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应用Bio-Kine 软件(Bio-Logic)通过两个散射
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 3. DNA-组蛋白复合体荧光偏振度随组蛋白与DNA 浓 度比变化关系曲线
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 4. 对图表的解释:
在溶液中单独存在时, DNA分子随机卷曲 且有弹性此构型对应着一定的偏振度值. 在我们的实验条件下, DNA 分子的荧光 偏振度在0.11左右;
• 2.FPIA易受样本基质(如与基质蛋白的非 特异性结合),背景荧光和光散射的影响。
• 3.FPIA的检测信号的背景较高,检测范围 (窗口)较窄,信噪比(S/N)较低。
• 4. FPIA对荧光标记物的纯度要求较高,需
对本实验室研究的思考
• 当研究对象为与核酸(DNA/RNA)互作的蛋 白时,可以在核酸的末端加上一个荧光标 签,研究二者之间的结合关系,包括结合常数, 动力学白分子可能呈现更紧密、更小 的构型, 导致复合体分子
荧光偏振研究的一般步骤
• 1.确定最佳的荧光标记物;
• 2.确定公式中的各种参数;
• 3.倍比稀释结合物,根据不同的FP值确定 最优稀释比,使其结合能力与FP值成线性 关系;
• 4.建立标准曲线;
• 而待测样本中竞 争抗原的浓度增 加时,荧光标记抗
• FPIA是均相的 竞争免疫分析方 法,反应完全在 溶液系统中,不 需要分离结合的 和未结合的抗体。
• 实验操作过程非 常简单,仅仅是 将抗体,荧光标
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 1. 制备DNA-组蛋白复合体:
λ-DNA(48kbp)用荧光染料YOYO-1标记, 碱基对与染料分子之比为10:1;
荧光偏振免疫分析的优点
• 1.均相系统,不需要洗涤操作,可大大减少试剂 的用量。
• 2.检测速度很快,且易于自动化,适于快速的筛 选检测。
• 3.荧光标记抗原的均一性好,性质稳定,可长期 保存,方法的重现性好。
• 4.FP值是一个比值,与其他荧光检测技术相比,
荧光偏振免疫分析的缺点
• 1. FPIA比ELISA方法的灵敏度低。一般 来说FPIA的检测限为0.1-10ng/mL-1左右。
荧光偏振免疫分析
---by沈未
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– 荧光偏振(fluorescence polarization, FP)通常定义为: 用垂直方向(丄)的偏振光激发荧光分子,然后测量发射 偏振光在垂直方向(丄)和水平方向(丨)的荧光光强度(丨)
– 早期的荧光偏振研究均以P表示,目前其仍常用于临床 化学和药物筛选;而A多生物学检测,是因其便于进行数 据分析和解释某些相关的物理学参数。
推而广之,还通过核 酸等小分子研究蛋白 -蛋白复合物之间的 结合。
用 Bis-Tris缓冲液(50mmol/L, pH≈6.6)稀 释组蛋白溶液;
组蛋白浓度是DNA的10~500倍;
DNA/YOYO-1溶液(6.5 pmol/L)和稀释后
组蛋白对DNA荧光偏振度影响
• 2.荧光偏振度测量:
用MOS-450/CD测量,其是一个标准的荧光偏 振度测量模式;
在测量荧光偏振度时, 偏振光弹性调制器自 动设置在半波长模式, 这样激发光在水平分 量和垂直分量之间以100 kHz 的频率转换;
• FP值是一个 比值,一般以 mP表示 (1P=1000mP)。
• 分子固定不动, 即完全偏振 时,FP值是 P0=1000 mP, 是理论上的最 大值;
论文的结构和主要内容
• 如果待测样本中 竞争抗原含量很 少(低于检测限), 荧光标记抗原与 抗体结合,FP值 较高(一般在150300 mP)。