荧光偏振免疫分析

荧光偏振与荧光偏振免疫分析法【摘要】本文简单介绍了荧光偏振原理和荧光偏振免疫分析（FPIA）的原理，并就荧光偏振及FPIA在环境、食品安全、医疗卫生和蛋白质研究等方面的实际应用进行了简单介绍和举例。

【关键词】荧光偏振免疫分析应用从1852年，Stokes首次提出“荧光（fluorescence）”一词，人们对荧光现象的研究就不断深入，并发展出了荧光分析技术，荧光分析是指利用一些物质被电磁辐射激发后产生反映该物质特性的荧光而对该物质进行定性定量分析的方法。

随着相关理论和仪器的发展，荧光分析的手段和技术水平也不断发展，现在荧光分析以其高灵敏度、高选择性、低样品用量、方法简便等诸多优点，在化学、医药、环境、信息、生命科学等领域被人们广泛使用。

基于荧光偏振发展的荧光偏振免疫分析法是荧光分析中一个重要的组成部分。

一、荧光偏振原理荧光偏振的原理最初是1920年由Perrin建立的。

溶液中荧光分子受偏振光激发，如激发时分子保持静止，则发射的荧光仍有偏振性，且如分子分子旋转或翻转，发射荧光的偏振平面会不同于激发光偏振平面。

虽然实际测量常得消偏振的荧光，但荧光偏振技术有着重要应用[1]。

荧光偏振光强度P定义为：P=（I⊥-I∥）/（I⊥+I∥）其中，I⊥和I∥表示荧光子被激发后，发射光在垂直和水平方向上的强度。

对于荧光偏振仪器，检测到的荧光强度：P=（Ivv-G×Ivh）/（Ivv+G×Ivh）式中，下标分别代表起偏器和检偏器方向，v为垂直方向，h为水平方向，G 为校正因子，G=Ihv/Ihh。

荧光偏振光强度P与测定体系中各因素的关系可用Perrin方程表示:（1/P-1/3）=1/P0+（1/P0+1/3）（RT/V）(τ/η)其中，P0为极限荧光偏振光强度，R为气体常数，T为绝对温度，V为摩尔分子体积，τ为荧光寿命，η为溶液的粘度。

由上式知当溶液的温度和粘度都固定时，P值主要取决于荧光子的分子体积。

荧光偏振免疫法测定血中依替米星的浓度毛璐;卞婧;张威;甄健存【摘要】Objective: To develop the FPIA method to determine etimicin concentration in blood and investigate the feasibility of this method. Methods: The gentamycin test box was used to test the etimicin concentration by TDx. Results: The regression curve was Y= 0A39X + 0.177 2 (r= 0.998 1), and the linear relationship was good in range of 0.5 -20 ug·mL-1. The relative standard deviation was less than 10% for both intra-day and inter-day assay. The relative recovery for different concentrations were (93.12 ± 9.74)%, (102.41 ± 2.73)% and (89.50 ± 1.45)%, respectively. Conclusion: The FPIA method has high sensibility, easy operation and short test time. It can be used to determine blood concentration of etimicin in clinic.%目的:探索应用荧光偏振免疫法测定依替米星血药浓度的实验方法,考察该方法测定依替米星的可行性.方法:使用庆大霉素荧光偏振免疫试剂盒,用TDx对依替米星进行测定.结果:本方法能够检测依替米星的血药浓度,回归曲线为Y=0.439X+0.1772,r=0.9981,在0.5～20μg·mL-1,浓度范围内线性关系良好.日内、日间标准偏差均小于10%,低、中、高不同浓度的加样回收率分别为(93.12～9,74)%,(102.41～2.73)%,(89.50～1.45)%.结论:本方法灵敏度高,操作简便,检测时间短,可以用于临床快速检测依替米星的血药浓度.【期刊名称】《中国药物应用与监测》【年(卷),期】2011(008)005【总页数】2页(P282-283)【关键词】依替米星;浓度监测;荧光偏振免疫法【作者】毛璐;卞婧;张威;甄健存【作者单位】北京积水潭医院药剂科,北京,100035;北京积水潭医院药剂科,北京,100035;北京积水潭医院药剂科,北京,100035;北京积水潭医院药剂科,北京,100035【正文语种】中文【中图分类】R917硫酸依替米星系半合成氨基糖苷类抗生素，是我国自行研制的I类新药，其抗菌谱广、抗菌活性强、抗交叉耐药性好，且耳、肾毒性远低于其他氨基糖苷类抗生素，可以用于耐庆大霉素菌株，即产氨基糖苷类钝化酶菌株的感染[1]。

荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应, 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原.由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。

本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。

一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质,并通过免疫应答排除抗原性异物,以维持机体生理平衡的功能。

免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康.特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制,针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体,只能对同一种抗原发挥免疫功能.而对变异或其他抗原毫无作用。

1、抗原1。

1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答（免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。

抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上.1。

2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。

半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。

如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1。

3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团,它直接决定免疫学反映的特异性.抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。

因此,抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。

2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。

2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。

荧光偏振免疫测定原理荧光偏振免疫测定是一种高灵敏度、高选择性的生物分析技术，被广泛应用于医学、生物学和环境监测等领域。

该技术的原理基于免疫反应和荧光偏振现象，通过对待测物体系中特定分子的选择性捕获和荧光信号检测，实现对目标物质的快速、准确测定。

荧光偏振免疫测定的原理可分为三个关键步骤：免疫反应、荧光标记和偏振信号检测。

首先，免疫反应是荧光偏振免疫测定的基础。

它依赖于抗原与抗体之间的高度特异性结合。

抗原是待测物体系中所含有的分析目标，抗体则是针对特定抗原的免疫分子。

在荧光偏振免疫测定中，抗原首先被固定在试验平台上，形成固相。

然后，待测样品中的抗原与试验平台上的抗体进行结合反应。

这种特异性结合反应仅发生在目标物质存在的情况下，因此可以使用免疫反应来筛选目标物质并排除其他干扰物质。

接下来，荧光标记是实现荧光信号检测的关键步骤。

它利用特定的荧光染料或荧光颗粒，将其标记在反应中与目标物质结合的抗体或其他特定分子上。

这些荧光标记物可以发射特定波长的荧光信号，并具有较长的发光寿命。

荧光标记物的选择应考虑到其荧光性能，例如荧光量子产率和发射波长尽可能远离样品中其他自发荧光的波长，以避免干扰信号。

荧光标记物的引入使得待测物体系具有荧光特性，从而可以通过检测荧光信号来实现分析和测定。

最后，偏振信号检测是荧光偏振免疫测定的核心。

它利用了光波振动方向的偏振特性。

在荧光偏振免疫测定中，通过选择适当的偏振器和荧光探测器，可以将荧光信号从样品中提取出来，并测量相对应的荧光偏振参数。

荧光偏振参数是由样品中荧光分子的取向、偏振或了解以及其与固相之间的相互作用所决定的。

这些参数可以提供关于待测物体系中分子间相互作用的信息，因此能够准确测定特定目标物质的含量。

总之，荧光偏振免疫测定通过免疫反应、荧光标记和偏振信号检测等关键步骤，实现对目标物质的高灵敏度、高选择性测定。

这种技术不仅具有广泛的应用前景，而且对于生物医学研究和临床诊断具有重要意义，能够帮助人们更好地理解分子间的相互作用以及其在生物体系中的功能和调控机制。

雌二醇荧光偏振免疫分析方法试验方案1.雌二醇半抗原的合成方法：将150 mg(0.55 mmol) E2（258.36g/mol）溶于3 mL 干燥的二甲基亚砜中, 加入0.5 g(9 mmol) KOH粉末。

搅拌5 min后加入150 mg (1.07 mmol)溴乙酸。

继续搅拌, 反应2 h后加入25 mL冰水。

乙酸乙脂萃取回收未反应的E2。

水相用2 mol/L HCL 酸化, 出现白色沉淀。

砂芯漏斗过滤, 沉淀物用蒸馏水洗至中性, 放入烘箱干燥，得白色沉淀（记录质量）。

点板监控，用乙酸乙酯：石油醚=3：2（加1滴冰乙酸）的展开剂比例。

从结构上可以看到有一个羧基暴露，所以可以考虑将荧光素衍生出一个氨基，使其两者可以结合。

2. 对荧光素进行衍生2．1 中间产物异硫氰酸荧光素乙二胺fluoresceinthiocarbamyl ethylenediamine(EDF)的合成反应式见图：图. EDF合成过程Figure. The synthesis of EDF具体步骤：（1）配制甲醇三乙胺溶液，三乙胺浓度为10mL/L。

（2）将20 mg（0.3 mmol）(70ul) 乙二胺和11.7mg（0.03mmol）FITC，分别溶于5mL甲醇三乙胺溶液和1mL甲醇三乙胺溶液中。

（3）将FITC溶液逐滴(约每30秒一滴)加到三乙胺溶液中，室温(室温产率很低，请尝试40度水浴或油浴)避光搅拌反应，刚投料后TLC监控一次（用稀FITC溶液作对照，以后每次都是），随后每隔30 min TLC监测一次，直至FITC点消失。

（4）旋转蒸发浓缩反应液（旋干！！之后在烘箱烘30 min！！非常重要），用展开剂乙酸乙酯:甲醇＝3:1展开，观察有新物质产生。

（5）装一个短而粗的层析柱，用纯的乙酸乙酯冲洗50 mL，换成乙酸乙酯:甲醇＝3:1冲洗，待下边黄色FITC带下来后，用甲醇冲洗柱子，收集滤液浓缩即得纯化EDF，得到粉末状的EDF；或者不用甲醇冲，直接色谱柱最上层红黄色带刮下来，放入离心管用甲醇震荡冲洗，离心收集上清，反复冲洗离心3-5次，合并上清。

荧光偏振免疫法荧光偏振免疫法是一种常用的生物分析技术，可以用于检测和分析样品中的特定分子。

本文将介绍荧光偏振免疫法的原理、应用以及优缺点。

一、原理荧光偏振免疫法是基于荧光技术和免疫学原理的结合。

它利用特异性抗体与目标分子结合的能力，通过荧光标记的抗体来检测和定量目标分子。

荧光偏振免疫法的原理可以简述为以下几个步骤：首先，将样品中的目标分子与特异性抗体进行反应，形成抗原-抗体复合物。

然后，通过加入荧光标记的二抗或酶标记的二抗，使荧光物质或酶物质与抗原-抗体复合物结合。

最后，通过荧光偏振光谱仪或酶标仪来检测和测量荧光强度或酶的活性，进而定量目标分子的含量。

二、应用荧光偏振免疫法在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用。

以下是一些常见的应用领域：1. 肿瘤标记物检测：荧光偏振免疫法可以检测和定量血清中的肿瘤标记物，如癌胚抗原（CEA）、前列腺特异性抗原（PSA）等，用于早期癌症的筛查和诊断。

2. 免疫组织化学：荧光偏振免疫法可以用于定位和定量组织中的特定蛋白或细胞表面标记物，如免疫组织化学染色和免疫组织化学定位。

3. 免疫荧光显微镜：荧光偏振免疫法可以用于细胞和组织的观察，通过荧光偏振显微镜观察荧光信号的方向和强度，可以获得更多的信息，如蛋白的空间分布、蛋白的定位等。

4. 荧光免疫分析：荧光偏振免疫法可以用于定量检测样品中的特定分子，如激素、细胞因子等。

通过测量荧光强度和方向，可以实现高灵敏度和高特异性的分析。

三、优缺点荧光偏振免疫法具有以下优点：1. 高灵敏度：荧光偏振光谱仪可以测量荧光信号的强度和方向，提高了测量的灵敏度。

2. 高特异性：荧光偏振免疫法利用特异性抗体与目标分子结合，具有高特异性，可以准确检测目标分子。

3. 高通量：荧光偏振免疫法可以同时检测多个目标分子，提高了检测效率。

4. 定量分析：荧光偏振免疫法可以通过测量荧光强度或酶活性来定量目标分子的含量。

然而，荧光偏振免疫法也存在一些缺点：1. 荧光标记的抗体易受到光照和温度的影响，可能导致荧光信号的变化。