DNA重组技术

第五章DNA重组技术DNA重组技术是指在体外将目的DNA片段与质粒（plasmid）等能够自主复制的载体（vector）连接形成重组DNA分子，再导入合适的受体细胞。

由于重组DNA可以在受体细胞中复制，目的DNA片段同时也可以扩增获得大量拷贝，因此这项技术也被称为分子克隆（molecluar cloning）。

与PCR技术相比，通过分子克隆得到的拷贝错误率更低，并且获得重组DNA的受体细胞可以无限传代，目的片段可以更长久的保存，并能进行筛选、突变、融合、序列分析等一系列基因操作。

此外，如果载体在插入目的基因的区域具有合适的启动子、核糖体结合位点、转录终止子等序列，目的DNA片段所含基因还有可能能在受体细胞中大量表达，获得目的蛋白或其它表达产物。

通过DNA重组技术表达的蛋白又称为重组蛋白。

目前，DNA重组技术在基础研究、基因诊断、生物制药、基因治疗等方面都得到广泛的应用。

第一节DNA重组技术的常用工具酶在DNA重组技术中，需要利用一些酶来对基因进行操作，我们可以把这些酶称为工具酶。

工具酶的用途涵盖DNA重组技术的各个方面，包括目的DNA的获得、DNA的切割、片段的连接等。

一、目的DNA获得相关工具酶在DNA重组技术中，目的DNA的获得有多种方法。

其中通过酶扩增来获得是重要的一类方法，其中需要多种工具酶。

（一）Klenow片段Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，是DNA聚合酶I通过木瓜蛋白酶部分水解得到的大片段，保留了DNA聚合酶I的5’-3’的聚合和3’-5’的核酸外切酶的活性，去除了5’-3’的核酸外切酶活性。

Klenow片段可用于在体外扩增DNA片段。

由于其具有3’-5’的核酸外切酶活性，因此可以校正聚合中可能出现的错误，具有一定的保真性。

但由于其不耐热，聚合活性弱，在体外合成DNA的效率较低，随着PCR技术的发展，Klenow片段的应用已日趋减少。

现主要用于DNA双链末端的补齐和标记操作。

DNA重组技术概述DNA重组技术（DNA recombinant technology）是利用DNA序列的组合、修饰和重排等方法来获得特定目的的DNA分子的一种技术。

该技术被广泛应用于基因工程、生物医药、农业、食品工业等领域，并在科研、生产和临床医学中产生了重要的影响。

DNA重组技术的主要原理是通过DNA分子的切割、粘接、合成等操作，改变DNA序列的结构和组合关系。

这样一来，就可以将不同来源的DNA片段进行组合，重组为新的DNA分子，从而实现对DNA序列的改变和修饰。

DNA重组技术的核心技术包括PCR扩增、限制酶切割、DNA连接、酶体定向克隆、DNA测序等。

PCR扩增是一种常用的DNA重组技术，它可以在短时间内扩增出目标DNA片段。

PCR的原理是通过DNA聚合酶酶作用下的连续循环体系，将目标DNA片段从少量模板DNA中扩增出来。

这种方法简单、高效，广泛应用于分子生物学研究、基因克隆、医学诊断等领域。

限制酶切割是DNA重组技术中常用的一种手段。

限制酶能识别并切割DNA特定的序列，从而产生特定的DNA片段。

通过选择不同的限制酶，可以将DNA分子切割为具有不同片段和末端特性的DNA片段，从而实现希望的DNA重组效果。

限制酶的切割操作常用于基因克隆、DNA分析和重组等实验中。

DNA连接是DNA重组技术的另一个核心环节。

DNA连接是将两条DNA片段的末端通过DNA连接酶的作用连接在一起，形成一个新的DNA分子。

DNA连接的方法有多种，如末端连接、中间连接等。

不同的连接方式和连接酶的选择，可以实现不同的DNA重组目的。

通过DNA连接技术，可以将来自不同源的DNA片段进行连接，从而构建出具有特定功能的DNA分子。

酶体定向克隆是DNA重组技术中的一种重要方法。

它通过酶体（vector）的选择和DNA片段的连接来实现目标DNA片段的克隆和表达。

常用的酶体有质粒、噬菌体和人工染色体等。

酶体定向克隆技术常用于基因工程研究，用于将外源基因导入到宿主细胞中，并在宿主细胞中表达和复制。

重组DNA技术指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。

供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。

基因工程指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。

上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

基因工程的两个基本特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。

基因工程的意义：⑴大规模生产生物活性物质⑵设计、构建生物的新性状甚至新物种⑶分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源。

基因工程的基本条件：A核酸操作的工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、核酸酶、核酸修饰酶。

B用于基因克隆的载体：载体的功能及特征、质粒、噬菌体或病毒DNA、考斯质粒与噬菌粒、人造染色体载体C用于基因转移的受体菌或细胞：受体细胞应具备的条件、各种基因工程受体的特性、实验室常用的基因工程受体限制性核酸内切酶的生物功能：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链。

主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用。

限制性核酸内切酶的类型：主要特性I 型II 型III 型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处II 型限制性核酸内切酶的基本特性：识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。

II 型限制性核酸内切酶的切割方式：平头末端5’粘性末端3’粘性末端II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：（1）使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解（2）低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切（3）一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切影响限制性核酸内切酶活性的因素：DNA样品的纯度（B）DNA样品甲基化程度（C)限制性核算内切酶缓冲液性质（D)酶的纯度（E)DNA分子的构型（F)酶的反应温度和时间载体：基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，本质是DNA复制子。

DNA重组技术不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程，称为DNA重组（DNA recombination）。

重组DNA技术（recombinant DNA technology）作为分子生物学的一项重要技术得到了迅速的发展。

利用重组DNA技术对DNA分子进行剪切和重新连接，构成重组DNA分子，然后把它导入宿主细胞，进而扩增相关DNA片段，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。

克隆（clone）是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。

构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系，即DNA的分子克隆（molecular cloning）过程。

因此，重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术，其具体过程大致为分、切、连、转、筛选。

即分离纯化目的质粒载体、用限制性内切酶酶切纯化的载体、酶切后的载体与靶基因片段的连接、构建质粒载体转染感受态菌、筛选阳性克隆。

载体选择载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。

常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。

目前已构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型，亦可根据其用途不同分为克隆载体和表达载体二类。

载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件：①在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力；②有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性；③分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重组操作。

④具有合适的筛选标记，以便区分阳性重组体和阴性重组体，常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等。

⑤配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等。

本试验选择高拷贝型pGEM载体系列的pGEM-3Zf(+)为基础载体，它含有Lac Z基因编码区、SP6、T7RNA聚合酶启动子和其间的多克隆区域（见图），能在离体情况下合成ssDNA或RNA由于构建DNA或RNA探针的构建。

dna同源重组技术DNA同源重组技术是一种利用DNA分子间相互配对，并通过切割、重组DNA分子的技术。

该技术已被广泛应用于基因工程、遗传学、生物医学研究以及生物农业领域。

DNA同源重组技术的原理是利用两个拥有相同或相似序列的DNA 分子，通过相互配对，然后通过DNA酶切割、连接等方法，将两个DNA分子的部分或全部序列拼接成一个新的DNA分子。

这种技术可以用于构建基因库、制备基因工程产品等。

DNA同源重组技术最早应用于细菌基因工程领域。

在这个领域，研究人员利用该技术将人类基因序列合成到细菌中，从而实现了对人类基因的研究。

此外，该技术还可以用于制备抗生素等医药产品。

DNA同源重组技术还可以用于遗传学研究。

通过将同源染色体的DNA分子进行重组，可以得到一些新的基因型，从而研究基因型和表型之间的关系。

这种方法在基因组学研究中已被广泛应用。

DNA同源重组技术还可以用于生物农业领域。

例如，该技术可以用于改良植物基因组，使其获得更好的抗病性、耐旱性和产量等性状。

此外，该技术还可以用于改造动物基因，从而生产更健康、更有营养价值的畜禽产品。

虽然DNA同源重组技术已经被广泛应用于各个领域，但该技术也存在一些风险。

例如，这种技术可能会导致基因突变或其他不良后果。

此外，人工合成基因组也可能引发生物安全问题。

因此，在使用该技术时，必须严格遵守相关的法律法规和安全规范。

综上所述，DNA同源重组技术是一种非常重要的生物技术，已经被广泛应用于基因工程、遗传学、生物医学研究以及生物农业领域。

该技术的应用为人们生活带来了很多便利，但在使用该技术时，必须注意安全问题，遵守相关法律法规和安全规范。

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第一章DNA重组技术讨论4个问题：⏹1.什么是基因工程——基因工程的概念。

⏹2.为什么能进行基因工程——基因工程的原理和技术。

（包括3大理论和3大技术准备）⏹3.怎样进行基因工程——3大步骤（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理）⏹4.基因工程的应用和前景——对于医学来说即生产基因工程产品、开展基因治疗等。

第一节概述一.现代科学技术发展的特点（一）科学技术加速发展和急剧变革1.当代科学发展成指数增长趋势，全世界发表科技论文6000－8000/天，平均1篇/10.8秒问世。

2.人类科技知识在19世纪半衰期是50年，现在是3－5年（终身教育学习）。

3.1973年，Cohen Group第一次实现了细菌遗传性状的转移ter r+ne r s r→ter r ne r，导致基因工程技术诞生，至今不到30年，人类已经拥有了克隆羊、猪等等的技术，可以复制一个生命体。

（克隆羊多利1997－2003，体细胞克隆，胚胎细胞克隆）Psclol tet r Rb-3ne rs rtet rne r tet r ne r O tet r ne rCohen Group 第一次实现了细菌遗传性状转移示意图一.现代科学技术发展的特点(二)科学技术发展的综合化1.19世纪中叶，科学和技术是二者分离的，它们各有独自文化传统，它们的发展往往是脱节的。

2.科学回答“是什么”“为什么”，技术回答“做什么”“怎么做”。

当今科技发展已经密不可分，科学里包含技术，技术里体现科学。

3.当代科技发展有两种形式：一是突破，二是融合。

突破是线性的，即从研究开发新一代的科技成果取代原有一代科技成果。

融合是非线性的，即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品，造成革命性市场，它们是互补和合作的结果。

二．基因工程的概念（一）基因（gene）：从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），可以由于突变生成等位基因变异体（体细胞父源和母源；正常和突变基因）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。

DNA重组技术(DNA Recombination)一、DNA 的酶切与连接（1）酶切反应：同质粒DNA 的鉴定，只不过是质粒DNA 换为载体DNA 。

若大量酶切，则成比例增加。

（2）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。

（3）15000rpm离心15min，弃上清。

（4）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。

（5）加入适量1×TE溶解。

如此可得线性化载体DNA 。

（6）测定DNA 的含量。

（7）加入线性载体DNA 和含量3～4倍于载体的待插入DNA 片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。

（8）连接反应液可置-20℃保存，供转化用。

（9）关于待插入DNA 片段的获得参见附注。

二、大肠杆菌感受态的制备及重组DNA 的转化1、感受态的制备（1）接种单菌落于2ml LB培养液中，37℃过夜。

（2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。

（3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。

（4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。

（5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。

2、重组DNA 的转化（1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：转化项目受体菌DNA 总体积DNA 对照组0 10μl200μl受体菌对照组200μl0 200μl转化组190μl10μl200μl（2）冰浴30min至1h。

中间摇动3次，以防受体菌沉底。

（3）42℃90s。

（4）37℃水浴5min。

（5）加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。