多,即便同一种方法也存在多种试剂配方,而酶活性检测的特殊性就在于其检测结果与反应条件密切相关,因此造成同一标本在各医院检验科检测得到的ADA活性结果差别较大,而各实验室多采用同样的参考区间,这就给临床诊疗以及检验结果的互认带来了困惑和障碍。

而造成这种局面的真正原因就是缺少一个公认的,各检测方法结果能够向其溯源的方法,即ADA的参考系统。

本课题拟建立ADA活性检测的参考方法,制备ADA的参考物质,建立ADA参考区间,最终形成一套完整的参考体系,为临床ADA 检测的标准化和一致化打下基础。

第一章腺苷脱氨酶候选参考方法的研究目的:建立性能符合要求的ADA候选参考方法。

方法:1.查阅国内外相关文献,了解ADA在临床中的应用及检测方法。

2.腺苷脱氨酶优化方法的选择:首先对国内外ADA众多检测方法进行文献研究,对各方法性能进行比较分析,其次通过实验评价ADA酶偶联两步和四步法部分性能。

3.试剂的配制要求:环境要求、称量要求和实验用水要求参照参考方法的要求。

4.仪器校准:实验进行前对所用到的紫外分光光度计、稀释配液仪、pH计、电子天平、温度计、移液器、玻璃仪器等均进行常规校准,校准程序按照参考实验室标准操作规程(SOP)文件进行。

5.检测条件的探讨与优化:包括环境温湿度、检测温度、检测波长、波宽、光径、孵育时间、延迟时间、检测时间、检测点等。

6.反应体系的优化:包括反应体系pH和各反应物浓度。

先用单因素固定筛选方法确定每个影响因素的合适实验区间。

其次筛选对实验影响显著的因子,最后运用响应曲面优化方法(response-surface)将实验中的多个因素与指标的相互关系用多项式近似拟合,依此对函数的响应面进行分析,从而计算各反应因素的最优值。

7.对建立的ADA 候选参考方法的缓冲体系pH,三个工具酶检测方法等进行优化。

8.性能评价:根据CLSI系列文件EP5-A2/EP6-A/EP7-A对建立的ADA候选参考方法的性能进行评价,包括精密度、线性、正确度、抗干扰能力等。

其中在干扰实验中,评定了甘油三酯、血红蛋白、总胆红素、维生素C、治疗肝脏疾病的中药代谢单体甘草次酸、脱氧胆酸和黄芩素对方法的干扰。

9.不确定度评定:根据参考文献和相关标准,对所建立的ADA候选参考方法进行不确定度评定,包括A类和B类不确定度,A类不确定度来源于实验(重复因素),通过实验设计参数的变化梯度进行检测,从而计算该参数的灵敏系数(对不确定度的贡献系数),进行评定;B类不确定度来源于证书(校准因素),通过查阅校准证书获得,最后将实验中所有的不确定度进行合成,扩展因子K=2(取95%置信区间)。

结果:1.通过对ADA检测方法的文献研究,选取酶偶联两步法和四步法进行实验研究。

2.ADA酶偶联两步法试剂空白均值为1.4 U/L,标准差0.4 U/L;5个不同浓度的样本空白(单位:U/L)分别为:7.8,9.0,11.5,9.3,10.2;精密度:2水平样本每天检测3次连续检测5天的均值为20.1 U/L和35.6 U/L,标准差为1.2 U/L和0.8 U/L,变异系数为6.0%和2.3%;线性范围方程为Y=32.615X-19.2214((R2=0.9973),高限为207.7 U/L。

四步法试剂空白均值为0.6U/L;标准差:0.6 U/L;5个不同浓度的样本空白(单位:U/L)分别为:0.1,-0.3,0.5,0.9,-0.4;精密度:2水平样本每天检测3次连续检测5天的均值为31.1 U/L和49.2 U/L,标准差均为0.4 U/L;变异系数:1.1%和0.8%;线性范围方程为Y=38.8179X-30.9571(R2=0.9993),检测高限为240.2 U/L。

3.腺苷脱氨酶(ADA)的候选参考方法检测条件为:检测温度为37 ℃±0.1 ℃;检测波长:550 ± 1nm;波宽为10 mm ± 0.01 mm,光径≤ 2 nm,检测点≥6;孵育时间5min,延迟时间120s,监测时间180s。

4.腺苷脱氨酶(ADA)的候选参考方法的显著影响因子为:底物腺苷(Adenosine),工具酶黄嘌呤氧化酶(XOD),4-氨基安替吡啉(4-AA),磷酸氢二钠(Na2HPO4)四个因子。

5.试剂(终)浓度(四个显著因子):腺苷 4.0mmol/L;XOD 3224.2U/L;Na2HPO4 0.96 g/L;4-AA 1.2 mmol/L。

6.方法性能:批内精密度:两样本(检测均值分别为:31.2 U/L和80.9 U/L)变异系数均为0.4%;期间精密度:样本1变异系数为1.8%,样本2为0.8%。

线性范围:0.3-286.5 U/L。

正确度:ADA候选参考方法检测标准物质BCR-647(IRMM)均值:194.1 U/L,标准差:0.5U/L,变异系数为0.2%,超出给定靶值(153.0±5.4U/L)约40个单位。

抗干扰能力:甘油三酯≤ 3.39 mmol/L,血红蛋白≤3.75 g/L,总胆红素≤85.5 umol/L,维生素C≤40mg/L,甘草次酸和脱氧胆酸≤20mg/L,黄芩素≤37.5mg/L时对方法无干扰。

7.ADA候选参考方法的不确定度评定结果:A类不确定度评定参数包括检测温度,检测波长,反应体系pH,反应液总体积,样本体积,样本测量等,灵敏系数分别为4.4%,0.5%,1.04%,1.0,1.0,1.0;B类包括复溶(天平称量),比色杯,吸光度等,灵敏系数均为1.0。

最后合成的扩展不确定度在31 U/L水平为0.59 U/L。

结论:1.酶偶联两步法和四步法各有优劣,但两步法致命的缺点是内外源氨污染无法消除,相较四步法没有其反应稳定,所以选取酶偶联四步法作为ADA候选参考方法优化建立的基础。

2.所建立的ADA候选参考方法精密度较好,线性范围满足临床需要,与其他方法相比检测灵敏度提高,抗干扰能力较强,具有较小的不确定度,性能符合要求。

ADA候选参考方法已建立完成,可为临床其他参考方法的建立提供参考。

3.响应曲面方法在ADA候选参考方法建立优化实验中发挥很大作用,是一种很好的优化方法,可应用于临床检验其他方法的优化研究。

第二章腺苷脱氨酶参考物质的研究目的:制备互通性较好的血清基质的腺苷脱氨酶参考物质。

方法:1.自Pubmed基因库里查阅获得人ADA基因序列。

2.构建 3 种原核克隆载体(BL21+pET-28b+ADA,BL21+pET-32a+ADA,BL21+pHSIE+ADA)和1种真核克隆载体(GS115+pPICZαA+ADA)诱导表达目的蛋白。

3.ADA蛋白诱导表达后经Western-blot技术定性,半定量,比较各载体蛋白表达量及酶可溶性,并进行酶活性分析。

选择最优表达系统大量表达目的蛋白,经纯化后,分析其纯度,酶活性和蛋白定量。

4.收集本院体检者,体检结果正常的新鲜血清,作为参考物质的基质。

将纯化好的ADA蛋白添加到收集的血清基质中,制备两水平参考物质,充分混匀后分装于冻存管中,密封冻存于-80℃。

5.对所制备的ADA两水平参考物质根据CNAS-GL03文件对其均匀性(方差分析)和稳定性[t-检验和临床意义(均匀性均值±2.5%范围)]进行评定。

6.用建立的候选参考方法为所制备的ADA两水平参考物质定值,定值结果用“靶值±不确定度”表示。

结果:1.构建的腺苷脱氨酶的三个原核表达载体表达蛋白活性(纯化后)最高为89 U/L,一个真核表达载体表达蛋白活性(纯化后)最高为4200 U/L。

2.制备的ADA两水平参考物质性能评价结果:均匀性:水平1检测均值为26.3 U/L,方差分析P=0.231(>0.05),水平2检测均值为225.7 U/L,方差分析P=0.313(>0.05);稳定性:室温放置稳定5h;4-8℃放置稳定12h;-20℃放置稳定15天;目前-80℃样本放置时间为3个月,检测结果稳定。

3.制备的ADA两水平参考物质由候选参考方法赋值结果(均值±不确定度)为:水平1:26.0±0.9U/L;水平2:219.1±3.4U/L。

结论:制备的腺苷脱氨酶两水平参考物质由候选参考方法赋值,均匀性符合要求,稳定性好。

本实验成功研制了ADA参考物质,同时可为其他参考物质的研究提供参考。

第三章腺苷脱氨酶参考区间的建立目的:基于建立的ADA候选参考方法,建立广东地区健康成年人ADA参考区间。

方法:1.参考CLSI CA28-A3《临床实验室如何定义、建立和确定生物参考区间(核准指南-第三版)》文件和相关文献以及ADA的临床意义制定相应的纳入标准和排除标准。

2.筛选符合ADA参考区间纳入标准的个体通过知情同意后,于早7:00-10:00之间空腹采集静脉血2ml于分离胶管分离血清备用。

3.实验室检测:ADA检测使用迈瑞生化分析仪和参考方法的试剂在质控在控等条件下检测;其他排除标准的检测项目使用本院检验科临床检测系统Roche Modular PPI,按照日常工作规范进行检测,继而按照排除标准排除实验室检测结果不在参考区间内的个体。

4.统计分析:根据D/R(1/3)规则和/或Q1,Q3规则去除离群值;运用Z检验方法分析是否根据性别,年龄等因素进行分组;最后建立α=0.05水平的参考区间以及计算参考限的90%置信区间。

结果:1.入选个体:从广东地区1662名志愿个体中,最终筛选出650例个体(男296例,女354例)的检测结果进行统计分析。

2.离群值:去除1例。

3.分组结果:性别分组Z值为3.0,Z*为4.9,Z小于Z*,不分组;年龄段分组,Z 值为7.8,Z*为4.9,Z大于Z*,分组有统计学意义,但无临床意义,综合考虑不分组。

4.广东地区健康成年人(18-79周岁)腺苷脱氨酶候选参考方法参考区间:0-31U/L,高限的90%置信区间为:30.5-31.1 U/L。

结论:基于ADA候选参考方法的基础上,建立了广东地区健康成年人ADA的参考区间,为临床实验室ADA检测标准化和一致化提供基础。

第四章ADA候选参考方法的临床应用目的:用建立的ADA候选参考方法评价常规方法的准确性。

方法:临床常规检测系统Y1(Roche Modular PPI检测系统+迈克ADA检测试剂盒)和基于参考方法的自建临床常规检测系统Y2(迈瑞分析仪+自配试剂),按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)EP9-A2文件和建立的参考区间范围收集样本,与参考方法(X)进行比对试验研究。