DNA重组技术的原理及步骤.ppt

DNA重组的原理
DNA重组是一种实验技术，用于将来自不同来源的DNA片段重新组合在一起形成新的DNA分子。

它的原理基于DNA的
双链结构和其特有的互补碱基配对规则。

首先，需要获取来自不同来源的DNA片段。

这些片段可以来
自同一生物体的不同基因，也可以来自不同生物体的DNA。

每个DNA片段都有自己特定的基因序列。

接下来，将目标DNA片段和载体DNA准备好。

载体DNA是
一个可以自我复制的DNA分子，常用的载体有质粒和噬菌体。

目标DNA片段和载体DNA都需要进行酶切，使用特定的限
制酶将它们切割成互补的DNA末端。

然后，将目标DNA片段和载体DNA连接在一起。

这一步需
要使用DNA连接酶，将目标DNA片段和载体DNA的互补末
端连接起来，形成一个新的DNA分子。

连接的过程中会形成
磷酸二酯键。

最后，将重组后的DNA分子导入宿主细胞中。

这可以通过转
化或转染的方法实现。

宿主细胞会接受重组后的DNA，并将
其复制和传递给子细胞，从而产生大量拥有重组DNA的细胞。

通过DNA重组，可以将不同基因或DNA片段组合在一起，
创建新的DNA分子。

这项技术被广泛应用于基因工程、遗传
学研究以及生物制药等领域。

DNA重组技术的原理及步骤DNA重组技术是一种分子生物学技术，它通过重新组合DNA分子的特定部分，可以改变生物体的基因组成，从而实现对基因的操作和操控。

DNA重组技术的原理可以概括为：通过酶类作用在DNA链上剪切出特定的片段，再利用DNA连接酶将不同源的DNA片段连接在一起，形成新的DNA分子。

第一步：DNA提取DNA提取是DNA重组技术的前提和基础。

首先需要选择适当的生物样本，如细菌、植物、动物细胞等，利用细胞裂解方法将细胞溶解，释放出DNA。

然后经过蛋白质酶的消化，去除蛋白质、RNA等杂质，最终得到纯净的DNA溶液。

第二步：DNA切割DNA切割是指将DNA分子切割成特定的片段。

这一步骤可以利用限制性内切酶来实现。

限制性内切酶是一种酶类，能够识别DNA链上的特定序列，并在该序列的特定位点上切割DNA链。

通过选择不同的限制性内切酶，可以将DNA切割成不同长度的片段。

第三步：DNA纯化与回收切割后的DNA片段需要通过凝胶电泳分离和纯化。

凝胶电泳是利用DNA片段在电场中的移动速度差异，使不同长度的DNA片段在凝胶中分离的方法。

分离完成后，可以通过抽取单个的DNA片段进行纯化，获得所需的DNA溶液。

第四步：目标片段回收将目标片段从凝胶中回收需要先进行DNA片段的可视化。

一般可以采用亮蓝G染色剂着色和紫外线照射的方式进行可视化，然后使用刮片等方法将目标片段回收。

第五步：DNA连接DNA连接是将目标片段与载体DNA连接在一起，形成重组DNA。

载体DNA一般选择能够稳定复制的质粒或噬菌体基因组。

连接需要使用DNA连接酶，该酶能够识别DNA链的断裂末端，并将目标片段与载体DNA连接在一起。

第六步：转化连接完成后，可以将重组的DNA转移到宿主细胞内。

转移可以通过化学法转化细胞、电穿孔法或者基因枪等方法实现。

转化后的细胞会自主复制并表达被插入的重组DNA。

第七步：筛选与鉴定对转化后的细胞进行筛选与鉴定，以确定是否成功插入重组DNA。

DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤【实验原理】1．DNA重组技术重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。

它包括以下几个步骤：1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA 克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。

该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。

2）将重组DNA分子转化宿主细胞。

3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。

挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。

4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。

2．质粒DNA的小量制备常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。

本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH 12.0~12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。

将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。

大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。

通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。

3．质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。

实验十 DNA重组一、实验原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。

DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。

即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5¹端磷酸和3¹端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。

常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更广泛。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分3步：①首先，ATP与T4噬菌体DNA连接酶通过ATP的磷酸与连接酶的赖氨酸的氨基形成酶―ATP复合物。

②被激活的AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5¹端的磷酸基团上，形成磷酸―磷酸键。

③DNA链3¹端的羟基被活化，取代ATP后与DNA5¹端的磷酸根形成磷酸二酯键，并释放出AMP，完成DNA之间的连接。

T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和ATP作为辅助因子，在一定的温度和pH条件下进行连接反应。

二、仪器及试剂：1. 仪器：台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅等。

2. 试剂：T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接酶缓冲液、载体DNA、外源DNA。

三、操作步骤1. 外源DNA片段和载体DNA的连接取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul酶切后的DNA片段 *1 约0.3 pmol酶切后的载体DNA *2 约0.03pmolT4 DNA Ligase 1ulddH2O 加至 25ul*1 DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3－10倍。

人工基因重組（DNA重組技術）
一、人工基因重組：
以人工方法將不同來源的DNA連接起來而成為重組DNA
→再將重組DNA放入宿主細胞（基因轉殖）
→重組DNA在細胞內進行複製、轉錄和轉譯以合成蛋白質
二、重組DNA的操作過程：
1.載體和目標基因（外源基因）的選取：
(1)以細菌質體、噬菌體、病毒DNA、反轉錄病毒作為載體
→載體須帶有特定的標誌基因（耐抗生素、抗重金屬、螢光的基因）
(2)以動物、植物、微生物的DNA作為目標基因（外源基因）
2.利用限制酉每（鑑識酉每）切開載體和目標基因→使DNA的二端各呈單股
(1)限制酉每具有高度專一性（僅能辨識特定的一小段核酸序列）
→由特定的二個含氮鹽基間切開
→使載體與目標基因的二端皆各呈單股（黏性端）
(2)黏性端使目標基因與載體之單股DNA能穩定配對而不易斷裂
(3)GAA TTC為EcoRI限制酉每的辨認序列
→EcoRI會切開核酸序列中的含氮鹽基G與A之間的磷酸鍵
3.重組DNA：
→利用接合酉每（DNA連接酉每）以共價鍵方式將目標基因與載體連結成環狀的重組DNA
4.基因轉殖：將重組DNA送入宿主細胞中
→目標基因隨著載體在細菌體內複製、轉錄和轉譯、表現性狀
5.篩選轉形細胞：
∵質體帶有特定的標誌基因（耐抗生素、抗重金屬、螢光的基因）
∴轉殖成功的細胞（轉形細胞）可生長於含抗生素或重金屬的培養基中未轉殖成功的細胞則無法生存於含抗生素或重金屬的培養基中。