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一、蛋白质提取、分离（阅读教材P64～66）1．蛋白质分离的理论依据2．凝胶色谱法(分配色谱法)(1)概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
(2)分离原理相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
3．缓冲溶液(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内的缓冲液。
4．电泳(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
(2)原理①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
二、血红蛋白的提取和分离（阅读教材P66～70）1．样品处理(1)红细胞的洗涤①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。
②过程：分离(低速短时间离心)→用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆→下层暗红色的红细胞用生理盐水洗涤(如此重复三次)。
(2)血红蛋白的释放①目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。
②过程(3)分离血红蛋白溶液：离心(以2 000 r/min速度，离心10 min)→观察到离心管中的溶液分为4层，从上往下依次为：第1层：无色透明的甲苯层。
第2层：脂溶性物质的沉淀层——白色薄层固体。
第3层：血红蛋白的水溶液——红色透明液体。
第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。
将液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
2．透析——粗分离过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol·L －1的磷酸缓冲液中(pH＝7.0)，透析12 h。
专题课题5.3 5 DNA 与蛋白质技术血红蛋白的提取和分离一、【课题目标】（一）知识与技能1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理（二）过程与方法体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤（三）情感、态度与价值观初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神二、【课题重点】凝胶色谱法的原理和方法三、【课题难点】样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填四、【教学方法】启发式教学五、【教学工具】多媒体课件六、【教学过程】（一）引入新课蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化和物。
对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。
所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。
怎样提取蛋白质呢？（二）进行新课1．基础知识蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
1．1 凝胶色谱法（分配色谱法）：（1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
（3）分离过程：（图5－13b）混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
1．2 缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2C O3－NaHC O3，HC－NaC，NaH2PO4/N a2HP O4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH 的缓冲液。
（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保pH 稳定。
持1．3 凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
［思考］阅读教材后，填写下表：决定运动方向形成库仑力形成阻力决定运动速率电荷性质√电荷量√√分子形状√√分子大小√√（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。
专题5课题3 血红蛋白的提取和分离一、基础知识（一）凝胶色谱法1、凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。
2、凝胶实际上是一些微小的球体，这些小球体大多数是由构成的，如葡聚糖或琼脂糖。
3、在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
（二）缓冲溶液1、缓冲溶液的作用是。
2、缓冲溶液通常由溶解于水中配制而成的。
3、生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了，必须保持体外的pH与体内的。
（三）电泳1、电泳是指。
2、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。
电泳利用了待分离样品中各分子的差异以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。
3、两种常用的电泳方法是和，在凝胶中加入SDS，电泳速率完全取决于，因此，在测定蛋白质分子量时通常使用。
二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：、、和。
（一）样品处理1、红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是，采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用离心（500r/min），然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层暗红色的倒入烧杯，再加入（质量分数为），缓慢搅拌 min，离心，如此重复洗涤三次，直至，表明红细胞已洗涤干净。
2、血红蛋白的释放：在和作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
3、分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心（2000r/min）后，试管中的溶液分为4层。
第一层为无色透明的，第2层为白色薄层固体，是，第3层是红色透明液体，这是，第4层是的暗红色沉淀物。
将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的。
《血红蛋白的提取和分离》作业设计方案（第一课时）一、作业目标1. 掌握血红蛋白的基本性质与功能。
2. 理解血红蛋白提取和分离的实验原理及操作步骤。
3. 培养实验操作能力和观察能力，提升生物实验素养。
4. 学会团队协作，增强团队合作意识。
二、作业内容1. 理论学习：学生需预习《血红蛋白的提取和分离》相关理论知识，包括血红蛋白的结构、性质、功能及其在生物体内的作用等。
2. 实验准备：学习并理解实验操作步骤，包括实验器材的准备、样品的处理、离心机的使用等。
3. 实验操作：在教师的指导下，学生需亲自操作实验，包括样品的破碎、离心分离、透析等步骤，并记录实验过程中的关键数据和现象。
4. 数据分析：学生需根据实验数据，分析血红蛋白的提取和分离效果，并尝试解释实验结果。
5. 报告撰写：学生需撰写实验报告，包括实验目的、原理、步骤、数据分析和结论等部分，并附上实验过程中的关键照片或视频。
三、作业要求1. 学生需认真预习相关理论知识，并做好笔记。
2. 实验操作过程中，要严格遵守实验室规则，注意安全。
3. 记录实验数据要准确、清晰，不得随意涂改。
4. 实验报告要按照规定的格式和要求撰写，内容要完整、条理清晰。
5. 团队成员需协作完成实验，并相互帮助解决实验中遇到的问题。
四、作业评价1. 教师将根据学生的理论学习情况、实验操作过程、数据分析及报告撰写等方面进行评价。
2. 评价标准包括理论知识的掌握程度、实验操作的规范性、数据的准确性和报告的完整性等。
3. 对于表现优秀的学生，教师将给予表扬和鼓励；对于存在问题的学生，教师将给予指导和帮助。
五、作业反馈1. 教师将在课堂上对作业进行点评，指出学生存在的不足和需要改进的地方。
2. 学生需根据教师的反馈，对作业进行修改和完善。
3. 对于共性问题，教师将在课堂上进行集中讲解和指导。
4. 教师将根据学生的作业情况，调整后续的教学计划和教学方法。
通过以上作业设计旨在通过预习、实验、分析、撰写等环节，帮助学生全面理解和掌握血红蛋白的提取和分离的原理和操作步骤，提高其实验操作能力和生物实验素养，并增强团队协作能力。
专题5课题3 血红蛋白的提取和分离
一、基础知识
（一）凝胶色谱法
1、凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。
2、凝胶实际上是一些微小的球体，这些小球体大多数是由构成的，如葡聚糖或琼脂糖。
3、在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
（二）缓冲溶液
1、缓冲溶液的作用是。
2、缓冲溶液通常由溶解于水中配制而成的。
3、生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了
，必须保持体外的pH与体内的。
（三）电泳
1、电泳是指。
2、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。
电泳利用了待分离样品中各分子的差异以及分子本身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。
3、两种常用的电泳方法是和，在凝胶中加入SDS，电泳速率完全取决于
，因此，在测定蛋白质分子量时通常使用。
二、实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步：、、和。
（一）样品处理
1、红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是，采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用离心（500r/min），然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层暗红色的
倒入烧杯，再加入（质量分数为），缓慢搅拌 min，离心，如此重复洗涤三次，直至，表明红细胞已洗涤干净。
2、血红蛋白的释放：在和作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
3、分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心（2000r/min）后，试管中的溶液分为4层。
第一层为无色透明的，第2层为白色薄层固体，是，第3层是红色透明液体，这是
，第4层是的暗红色沉淀物。
将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的。
（二）粗分离：透析
取1mL的血红蛋白溶液装入中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的
（PH7.0）中，透析12h。
透析可以去除样品中的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
（三）纯化：凝胶色谱操作
1、制作凝胶色谱柱
2、装填凝胶色谱柱
①装填前将色谱柱固定在支架上。
因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。
②装填时凝胶要缓慢倒入色谱柱内，装填时要轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填，色谱柱内不得有存在，一旦发现，必须重装。
③装填完后，连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300mL物质的量浓度为20mmol/L的（PH7.0）充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶。
3、样品的加入和洗脱
①准备：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的的缓冲液与凝胶面，关闭出口。
②加样：用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意。
加样后打开下端出口，直到样品后，关闭下端出口。
③洗脱：小心加入物质的量的浓度为20mmol/L的（PH7.0）到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。
待接近色谱柱时，用试管收集。
（四）纯度鉴定：
三、操作提示
1、红细胞的洗涤洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。
洗涤次数过少，无法除去；离心速度过高和时间过长会使一同沉淀，达不到分离的效果。
2、色谱柱填料的处理商品凝胶使干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中膨胀。
为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需1—2h。
这种方法不但，而且可以除去凝胶中可能带有的，排除胶粒内的。
3、凝胶色谱柱的装填在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量，以降低凝胶颗粒之间的空隙。
在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。
气泡会，降低。
在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液，露出凝胶颗粒的现象。
一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
4、蛋白质的分离在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。
如果红色区带
地移动，说明色谱柱制作成功。
【教材答案】
（一）旁栏思考题
你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？
答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。
相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。
因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。
如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，，影响分离的效果。
（二）练习
1．答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。
所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。
相对分子质量的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程，移动速度；相对分子质量的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程，移动速度。
因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。
2．答：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。
缓冲溶液通常是由1～2缓冲剂溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。
缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。
在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。
为了在实验室条件
下，就必须。
3．答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极方向移动。
电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电以及分子本
身、等性质的差异，使带电分子产生的迁移速度，从而达到对样品进行、或的目的。
4．答：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步,包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
●首先通过、、等操作收集到血红蛋白溶液，
即样品的处理；
●再经过去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；
●然后通过将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；
●最后经进行纯度鉴定。
5．答：血红蛋白是蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。
这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
