默写——专题5 课题3 血红蛋白的提取和分离
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专题5 课题3 血红蛋白的提取和分离 - 知识梳理
的
，从而实现样品中各种分子的分离。
3、两种常用的电泳方法是
和
，
在测定蛋白质分子量时通常使用
。
电泳速率完全取决于
。
二实 验 操 作 蛋白质的提取和分离一般分为四步
：
↓
:
↓
：
↓
：
一基 础 知 识
（一）样品处理
1.红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是
，采集的血样要及时
分离红细胞，分离时采用
离心（500r/min、离心2min），然
除去
；离心速度过高和时间过长会使
等一同沉淀，
达不到分离的效果。
2. 色谱柱填料的处理 商品凝胶使干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中膨胀。
为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用
加热，逐渐升温至接近
沸腾，通常只需1—2h。这种方法不但
，而且可以除去凝胶中可能带有
的
，排除胶粒内的
。
3. 凝胶色谱柱的装填 在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量
【旁栏思考题】
【P70】你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？ 凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较 大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移 动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路 程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子 质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质 量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内 ，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过， ，影响分离的效果。
血红蛋白的提取和分离
专题5 DNA和蛋白质技术课题3 血红蛋白的提取和分离一、教学目标（一）知识与技能1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理（二）过程与方法体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤（三）情感、态度与价值观初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神二、课题重点与难点课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。
课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
三、课题背景分析课题背景通过当今生物科学在蛋白质研究领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，进而明确地提出课题目的：以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些基本技术。
可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法。
四、基础知识分析与教学（一）教学方法：启发式教学（二）教学工具：多媒体课件（三）教学过程引入新课蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化和物。
对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。
所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。
怎样提取蛋白质呢？1、进行新课蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：学习内容：1.凝胶色谱法的用途；2.凝胶色谱法分离蛋白质的原理。
凝胶色谱法也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
凝胶：所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。
教学：在介绍凝胶色谱法的基本原理时，可以结合教科书提供的插图，让学生对凝胶色谱法分离蛋白质的过程有一个直观的认识。
可以通过发动学生查阅资料，让学生了解有关凝胶色谱法的知识，如凝胶的种类、理化性质及凝胶的选择和保存，并结合实验操作，让学生分析实验中的注意事项。
课题3 血红蛋白的提取和分离
④洗涤平衡
装填完毕后，立即用缓冲液洗
脱瓶，在50cm高的操作压下，
用300ml的20mmol/l的磷酸 缓冲液（pH为7.0）充分洗涤 平衡12小时。
注意：
液面不要低于凝胶表面， 否则可能有气泡混入。
不能发生洗脱液流干， 露出凝胶颗粒的现象。
3.样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面
打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,关闭出口
（2）缓冲溶液的配制 通常由1-2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比
例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液
在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是磷酸缓冲液，
目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境， 保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)
5.电泳 （1）概念: 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 （2）原理 ①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。 ②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其所
带电荷相反的电极移动。
③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异 以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移 速度，从而实现样品中各种分子的分离。
（3)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ①聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N‵—亚甲基 双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维 网状结构的凝胶 ②SDS能使蛋白质发生完全变性，由几条肽链组成的蛋白质复 合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的是单条肽 链的分子量，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物， SDS所带负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩
SDS带有大量的负电荷
课题3 血红蛋白的提取与和分离
（半透膜），而大分子不能通过
(二）、凝胶色谱操作---血红蛋白的纯化
1.凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1. 6 厘米的玻璃管，两端磨平
②底塞制作:打孔→挖凹 穴 +安装移液管头部→ 覆盖尼龙网，再用100目 尼龙纱包好。
③顶塞制作 ④组装
注意:底塞中插入的玻璃管的上部不得超出 橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网， 还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。
(2)固定化细胞可以用海藻酸钠，其作用是___包___埋__细__胞____， 加热溶化后的海藻酸钠需冷却到室温才可以加入菌体的原因 是 防止温度高导致微生物死亡 ； 该操作还需要使用氯化钙溶液，其作用是________________。
促进海藻酸钠和微生物混合液形成凝胶珠（或交联剂）
(3)整个操作过程需要在无杂菌的条件下进行，对使用到的玻璃
2.本实验中所用的缓冲液
磷酸缓冲液 目的：利用缓冲液模拟细胞内的pH环境， 保证血红蛋白的正常结构和功能。
(三)电泳 1.电泳的概念
指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 2.原理：
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解 离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 相反的电极移动。
若想尽快达到理想的透析效果可采取的措施是?
（练习）红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的功能主要是由血 红可（ 分蛋以3离）白选，同完用在学成猪电甲的、泳利，牛过用血 、程琼红 羊中脂蛋 或，糖白 其影凝的 他响胶主 脊蛋电要 椎白泳功动质技能物迁术是的移将携血速得带液率到O进的的2行因或蛋实素C白O验包2质，括，进来我行提们取 和蛋分白离质血带电红性蛋质白。、根分据子材本料身回大答小下以列及问分题子：的形状 不同等。
(二）、凝胶色谱操作---血红蛋白的纯化
1.凝胶色谱柱的制作
①取长40厘米，内径1. 6 厘米的玻璃管，两端磨平
②底塞制作:打孔→挖凹 穴 +安装移液管头部→ 覆盖尼龙网，再用100目 尼龙纱包好。
③顶塞制作 ④组装
注意:底塞中插入的玻璃管的上部不得超出 橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网， 还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。
(2)固定化细胞可以用海藻酸钠，其作用是___包___埋__细__胞____， 加热溶化后的海藻酸钠需冷却到室温才可以加入菌体的原因 是 防止温度高导致微生物死亡 ； 该操作还需要使用氯化钙溶液，其作用是________________。
促进海藻酸钠和微生物混合液形成凝胶珠（或交联剂）
(3)整个操作过程需要在无杂菌的条件下进行，对使用到的玻璃
2.本实验中所用的缓冲液
磷酸缓冲液 目的：利用缓冲液模拟细胞内的pH环境， 保证血红蛋白的正常结构和功能。
(三)电泳 1.电泳的概念
指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 2.原理：
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解 离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 相反的电极移动。
若想尽快达到理想的透析效果可采取的措施是?
（练习）红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的功能主要是由血 红可（ 分蛋以3离）白选，同完用在学成猪电甲的、泳利，牛过用血 、程琼红 羊中脂蛋 或，糖白 其影凝的 他响胶主 脊蛋电要 椎白泳功动质技能物迁术是的移将携血速得带液率到O进的的2行因或蛋实素C白O验包2质，括，进来我行提们取 和蛋分白离质血带电红性蛋质白。、根分据子材本料身回大答小下以列及问分题子：的形状 不同等。
课题3 血红蛋白的提取与分离
课题3 血红蛋白的提取与分离核心知识要点1．蛋白质的分离方法(1)凝胶色谱法：①概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
②原理：a ．凝胶⎩⎪⎨⎪⎧ 形态：微小的多孔球体组成：大多数由多糖类化合物构成结构：内部有许多贯穿的通道b ．分离的方法：(2)①概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
②原理：在一定的pH 下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③作用过程： 各种分子⎩⎪⎨⎪⎧⎭⎪⎬⎪⎫带电性质差异分子本身大小不同分子本身形状不同不同的迁移速度各种分子的分离 ④方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
测定蛋白质分子量时通常使用SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2．血红蛋白的提取(1)红细胞的洗涤①目的：去除杂蛋白。
②方法：采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水稀释，再离心，重复洗涤三次，直至上清液中不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。
(2)血红蛋白的释放加蒸馏水(作用是使红细胞吸水涨破)到原血液的体积，再加40%体积的甲苯(作用是溶解细胞膜)，充分搅拌，细胞破裂释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液①将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2 000 r/min 的速度离心10 min 后，可以明显看到试管中的溶液分为4层。
②将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体，即血红蛋白溶液。
3．血红蛋白的粗分离——透析(1)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
(2)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。
(3)目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质。
5.3 血红蛋白的提取和分离 2014.3.9
1、速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉 淀达不到分离的效果。
2、重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞 已洗涤干净。
2、血红蛋白的释放：
加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲 苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟,细 胞破裂释放出血红蛋白。
蒸馏水：使红细胞吸水胀破 甲苯：溶解红细胞的细胞膜 充分搅拌的目的：加速红细胞的破裂
一 基础知识
（一）蛋白质提取和分离的原理
根据蛋白质各种特性的差异：P64 分子的形状大小；电荷性质和多少； 溶解度；吸附性质；对其他分子亲和力
（二）蛋白质提取和分离的方法
1.凝胶色谱法（分配色谱法）；2.电泳法
色谱法：也叫层析法，是指利用混合物中各组分理 化性质的不同，使各组分以不同程度分布进而实现 分离的技术。如：绿叶中色素的提取和分离
基础知识
（三） 凝胶色谱法
阅读并回答
（P64）
1、凝胶色谱法分离蛋白质的依据；
2、凝胶的实质；
3、凝胶色谱法的原理。
（三）凝胶色谱法P64
1.分离依据：
不同蛋白质的相对分子质量不同
2.凝胶的结构：
微小的多孔球体，内部有许多贯穿的通道； 具多孔的凝胶就叫“分子筛”
3.凝胶的化学组成：
多糖类化合物，如葡聚糖或琼脂糖
（五）电泳P65--66 1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.原理：
①多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团会带上正电或负电。②在电场作用下， 带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
待分离 带电性质的差异 各种带电分子产生不 样品 大小、形状的不同 同的迁移速度而分离
透析袋
（三）血红蛋白的纯化-凝胶色谱操作 1.凝胶色谱柱的制作 2.凝胶色谱柱的装填 3.样品的加入和洗脱
2、重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞 已洗涤干净。
2、血红蛋白的释放：
加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲 苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟,细 胞破裂释放出血红蛋白。
蒸馏水：使红细胞吸水胀破 甲苯：溶解红细胞的细胞膜 充分搅拌的目的：加速红细胞的破裂
一 基础知识
（一）蛋白质提取和分离的原理
根据蛋白质各种特性的差异：P64 分子的形状大小；电荷性质和多少； 溶解度；吸附性质；对其他分子亲和力
（二）蛋白质提取和分离的方法
1.凝胶色谱法（分配色谱法）；2.电泳法
色谱法：也叫层析法，是指利用混合物中各组分理 化性质的不同，使各组分以不同程度分布进而实现 分离的技术。如：绿叶中色素的提取和分离
基础知识
（三） 凝胶色谱法
阅读并回答
（P64）
1、凝胶色谱法分离蛋白质的依据；
2、凝胶的实质；
3、凝胶色谱法的原理。
（三）凝胶色谱法P64
1.分离依据：
不同蛋白质的相对分子质量不同
2.凝胶的结构：
微小的多孔球体，内部有许多贯穿的通道； 具多孔的凝胶就叫“分子筛”
3.凝胶的化学组成：
多糖类化合物，如葡聚糖或琼脂糖
（五）电泳P65--66 1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2.原理：
①多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团会带上正电或负电。②在电场作用下， 带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
待分离 带电性质的差异 各种带电分子产生不 样品 大小、形状的不同 同的迁移速度而分离
透析袋
（三）血红蛋白的纯化-凝胶色谱操作 1.凝胶色谱柱的制作 2.凝胶色谱柱的装填 3.样品的加入和洗脱
5.3血红蛋白的提取和分离
分离胶：小孔胶，阻力大。从而分离样品中各物质
电泳缓冲液
如何让蛋白质在聚丙烯酰胺中的电泳迁移率只取决于分子量大小？
SDS
1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系 统中加入SDS，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决 于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。
四、 SDS-聚丙烯酰胺（垂直板）凝胶电泳法
（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：
结果分析: • 测定的只是单个亚基或肽链的相对分子质量，而不是完整分子的
相对分子质量；
• 要测定蛋白质真正的相对分子质量，应与其他测定蛋白质相对分 子质量的方法加以校正。
五、 凝胶电泳法
常见种类：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。
分类 琼脂糖 凝胶电 泳
SDS-聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳
红细胞洗涤 离心+洗涤：去血浆蛋白等杂蛋白 血红蛋白释放 吸水涨破释放血红蛋白
分离血红蛋白溶液 离心分离血红蛋白与其他杂质
粗分离：透析 除去相对分子质量较小的杂质+更换样品缓冲液
凝胶色谱操作
凝胶色谱柱的制作 凝胶色谱柱的装填
样品的加入与洗脱
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 鉴定蛋白质纯度
三、提取分离血红蛋白的实验操作
镰刀型红细胞贫血症（血红蛋白分子结构异常）
一、凝胶色谱法
发现历史： ·1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。 ·他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以
不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为 “色谱法”。
一、凝胶色谱法
1.凝胶：由多糖类化合物构成的多孔载体。 孔:贯穿凝胶的通道。 2.色谱法（层析法）
总结思：
1、凝胶色谱法原理？ 2、缓冲溶液作用？ 3、电泳原理？
电泳缓冲液
如何让蛋白质在聚丙烯酰胺中的电泳迁移率只取决于分子量大小？
SDS
1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系 统中加入SDS，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决 于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。
四、 SDS-聚丙烯酰胺（垂直板）凝胶电泳法
（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：
结果分析: • 测定的只是单个亚基或肽链的相对分子质量，而不是完整分子的
相对分子质量；
• 要测定蛋白质真正的相对分子质量，应与其他测定蛋白质相对分 子质量的方法加以校正。
五、 凝胶电泳法
常见种类：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。
分类 琼脂糖 凝胶电 泳
SDS-聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳
红细胞洗涤 离心+洗涤：去血浆蛋白等杂蛋白 血红蛋白释放 吸水涨破释放血红蛋白
分离血红蛋白溶液 离心分离血红蛋白与其他杂质
粗分离：透析 除去相对分子质量较小的杂质+更换样品缓冲液
凝胶色谱操作
凝胶色谱柱的制作 凝胶色谱柱的装填
样品的加入与洗脱
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 鉴定蛋白质纯度
三、提取分离血红蛋白的实验操作
镰刀型红细胞贫血症（血红蛋白分子结构异常）
一、凝胶色谱法
发现历史： ·1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。 ·他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以
不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为 “色谱法”。
一、凝胶色谱法
1.凝胶：由多糖类化合物构成的多孔载体。 孔:贯穿凝胶的通道。 2.色谱法（层析法）
总结思：
1、凝胶色谱法原理？ 2、缓冲溶液作用？ 3、电泳原理？
血红蛋白的提取与分离
血红蛋白的提取与分离血红蛋白是一种蛋白质，在红细胞中起着重要的运输氧气的作用。
血红蛋白结构复杂，可通过一系列的步骤进行提取和分离。
这篇文章将介绍血红蛋白的提取和分离过程。
1. 血红蛋白的提取血红蛋白的提取过程包括以下步骤：1.1 血液采集首先需要从供血者身体中采集血液。
在采集血液时需要使用无菌器材严格遵守卫生规范。
血液可以采用多种方式进行采集，如静脉采血或分离血浆和细胞等。
1.2 红细胞的分离红细胞是血液中含有血红蛋白的细胞，因此需要将其与其他细胞分离。
在现代分离技术中，离心、红细胞沉降法和滤纸法等都常用来分离红细胞。
1.3 血红蛋白的裂解在裂解血红蛋白之前，需要将红细胞中的膜蛋白和其他组分去除。
这个步骤可以通过再次采用离心、收集上清液的方式实现。
在获得裂解所需的含血红蛋白物质后，可以按照裂解液的pH值或添加特殊的裂解试剂来进行裂解。
1.4 血红蛋白的提取经过裂解后的血红蛋白可用于纯化和分离。
可以通过离心分离、色谱分离、电泳分离等方法来提取和分离血红蛋白。
2. 血红蛋白的分离对血红蛋白的分离过程包括以下步骤：2.1 血红蛋白的纯化纯化是分离血红蛋白的关键步骤，其目的是去除其他干扰因素，纯化血红蛋白。
可采用离心、柱层析、凝胶过滤等技术来实现血红蛋白的纯化。
2.2 血红蛋白的检测将提取和纯化得到的血红蛋白进行检测，以确保获得的血红蛋白的纯度。
检测过程中可以采用紫外吸收光谱法、电泳法等方法进行检测。
3.血红蛋白的提取和分离是一项关键的技术，在医疗和科研领域得到了广泛的应用。
这些步骤通常需要复杂的实验流程和严谨的实验技术，因此需要实验人员在实验过程中严格遵守相关的操作规范和安全注意事项，以确保实验的准确性和安全性。
专题5课题3血红蛋白的提取与分离PPT课件
(三)电泳
1、概念：带电粒子在 电场 的作用下发生迁移的过程。 2、原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸 等 都具有 可解离的基团 ， 在 一定的PH 下，这些 基团会带上正电或负电 。在电场的作用下，这些带 电分子会向着与其 所带电荷相反的电极移动。电泳利 用了待分离样品中各种分子 带电性质的差异 以及分 子本身 大小 、 形状 的不同使带电分子产生不同 的 迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。
③缓冲溶液的组成和作用机理
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：
①样品的处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题： 1、含量
占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物
2、组成元素 C、H、O、N (大多数含S) 3、相对分子质量 高分子化合物
实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤
样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（二）操作过程
1.样品处理：
可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血 液来分离血红蛋白。
1、人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取； 猪牛羊（哺乳动物）成熟的红细胞无细胞核，血红蛋白含 量丰富便于提取血红蛋白。
9 、蛋白质的鉴定方法 10、生理功能
细胞和生物体的结构物质，是一切生命活动的主要承担者。
基础知识
问：依据什么来分离和提取蛋白质 根据蛋白质各种特性的差异，
如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和 吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不 同蛋白质。
基础知识 （一） 凝胶色谱法
3、分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。 测定蛋白质相对分子质量通常用十二烷基硫酸钠 （SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳
血红蛋白的分离和提取
顶端，不要破坏凝胶面
答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便 于进行DNA的提取，哺乳类动物成熟的红细胞 无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便 于提取血红蛋白。
一、基础知识：
（一）蛋白质分离原理
（二）蛋白质分离的方法
1）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法
（三）缓冲液的作用
二、实验操作－－实验步骤 注意事项
血液组成成分
5、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不
同蛋白质的电泳迁移率完全取决于
A 电荷的多少
B 分子的大小
C 肽链的多少
D 分子形状的差异
6.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作， 其中正确的是（ A ）
• A．可采集猪血作为实验材料 B．用蒸馏水重复洗涤红细胞
• C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液
2）影响蛋白质分子运动速度的因素
3）常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳，使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同 时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利 用相关计算公式算出相对分子量
SDS 带负电荷多的 ，因而掩盖了不同种蛋白质 间的电荷的差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子 大小。
8.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原 因是
A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序，降低分离效果
B、气泡阻碍蛋白质的运动 C、气泡与蛋白质发生化学反应 D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
9.样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A、加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝
胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B、加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C、等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D、用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的
答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便 于进行DNA的提取，哺乳类动物成熟的红细胞 无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便 于提取血红蛋白。
一、基础知识：
（一）蛋白质分离原理
（二）蛋白质分离的方法
1）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法
（三）缓冲液的作用
二、实验操作－－实验步骤 注意事项
血液组成成分
5、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不
同蛋白质的电泳迁移率完全取决于
A 电荷的多少
B 分子的大小
C 肽链的多少
D 分子形状的差异
6.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作， 其中正确的是（ A ）
• A．可采集猪血作为实验材料 B．用蒸馏水重复洗涤红细胞
• C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液
2）影响蛋白质分子运动速度的因素
3）常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳，使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同 时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利 用相关计算公式算出相对分子量
SDS 带负电荷多的 ，因而掩盖了不同种蛋白质 间的电荷的差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子 大小。
8.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原 因是
A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱 次序，降低分离效果
B、气泡阻碍蛋白质的运动 C、气泡与蛋白质发生化学反应 D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
9.样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A、加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝
胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B、加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C、等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D、用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的
5.3血红蛋白的提取和分离
凝胶色谱法
㈡ 缓冲溶液： 1、概念：在一定的范围内，能对抗外 来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液 PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具 有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
2、作用： 能够抵制（ 外界的酸或碱 ）的对溶液 的（ PH值 ）的影响，维持PH基本不变。
3、缓冲溶液的配制 通常由（ 1－2 ）种缓冲剂溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的（ 使用比例 ） 就可以制得（ 在不同PH范围内 ）使用的 缓冲液。 思考：说出人体血液中缓冲对。
3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相 对（相对分子质量较小 ）的蛋白质容易进入 凝胶内部的通道，路程（ 较长 ），移动速 度（ 较慢 ），而（ 相对分子质量较大） 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能 凝胶外部 ）移动，路程（较短 ）， 在（ 移动速度（ 较快 ），相对分子质量不同 的蛋白质因此得以分离。 ▲依据的特性是：蛋白质分子量的大小。 4、具体过程
电泳检测PCR结果
琼脂糖凝胶电泳
二、实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋 白释放；离心等操作收集到的血红蛋白 溶液。 （2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大 的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 鉴定。
说明：
聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有 较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大 得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶 电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根， 核酸带负电荷，在电场中向正极移动。 溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线 的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光 条带的粗细和分布的位置，可以用在对 PCR扩增效果的鉴定上。
CO
NH
脱水缩合 肽链 （n条） 盘曲折叠
血红蛋白的提取和分离
本课题学习要点和难点
体验从复杂体系中提取生物大分子旳基本过 程和措施，并了解色谱法、电泳法等分离生 物大分子旳基本原理。
3、课题要点：凝胶色谱法旳原理和措施 4、课题难点：
①样品旳预处理 ②色谱柱填料旳处理和色谱柱旳装填。
2023年4月14日宣告人类基因组序列图完毕，这标志着进入了后基因组和蛋 白质组时代
2、你装填旳凝胶色谱柱是否有气泡产生？你旳色谱 柱装填得成功吗？你是怎样判断旳？
因为凝胶是一种半透明旳介质，所以能够在凝胶柱旁放一支与 凝胶柱垂直旳日光灯，检验凝胶是否装填得均匀。另外，还能够 加入大分子旳有色物质，例如蓝色葡聚糖—2023或红色葡聚糖， 观察色带移动旳情况。假如色带均匀、狭窄、平整，阐明凝胶色 谱柱旳性能良好。假如色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体 以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
血红蛋白的提取和分 离
本课题学习目的
体验从复杂体系中提取生物大分子旳基本过 程和措施，并了解色谱法、电泳法等分离生 物大分子旳基本原理。
1、主要概念：①凝胶色谱法 ②电泳法 ③缓冲溶液 ④ 它们在血红蛋白旳提取中分别起到什么作用。
2. 主要原理：
①凝胶色谱法分离蛋白质旳原理
②电泳法分离样品旳原理
③缓冲溶液旳构成和作用机理
④洗脱：小心加入pH=7.0 旳20mmol/l旳磷酸缓冲液到合 适高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
⑤搜集：待红色旳蛋白质接近色谱柱底端时，用试管搜集流 出液，每5ml搜集一试管，连续搜集。（在分离过程中，假如 红色区带均匀一致旳移动，阐明色谱柱制作成功）
⑥注意：正确旳加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、 贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁围绕移动。
装配好旳凝胶柱
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。
在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液
，露出凝胶颗粒的现象。一旦
发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
5. 蛋白质的分离 在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。
如果红色区带
地移动，说明色谱柱制作成功。
为你听写
1. 蛋白质分离和提取的原理是什么？ 2. 什么是凝胶色谱法？ 3. 凝胶色谱法的原理是什么？ 4. 缓冲溶液的作用是什么？ 5. 缓冲溶液通常如何配制？ 6. 缓冲溶液的正确配制在生物化学实验中有什么意义？ 7. 什么是电泳？ 8. 电泳的原理是什么？ 9. 在凝胶中加入 SDS 对蛋白质分子的电泳有何作用？ 10. 分离血红蛋白应选取什么材料？为什么？ 11. 写出血红蛋白的结构组成。 12. 采集血样后，如何分离红细胞？ 13. 洗涤红细胞的目的和方法是什么？ 14. 血红蛋白释放的方法是什么？ 15. 如何从混合液中分离血红蛋白溶液？
课题3 血红蛋白的提取和分离
一基 础 知 识
第一次默写—基础知识
1. 凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据
分离蛋白质的有效方法。
相对分子质量小的移动速度慢；相对分子质量大的蛋白质无法进入
，
移动速度
。
2.缓冲溶液能够抵制外界的
对溶液PH的影响，维持pH基本不变。
3.电泳是指带电粒子在
的作用下发生迁移的过程。电泳利用了待分离样品中
去
；
3. 色谱柱填料的处理 商品凝胶使干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中膨胀。为
了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用
加热，逐渐升温至接近沸腾，
通常只需1—2h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的
，
排除胶粒内的空气。
4. 凝胶色谱柱的装填 在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量
，以降低
凝胶颗粒之间的空隙。在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会
为你听写
16. 透析袋具有怎样的特点？ 17. 透析的目的是什么？ 18. 凝胶色谱法的目的是什么？ 19. 如何加速凝胶颗粒的膨胀？ 20. 装填凝胶色谱柱时，有哪些注意事项？ 21. 如何判断色谱柱装填是否成功？ 22. 凝胶色谱柱加样时，需要注意什么？ 23. 用凝胶色谱法分离血红蛋白时，何时收集流出液？ 24. 用凝胶色谱法分离血红蛋白时，红色区带应该如何移动？ 25. 常用的鉴定蛋白质纯度的方法是什么？ 26. 在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？ 27. 与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对进行血红蛋白 的分离有什么意义？
答案
9. SDS作用机理: SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的 电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。SDS能使蛋白质发生完全 变性，由几条肽链组成的蛋白质复合体在 SDS 的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。 10. 哺乳动物的红细胞无细胞核，其组成中除水分外，约90%是血红蛋白，因此便于作为提取血红蛋白的材料。 11. 血红蛋白由四条肽链组成，包括两条 α-肽链和两条 β-肽链，其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可 携带一分子氧或一分子二氧化碳。 12. 分离红细胞：对血样进行低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到 分离的效果），如 500r/min 离心 2min ，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，得到下层暗红色的红细胞液体。 13. 洗涤红细胞的目的：去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。 洗涤方法：加入五倍体积的生理盐水（质量分数为 0.9％ 的氯化钠溶液），缓慢搅拌 10min ，低速短时间离心，如 此重复洗涤三次，直至上清液中不再呈现黄色，表明洗涤干净。 14. 血红蛋白的释放：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液体积，再加 40％ 体积的甲苯，置于磁力搅 拌器上充分搅拌 10 分钟（加速细胞破裂），细胞破裂释放出血红蛋白。 15. 分离血红蛋白溶液： ①过程：将搅拌好的混合液转移到离心管中，以 2000r/min 的速度离心 10min 。 ②试管中溶液分为 4 层： 第1层（最上层）：有机溶剂甲苯层（无色透明）； 第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层）； 第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明)； 第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。 ③分离：先用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层。于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 16. 透析袋一般是用玻璃纸（半透膜）制成，能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
答案
17. 透析目的：除去样品中分子量较小的杂质（血红蛋白的粗分离）。 18. 凝胶色谱法目的：将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，实现血红蛋白的纯化。 19. 可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需 1~2h 。 优点：不但节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。 20. ①将色谱柱垂直装置固定在支架上。 ②将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。 ③凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 ④装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ⑤装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在约 50cm 高的操作压下，用 300mL 的 20mmol/L 的磷酸缓冲液（ pH 为 7.0 ）充分洗涤平衡 12 小时，使凝胶装填紧密。 21. ①由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得 均匀。 ②可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝 胶色谱柱的性能良好。 ③如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 22. 滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要触及并破坏凝胶面。 23. 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每 5mL收集一试管，连续收集。 24. 血红蛋白的红色区带应该狭窄、平整，随着洗脱液缓慢、均匀一致地移动。 25. 常用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质纯度的鉴定。 26. 让血红蛋白处在稳定的 pH 范围内，维持结构和功能正常。 27. 血红蛋白是有色蛋白（含有血红素），因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗 脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
各分子
的差异以及分子本身的大小、
的不同，使带电分子产生
不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
3、两种常用的电泳方法是
和
，在测定蛋
白质分子量时DS的作用是
.
三操 作 提 示
第二次默写-
1、蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、
、
、
。
2. 红细胞的洗涤 洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除
答案
1. 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和 对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 2. 凝胶色谱法是利用具有网状结构的凝胶，分离不同相对分子质量大小的蛋白质的方法。 3. 当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路 程较长，移动速度较慢;而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动， 路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 4. 缓冲溶液具有缓冲作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液 pH 值的影响，维 持 pH 基本不变。 5. 缓冲溶液通常由 1~2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同 pH 范围内使用的缓冲液。 6. 生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的 pH 下进行的，通过正确配制的缓冲溶液，能够在 实验室条件下保证体外溶液的 pH 与体内环境中的 pH 基本一致，准确模拟生物体内的过程。 7. 电泳是带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 8. 电泳的原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的 pH 下，这些基团会带上正 电或负电。 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子 产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。