重组DNA技术
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DNA重组技术
MCS——多克隆位点（multiple cloining site， MCS） （1）MCS 是多个限制酶识别的一段DNA顺序， 以便克隆/插入外源基因/DNA片段，与之相关概 念有： （2）多聚接头（polyliker） 有些质粒载体单一 切点少，不能普遍使用。为了扩大使用范围，可 以加一段有许多限制酶识别的单一切点的多聚接 头。 （3）人工接头（linker） 是用若干个bp组成的 dsDNA片段，一般有一个或以上限制酶识别与切 割的顺序。
4、限制性内切酶的类型 限制性内切酶可分为三大类型： • 类型I和类型III ：由于识别位 点并非严格专一，很少被应用。 • 类型II ： 是DNA重组技术最为 常用的工具酶。
类型II 限制性内切酶的特点: • 识别位点严格专一 • 识别序列的碱基数一般为4、6、 8个bp • 识别位点经常是一种回文序列 的DNA
II、沸水浴法 a、菌体浮在含有EDTA的缓冲液中 b、加溶菌酶破细胞壁 c、放入沸水浴中煮40秒 d、离心，用无菌牙签挑去沉淀物 e、乙醇异丙醇沉淀
2、噬菌体载体 • 噬菌体的繁殖方式有两种： ①溶菌性方式（lytic ）： λ DNA先经多次复制合成 许多子代λ DNA，再装配成 许多子代的λ 噬菌体，最 后裂菌，释放出许多新的 λ 噬菌体。
• 稳定性：质粒在宿主细胞 中保持着一定的考贝数 • 寄生性：质粒只能在宿主 的细胞内复制 • 表现型：不同的质粒有不 同的表型，如对抗生素的 抗性等。
复制类型 • 严紧型质粒的复制受到宿主 细胞蛋白质合成的严格控制。
• 松弛型质粒的复制不受宿主 细胞蛋白质合成的严格控制。
（2）质粒DNA的构型 • SC构型:两条核苷酸链均保持着完 整的环形结构，DNA呈现超螺旋。 • oc构型:两条链中只有一条保持着 完整的环形结构，另一条链出现 缺口，称之为开环DNA。 • L构型:DNA的双链均发生断裂而形 成线性分子。
重组DNA技术基础
二、DNA的变性(denaturation) 定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、 酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。 变性后其它理化性质变化： OD260增高 粘度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变生物活性丧失
两条DNA单链分子反向平行环绕，右手螺旋走向，表面大沟与小沟相间。 螺旋直径为2nm， 主链：戊糖－ 磷酸骨架位于外侧 侧链：碱基对位于内侧 碱基平面垂直于螺旋轴 碱基距：0.34nm； 螺距： 3.4nm； 周长：1 0对碱基。
碱基形成氢键配对，配对形式为：A=T; GC） 。
05
核苷酸(ribonucleotide)
06
核苷（脱氧核苷）——磷酸
07
磷酸酯键
体内重要的游离核苷酸及其衍生物
cAMP
AMP
５. 核苷酸的连接
３，－５，磷酸二酯键
二、核酸的一级结构
定义： 核酸中核苷酸的排列顺序（碱基序列）。
书写方法
A
G
P
5 P
T
P
G
P
C
P
第二章 重组ＤＮＡ技术基础
目录
（一）核酸的分类
90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。
分布于胞核、胞液。
(deoxyribonucleic acid, DNA)
(ribonucleic acid, RNA)
脱氧核糖核酸
核糖核酸
携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。
核 酸 的 理 化 性 质 The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid
两条DNA单链分子反向平行环绕，右手螺旋走向，表面大沟与小沟相间。 螺旋直径为2nm， 主链：戊糖－ 磷酸骨架位于外侧 侧链：碱基对位于内侧 碱基平面垂直于螺旋轴 碱基距：0.34nm； 螺距： 3.4nm； 周长：1 0对碱基。
碱基形成氢键配对，配对形式为：A=T; GC） 。
05
核苷酸(ribonucleotide)
06
核苷（脱氧核苷）——磷酸
07
磷酸酯键
体内重要的游离核苷酸及其衍生物
cAMP
AMP
５. 核苷酸的连接
３，－５，磷酸二酯键
二、核酸的一级结构
定义： 核酸中核苷酸的排列顺序（碱基序列）。
书写方法
A
G
P
5 P
T
P
G
P
C
P
第二章 重组ＤＮＡ技术基础
目录
（一）核酸的分类
90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。
分布于胞核、胞液。
(deoxyribonucleic acid, DNA)
(ribonucleic acid, RNA)
脱氧核糖核酸
核糖核酸
携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。
核 酸 的 理 化 性 质 The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid
DNA重组技术
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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。
重组DNA技术
一、定义
是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。
克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外源DNA片段。
表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因表达产物。
二、特点
1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位
• 4.诊断疾病 基因诊断是一种使用DNA分析技术来检测和鉴定出疾病的方法。利用重组DNA技术，可以制造出一 些特定的探针或引物，用于检测和分析DNA序列的异常和变异。例如，肿瘤细胞或乳腺癌细胞中常常伴随着某些基 因的改变，可以利用重组DNA技术制备出一些与变异基因相对应的探针或引物，用于检测和诊断疾病。
ACG-OH TACTTAA-P
P-AATTCGT OH-GCA
-ACGAATTCGT-TGCTTAAGCA
3、DNA聚合酶
具有5`→3`聚合活性、5`→3`外切酶活性、3`→5`外切酶活性。 可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序列分析等。
4、碱性磷酸酶
去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5ˊ端的磷酸根。 （1）5’端标记 （2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身 连接， 提高重组效率。
2.来源：原核生物
3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。 Ⅰ型酶、Ⅲ型酶：具有限制切割与甲基化修饰活性，都没有多大的实用价值。 Ⅱ型酶：应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点 的序列可知、固定。
通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型酶。
2、DNA连接酶
催化DNA中相邻的5ˊ端磷酸基和3ˊ-OH末端之间形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键。 大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
重组DNA-分子克隆技术
202X
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
单击此处添加正文具体内容
主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
dna重组技术名词解释
dna重组技术名词解释
DNA重组技术是指通过将不同来源的DNA分子进行拼接、融合或交换,创造出新的基因或基因组的过程。
以下是与该标题相关的一些名词解释:
1. 重组DNA:指从不同来源的DNA分子中获取的DNA片段,这些DNA片段可以来自于同一物种的不同细胞、不同组织或不同来源。
2. 基因重组:指在基因组中发生的基因组合或序列替换,导致新的基因产生或改变生物的性状。
3. 基因编辑:指使用CRISPR等技术手段,对基因进行精确地剪切、删除、替换等操作,以调节或改变生物的性状。
4. 基因组重组:指不同物种之间的基因组重组,可能导致新物种的产生。
5. 非同源重组:指重组DNA中不同的DNA片段之间的非同源性结合,这种结合可能会导致新的基因产生或改变生物的性状。
6. 同源重组:指两个DNA分子中的相同序列之间的结合,这种结合通常不会导致新的基因产生或改变生物的性状。
7. 基因表达:指DNA信息被转化为蛋白质信息的过程,是生物学中非常重要的一个过程。
8. 基因敲除:指通过基因工程技术,去除目标基因的表达,以达到特定目的的过程。
9. 基因修饰:指对目标基因进行修饰,以改变其表达水平、稳定性或活性等特性。
10. 基因转移:指将从父或母物种中获得的DNA片段转移至另一个物种中的过程,通常用于改良植物、动物或微生物的遗传特性。
DNA重组技术在生物学、医学、工程学等领域都有广泛的应用,例如基因编辑、基因敲除、基因修饰、基因转移等。
这些技术的应用可以帮助人们更好地理解生命的基本原理,探究生命的奥秘,推动人类健康和社会进步。
基因工程1.0-DNA重组技术
理想克隆载体的特性
分子量小、多拷贝、松驰控制型 具有多种常用的限制性内切酶的单切点 能插入较大的外源DNA片段 具有容易操作的检测表型。 常用质粒载体大小在1kb至10kb之间，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。
4362 bp
pBR322 old-style general purpose plasmid
DNA重组技术示意图
One basic cloning technique begins with the insertion of a foreign gene into a bacterial plasmid.
Fig. 20.1
DNA重组技术
质粒、DNA或RNA提取(Extraction) 酶切（Enzyme digest) 连接（ligation) 转化（transformation) 筛选（selection) 蛋白表达（Protein expression)
5000g离心15分钟。 取上清,加入RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分钟。 加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀, 12000g离心10分钟。 取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀, 12000g离心10分钟。 取上层水相, 用70%冷乙醇洗涤，12000g离心5分钟。 倒置离心管，风干沉淀，溶于500ml TE或水中。
CTAB法的优缺点
优点：避免使用氯仿等腐蚀性试剂 缺点：得率较低
3、质粒DNA的大量提取
（A）碱法
取对数生长后期菌液250ml，5000g离心10分钟,弃上清, 离心管倒置使上清流尽。 细菌沉淀重悬浮于5ml溶液I中。 加入10ml新配制的溶液II, 缓缓地颠倒离心管数次,以混匀内容物,冰浴10分钟。 加10ml用冰预冷的溶液III, 摇匀离心管,冰置15分钟,此时形成白色絮状沉淀。
重组DNA技术
重组DNA技术
重组DNA技术
1 重组DNA技术的基本概念 2 重组DNA技术的基本原理 3 重组DNA技术所需的基本条件
1 重组DNA技术与基因工程的基本概念
A 重组DNA技术的基本定义
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与
载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受
体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 nick
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … P OH nick 5’
DNA连接酶
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：
BamHI SmaI
5‘ 3‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ CGATGTACCTAGGGCCC AAGCGTA…5’ 5‘… … GCTACATG GATCCCGGG TTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATGGATCCC 3‘ …CGATGTACCTAGGG GGGTTCGCAT…3’ CCCAAGCGTA…5’
MgCl2
NaCl DTT Volume TT
10 mM
0 - 150 mM 1 mM 20 - 100 ml 37 ℃ 1 - 1.5 hr
0 - 50 mM 低盐酶
100 mM 中盐酶
重组DNA技术
1 重组DNA技术的基本概念 2 重组DNA技术的基本原理 3 重组DNA技术所需的基本条件
1 重组DNA技术与基因工程的基本概念
A 重组DNA技术的基本定义
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与
载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受
体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 nick
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … P OH nick 5’
DNA连接酶
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G …
限制性核酸内切酶
II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：
BamHI SmaI
5‘ 3‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ CGATGTACCTAGGGCCC AAGCGTA…5’ 5‘… … GCTACATG GATCCCGGG TTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATGGATCCC 3‘ …CGATGTACCTAGGG GGGTTCGCAT…3’ CCCAAGCGTA…5’
MgCl2
NaCl DTT Volume TT
10 mM
0 - 150 mM 1 mM 20 - 100 ml 37 ℃ 1 - 1.5 hr
0 - 50 mM 低盐酶
100 mM 中盐酶
重组DNA技术
粘性末端(cohensive end or stick ) 和３’－突出粘 性末端 4、限制与修饰系统（R-M系统）： 甲基化酶与相关的II型限制性内切酶组成，它们识 别相同序列，发挥不同功能。
限制性核酸内切酶三种切口
❖ 产生5′突出粘性末端（cohesive end):以EcoR I为例：
5′---G AATTC---3′ 3′---CTTAA G---5′ EcoR I
（五）DNA聚合酶（DNA polymerase）
重组DNA技术概述
❖重组DNA技术的基本概念 ❖重组DNA技术的基本步骤 ❖重组DNA技术中应用的重要工具 酶
一、重组DNA技术的基本概念
❖ 重组DNA技术(recombinant DNA technology) ：
是按人类的意愿，在体外对DNA分子进行重组， 再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和 繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。
代完全相同的子代群体。
二、重组DNA技术的基本步骤
❖ 分—载体和目的基因的分离 ❖ 切—限制性内切酶 ❖ 接—载体与目的基因连接成重组体 ❖ 转—基因序列转入细胞 ❖ 筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定
以及表达产物的检测
. Plasmid vectors containing a polylinker, or multiple-cloning-site sequence, commonly are used to produce recombinant plasmids carrying exogenous DNA fragments. (a) Sequence of a polylinker that includes one copy of the recognition site, indicated by brackets, for each of the 10 restriction enzymes indicated. Polylinkers are chemically synthesized and then are inserted into a plasmid vector. Only one strand is shown. (b) Insertion of genomic restriction fragments into the pUC19 plasmid vector, which contains the polylinker shown in (a). (The length of the polylinker in relation to the rest of the plasmid is greatly exaggerated here.) One of the restriction enzymes whose recognition site is in the polylinker is used to cut both the plasmid molecules and genomic DNA, generating singly-cut plasmids and restriction fragments with complementary sticky ends (letters at ends of green fragments). By use of appropriate reaction conditions, insertion of a single restriction fragment per plasmid can be maximized. Note that the restriction sites are reconstituted in the recombinant plasmid.
限制性核酸内切酶三种切口
❖ 产生5′突出粘性末端（cohesive end):以EcoR I为例：
5′---G AATTC---3′ 3′---CTTAA G---5′ EcoR I
（五）DNA聚合酶（DNA polymerase）
重组DNA技术概述
❖重组DNA技术的基本概念 ❖重组DNA技术的基本步骤 ❖重组DNA技术中应用的重要工具 酶
一、重组DNA技术的基本概念
❖ 重组DNA技术(recombinant DNA technology) ：
是按人类的意愿，在体外对DNA分子进行重组， 再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和 繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。
代完全相同的子代群体。
二、重组DNA技术的基本步骤
❖ 分—载体和目的基因的分离 ❖ 切—限制性内切酶 ❖ 接—载体与目的基因连接成重组体 ❖ 转—基因序列转入细胞 ❖ 筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定
以及表达产物的检测
. Plasmid vectors containing a polylinker, or multiple-cloning-site sequence, commonly are used to produce recombinant plasmids carrying exogenous DNA fragments. (a) Sequence of a polylinker that includes one copy of the recognition site, indicated by brackets, for each of the 10 restriction enzymes indicated. Polylinkers are chemically synthesized and then are inserted into a plasmid vector. Only one strand is shown. (b) Insertion of genomic restriction fragments into the pUC19 plasmid vector, which contains the polylinker shown in (a). (The length of the polylinker in relation to the rest of the plasmid is greatly exaggerated here.) One of the restriction enzymes whose recognition site is in the polylinker is used to cut both the plasmid molecules and genomic DNA, generating singly-cut plasmids and restriction fragments with complementary sticky ends (letters at ends of green fragments). By use of appropriate reaction conditions, insertion of a single restriction fragment per plasmid can be maximized. Note that the restriction sites are reconstituted in the recombinant plasmid.
DNA重组技术概述
DNA重组技术概述DNA重组技术（DNA recombinant technology）是利用DNA序列的组合、修饰和重排等方法来获得特定目的的DNA分子的一种技术。
该技术被广泛应用于基因工程、生物医药、农业、食品工业等领域，并在科研、生产和临床医学中产生了重要的影响。
DNA重组技术的主要原理是通过DNA分子的切割、粘接、合成等操作，改变DNA序列的结构和组合关系。
这样一来，就可以将不同来源的DNA片段进行组合，重组为新的DNA分子，从而实现对DNA序列的改变和修饰。
DNA重组技术的核心技术包括PCR扩增、限制酶切割、DNA连接、酶体定向克隆、DNA测序等。
PCR扩增是一种常用的DNA重组技术，它可以在短时间内扩增出目标DNA片段。
PCR的原理是通过DNA聚合酶酶作用下的连续循环体系，将目标DNA片段从少量模板DNA中扩增出来。
这种方法简单、高效，广泛应用于分子生物学研究、基因克隆、医学诊断等领域。
限制酶切割是DNA重组技术中常用的一种手段。
限制酶能识别并切割DNA特定的序列，从而产生特定的DNA片段。
通过选择不同的限制酶，可以将DNA分子切割为具有不同片段和末端特性的DNA片段，从而实现希望的DNA重组效果。
限制酶的切割操作常用于基因克隆、DNA分析和重组等实验中。
DNA连接是DNA重组技术的另一个核心环节。
DNA连接是将两条DNA片段的末端通过DNA连接酶的作用连接在一起，形成一个新的DNA分子。
DNA连接的方法有多种，如末端连接、中间连接等。
不同的连接方式和连接酶的选择，可以实现不同的DNA重组目的。
通过DNA连接技术，可以将来自不同源的DNA片段进行连接，从而构建出具有特定功能的DNA分子。
酶体定向克隆是DNA重组技术中的一种重要方法。
它通过酶体（vector）的选择和DNA片段的连接来实现目标DNA片段的克隆和表达。
常用的酶体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
酶体定向克隆技术常用于基因工程研究，用于将外源基因导入到宿主细胞中，并在宿主细胞中表达和复制。
DNA重组技术(内含参考文献)
受体细胞为真核生物（举例说明） 例1：人类胰岛赤酵母中 的表达
受体细胞为原核生物（例1）
重组人转化生长因子β̩在大肠杆菌中的表达及其活性检测
摘自：现代康复2001 年1月第5 卷第1期 Modern Rehabilitation, January 2001,Vol.5,No.1
2、重组DNA技术研究的的理论基础
在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、 即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质， 解决了遗传的物质基础问题； 50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型 和半保留复制机制,解决了基因的自我复 制和世代交替问题； 50年代末至60年代，相继提出了“中心法 则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密 码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
Results SDS-PAGE,western-blot confirmed that the system can express
efficiently TGF- β̩ protein,which was 23 percent of the total bacterial soluble protein.TGF- β̩ natural activity has been determined by NRK cell.Conclusion The establishment of this system providing an efficient expression cell line for producting TGF- β̩ protrin on a large scale.
摘要:
纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。国内外许多 学者对该酶进行了基因工程研究，但在克隆表达过程中出现 了许多长短不同的基因片段。 本研究通过原产日本的优质纳豆中分离鉴定出高产纳豆杆菌 N07 并提取该菌株的全基因组; 通过PCR 手段扩增出能编码 纳豆激酶信号肽，前导肽和成熟肽的前纳豆激酶酶原基因 NK1，以及能编码纳豆激酶成熟肽的纳豆激酶基因NK2，构 建了纳豆激酶基因的表达载体pET30a-NK1 和pET30a-NK2 ，转化E． coli BL21 后在大肠杆菌中表达，并进行了活性分 析。 结果发现，纳豆激酶酶原基因片段NK1 能成功表达出有活性 的分泌型纳豆激酶; 而纳豆激酶基因片段NK2 的表达产物为 无活性的包涵体。在对NK1 和NK2 的比较研究后可知，纳豆 激酶酶原基因片段NK1 能在大肠杆菌中很好的分泌表达，这 将为纳豆激酶基因工程的深入研究奠定基础。
DNA重组技术
DNA重组技术不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程，称为DNA重组（DNA recombination）。
重组DNA技术（recombinant DNA technology）作为分子生物学的一项重要技术得到了迅速的发展。
利用重组DNA技术对DNA分子进行剪切和重新连接，构成重组DNA分子，然后把它导入宿主细胞，进而扩增相关DNA片段，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。
克隆（clone）是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。
构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系，即DNA的分子克隆（molecular cloning）过程。
因此，重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术，其具体过程大致为分、切、连、转、筛选。
即分离纯化目的质粒载体、用限制性内切酶酶切纯化的载体、酶切后的载体与靶基因片段的连接、构建质粒载体转染感受态菌、筛选阳性克隆。
载体选择载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。
常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。
目前已构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型，亦可根据其用途不同分为克隆载体和表达载体二类。
载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件：①在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力；②有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性；③分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重组操作。
④具有合适的筛选标记，以便区分阳性重组体和阴性重组体，常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等。
⑤配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等。
本试验选择高拷贝型pGEM载体系列的pGEM-3Zf(+)为基础载体，它含有Lac Z基因编码区、SP6、T7RNA聚合酶启动子和其间的多克隆区域（见图），能在离体情况下合成ssDNA或RNA由于构建DNA或RNA探针的构建。
重组dna技术的主要步骤
重组dna技术的主要步骤重组DNA技术的主要步骤引言：重组DNA技术是一种通过改变生物体的遗传物质来实现特定目的的技术。
它已经被广泛应用于农业、医学和生物工程等领域。
本文将介绍重组DNA技术的主要步骤，包括DNA提取、DNA剪切、DNA 连接和DNA转化。
一、DNA提取DNA提取是重组DNA技术的第一步。
它是从生物体中提取DNA分子的过程。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿法和盐法。
酚-氯仿法通过酚和氯仿溶解细胞膜，使DNA从其他细胞组分中分离出来。
盐法则通过加入高盐浓度的溶液来沉淀DNA。
DNA提取需要保证提取得到的DNA纯度高、浓度适宜。
二、DNA剪切DNA剪切是将DNA分子切割成特定长度的过程。
它可以通过限制性内切酶来实现。
限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并在该序列特定位置切割的酶。
通过选择合适的限制性内切酶，可以将DNA分子切割成具有精确长度的片段。
三、DNA连接DNA连接是将两个或多个DNA片段连接在一起形成重组DNA分子的过程。
DNA连接需要使用DNA连接酶来催化连接反应。
DNA连接酶能够识别DNA片段的粘性末端并将它们连接在一起。
连接反应需要在适当的温度和缓冲液条件下进行，以确保连接效率和连接质量。
四、DNA转化DNA转化是将重组DNA分子导入到宿主细胞中的过程。
宿主细胞可以是细菌、酵母或植物细胞等。
DNA转化需要使用适当的方法，如热激转化、电穿孔或基因枪等。
通过将重组DNA转化到宿主细胞中，可以使宿主细胞获得新的遗传信息，并表达出特定的基因产物。
五、应用与进一步研究重组DNA技术在农业、医学和生物工程等领域具有广泛的应用前景。
在农业领域，重组DNA技术可以用于改良作物的抗病性、耐逆性和产量等性状。
在医学领域，重组DNA技术可以用于治疗遗传性疾病、生产重组蛋白药物和疫苗等。
在生物工程领域，重组DNA技术可以用于合成新的代谢途径、改造微生物代谢产物等。
进一步的研究可以进一步完善重组DNA技术的方法和应用，促进其在各个领域的应用和发展。
重组DNA技术
23 重组DNA技术
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4.2 DNA分子的体外重组
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酶切和连接。
23 重组DNA技术
二三．4.3 重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定 二四．重组DNA引入宿主细胞
○ 原核生物细胞是很好的受体细胞→容易摄取外界的DNA， 增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作。大肠杆菌、 蓝藻、农杆菌等。
重组DNA技术
A Northern印迹
可以检测特定基因的表达情况。
B 原位杂交
可以检测特定细胞中某一基因的表达情况。
23 重组DNA技术
1.2 PCR
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效 果，请言简意赅地阐述您的观点。您的内容已经简明扼要，字字珠 玑，但信息却千丝万缕、错综复杂，需要用更多的文字来表述；但 请您尽可能提炼思想的精髓，否则容易造成观者的阅读压力，适得 其反。正如我们都希望改变世界，希望给别人带去光明，但更多时 候我们只需要播下一颗种子，自然有微风吹拂，雨露滋养。恰如其 分地表达观点，往往事半功倍。当您的内容到达这个限度时，或许 已经不纯粹作用于演示，极大可能运用于阅读领域；无论是传播观 点、知识分享还是汇报工作，内容的详尽固然重要，但请一定注意 信息框架的清晰，这样才能使内容层次分明，页面简洁易读。如果 您的内容确实非常重要又难以精简，也请使用分段处理，对内容进 行简单的梳理和提炼，这样会使逻辑框架相对清晰。
23 重组DNA技术
01
02
03
质粒载体pBR322
04
有复制起始点，能 在受体细胞内复制；
有2种筛选标记基 因；
05
有允许外源DNA插 入的位点；
有高的拷贝数。
pBR322图谱
《重组DNA技术简介》课件
载体的构建
选择合适的载体，如质粒或病毒载体，对其进行 限制性内切酶切割、连接和转化等操作，构建成 重组载体。
克隆的表达与分析
对阳性克隆进行培养和诱导表达，收集表达产物 并进行相关分析，如蛋白质纯化、Western blot 等。
03
重组DNA技术的实验操作
基因的克隆与鉴定
基因克隆
将目的基因从原始生物体中提取出来，经过剪切、拼接等操作后 ，将其插入到载体DNA中，形成重组DNA的过程。
04
重组DNA技术的安全性与伦理问题
重组DNA技术的安全性评估
重组DNA技术的安全性
重组DNA技术是一种在分子水平上对DNA进行操作的技术，通过该技术可以实现对生物 遗传信息的精确控制。经过多年的研究和应用，重组DNA技术已经得到了广泛的应用和 认可，被认为是一种相对安全的技术。
安全评估的必要性
各国政府也制定了一些关于重组DNA 技术的法规和政策，例如美国的《人 间重组DNA研究指南》和中国的《人 间遗传资源管理暂行办法》等。这些 法规和政策对技术的研发和应用进行 了规范和管理，以确保技术的安全和 可控性。
重组DNA技术的社会影响与争议
社会影响
争议与挑战
重组DNA技术作为一种先进的生物技 术，对社会产生了深远的影响。该技 术的应用不仅推动了生物医学领域的 发展，也促进了农业、工业等领域的 技术革新。同时，该技术的应用也引 发了一些社会问题和争议。
基因表达的调控对于生物体的生长发 育和环境适应性至关重要。基因表达 受到多种因素的影响，包括DNA的甲 基化、染色质结构的改变、蛋白质因 子的作用等。
重组DNA技术的操作流程
目的基因的获取
通过限制性内切酶将DNA切割成片段，再通过 凝胶电泳和回收试剂盒分离得到目的基因。
重组dna技术
重组DNA技术介绍重组DNA技术是一种改变生物体基因组的方法，它包括将不同种类的DNA序列组合在一起，从而创建出新的基因组序列。
这项技术的出现引发了科学和医学领域的巨大进步，并在许多领域的研究中发挥着重要的作用。
DNA重组技术的原理DNA重组技术的基本原理是通过将所需的DNA片段插入到载体DNA中，然后将这个“重组”的DNA转移到宿主细胞中，使其表达目标基因。
具体步骤如下：1.DNA片段的获取：首先，需要获取到所需的DNA片段。
这可以通过多种方法实现，如利用限制性内切酶切割DNA、合成化学DNA等。
2.选择适当的载体：载体DNA是一个外源DNA分子，可以用来将目标DNA片段转移至宿主细胞中。
常用的载体包括质粒、噬菌体以及人工染色体等。
3.DNA连接：将目标DNA片段和载体DNA通过DNA连接酶连接起来，形成一个新的重组DNA分子。
4.转化宿主细胞：将重组DNA分子转移到宿主细胞中。
常用的方法包括化学法、电穿孔法以及使用噬菌体病毒作为媒介等。
5.目标基因表达：当重组DNA转移到宿主细胞中后，宿主细胞会开始转录和翻译这个重组DNA，从而产生所需的蛋白质。
重组DNA技术的应用重组DNA技术在许多不同领域中广泛应用。
以下是其中一些重要的应用：1. 基因工程重组DNA技术为基因工程提供了基础。
通过将外源基因插入到宿主细胞中，可以实现在宿主细胞中大量表达目标基因。
这在制药工业中非常重要，可以用来生产各种药物，如人类胰岛素、生长因子等。
2. 农业重组DNA技术在农业领域中也有广泛的应用。
例如，通过将特定基因导入农作物中，可以使其具有某种特定的农艺性状，如抗虫性、抗病性以及耐旱性等。
这为作物生产提供了新的方法和机会。
3. 疾病研究重组DNA技术为疾病研究提供了强大的工具。
通过重组DNA技术，研究人员可以建立转基因动物模型，模拟人类疾病，从而更好地理解疾病的发生和发展机制。
此外，重组DNA技术还可以用于研究特定疾病的基因诊断和治疗方法。
重组dna技术名词解释及流程
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生物技术制药-DNA重组技术
分离病毒颗粒
培养转化细胞、收集菌体
病毒载体DNA分离与纯化
破碎细胞
质粒DNA分离与纯化
ＤＮＡ分子的体外连接 目标DNA片断插入载体
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片 段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间 形成磷酸酸脂键的生物化学过程， ＤＮ Ａ分子的连接是在酶切反应获得同种酶 互补序列基础上进行的。
植物细胞 动物细胞 微生物细胞：细菌和真菌
（1）将目的基因导入植物细胞 双子叶植物—农杆菌转化法
（1）将目的基因导入植物细胞 单子叶植物—基因枪法
（1）将目的基因导入植物细胞
转基因抗虫棉－花粉管通道法
（2）将目的基因导入动物细胞
显微注射法
（3）将目的基因导入大肠杆菌细胞
质粒转化法：
用CaCl2处理大肠杆菌细胞 感受态大肠杆菌细 胞 重组载体与之混合 重组载体感染感受态 细胞（目的基因进入大肠杆菌细胞）
ⅰ. 超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型 ⅱ. 变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而质 粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前 者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。 变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法
载体DNA分离的一般程序
载体DNA
感染或转染细胞（病毒型）
转化细菌细胞（质粒型）
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一
起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定
的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形
成杂化双链(heteroduplex) 。
复性
RNA
DNA
（一）印迹技术 （二）探针技术
探针 (probe)
一小段用同位素、生物素或荧光染料标
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载体DNA分子，需要具备：
具复制原点(ori)，在宿主细胞中不仅能独立地自我 复制，而且能带动携带的外源DNA片段一起复制
具有多克隆位点(multiple cloning site, MCS)，而每 一种酶的切点只有一个，用于克隆外源DNA片段。 这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基 因内
Southern blot
Northern blot
analysis of BLTR mRNA
Tracing and Assaying Molecules Inside Cells
In situ hybridization for RNA localization in tissues.
Fluorescent In situ hybridization
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)
聚合酶链式反应是体外快速扩增DNA的方法
PCR反应包括三个步骤： 变性(denature)：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链 低温退火(annealing)：两个引物分别与单链DNA互补复性
延伸(extension)：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃ 合成模板DNA的
☆现在广泛使用且商品化的质粒，很多都具有重组表型检 测标记，在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒 是否携带外源DNA片段
λ噬菌体
◆ λ噬菌体基因组全长49kb。λ噬 菌体DNA中间约三分之二的序列为 中间基因簇，位于两端的为DNA左、 右臂。λ基因组的中间基因簇序列 可被外源DNA片段取代, 而不影响 噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能 力
至少具有一个选择标记基因，使有或无载体的宿主 细胞具有易鉴别的表型
易从宿主细胞中回收。 较小的相对分子量和较高的 拷贝数
安全性
载体(vector)的种类
细菌质粒载体 λ噬菌体 柯斯质粒(cosmid) 穿梭载体 酵母人工染色体（yeast artificial
chromosome，YAC） Ti质粒
基因工程重要特征：
可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系 的任何其他受体细胞中，可以任意改造ห้องสมุดไป่ตู้物的 遗传特性，创造出生物的新性状
某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备 大量纯化的DNA片段提供了可能
基因工程技术路线
DNA片段的取得（目的基因的分离和制备） DNA片段和载体的连接——重组体DNA 外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基
限 制 性 内 切 核 酸 酶
粘性末端 平整末端
其它工具酶
T4 DNA连接酶(ligase) 反转录酶（reverse transcriptase)
载体(vector)
一个DNA片段只有与适合的载体(vector) DNA 连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下， 才可以高效率地进入宿主细胞(host cell)，并 在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为 DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵 母菌人工染色体（BAC、YAC）等
这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环
RT-PCR
限制性内切核酸酶
限制性内切核酸酶或限制性酶(restriction enzymes) 是细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子的一类 酶。以限制(restriction )或阻止病毒侵染
限制性酶据其作用特点，可分为两类 ※第Ⅰ类限制性酶每隔一段DNA序列随机切割双链 DNA分子，没有序列特异性 ※第Ⅱ类限制性酶能识别一段特异的DNA序列，准确 地酶切双链DNA的特异序列。第Ⅱ类限制性酶识别的 序列是对称的，即在一条链中从5’到3’方向的序列，与 其互补链从5’到3’方向的序列完全相同。这种从两个方 向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列 (palindrome)
重组DNA技术（基因工程）
基因工程 基因工程的风险和伦理学问题
基因工程
基因工程概述 基因工程的相关技术 基因工程的工具酶 载体 基因工程的基本步骤 基因工程的应用
基因工程的概念 genetic engineering
基因工程一般可分为广义和狭义的两种。广义的基因 工程包括：整体水平，如生物的有性杂交；细胞水平， 如细胞融合；分子水平，染色体工程、基因克隆等。 狭义的基因工程即是通常讲的基因克隆。因 筛选目的克隆 基因表达与产物分离
基因工程的相关技术
核酸的分子杂交 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction):
PCR和RT-PCR (reverse transcription PCR)
核酸的分子杂交
Southern blot-DNA Northern blot-RNA In situ hybridization Fluorescent In situ hybridization
◆ λ噬菌体载体可接受15 kb-23 kb 的外源DNA片段，它既可作为克隆 载体，也可作为表达载体，在基因 库筛选中，λ噬菌体作载体与细菌 质粒相比，具有易操作、阳性克隆
数多等特点，现广泛用于各类基因 库的构建
柯斯质粒(cosmid)
➢ 柯斯质粒(cosmid)是利 用部分λ噬菌体DNA与 部分细菌质粒DNA序 列组建而成的
目的: 是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状， 并能稳定遗传。
基因工程的概念
genetic engineering
定义： 又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片 断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受 体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。基因工程是 采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的 现代方法和手段建立起来的基因操作技术。
细菌质粒载体
◆质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能 自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子
☆这些质粒的适应范围广，拷贝数多。进入宿主细胞复制 后，每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个
◆早期用于基因工程的载体是经遗传改良的细菌质粒，它 们仅能用于克隆分子量小于10kb( 1000bp =1kb)的外源 DNA片段