2019-2019高中生物专题5课题3血红蛋白的提取和分离.ppt.pptx

2020/6/21
电泳
概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
分类： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳
样品处理及粗分离
1.血液由血浆和各种血细胞构成。 2.血红蛋白包含四条肽链。 3.本实验所用材料：哺乳动物的红细胞。 4.采集血液时加入柠檬酸钠。
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一：红细胞的洗涤一
1.目的：去除杂蛋白 2.方法：低速短时间离心 3.洗涤时加入试剂：5倍体积的生理盐水
血红蛋白提取的过程
教学难点
血红蛋白提取的原理
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分离蛋白质的原理
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形 状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、 吸附的性质、对其他分子的亲和力等等，可以
用来分离不同蛋白质。
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凝胶色谱法
凝胶是一些多糖类构成的内含许多贯穿的 通道的微小多孔的球体。
第三节 血红蛋白的提取和分离
教学目标
知识目标
1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白 2、了解色谱法、电泳法等分血红蛋白提取和分离的实验的严格要求， 注意按照操作提示进行相关步骤
。
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教学重难点
情感目标
初步形成科学的思维方式，发展科学素养和 人文精神
教学重点
凝胶色谱法原理
相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内 部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短， 移动速度较快。
相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内 部的通道，在凝胶的外部移动，路程较长，移 动速度较慢。
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缓冲溶液
指在一定的范围内，能对抗外来少量 强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显 变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶 液叫做缓冲溶液。

栏 目 链 接
栏 目 链 接
一、血红蛋白的提取和分离的原理
1．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析
相对分子质量大 相对分子质量小
直径大小
大于凝胶颗粒空隙 小于凝胶颗粒空隙
直径
直径
栏 目 链
接
运动方式 垂直向下运动 无规则的扩散运动
运动速度 运动路程
洗脱顺序
较快
较短
先从凝胶柱中洗脱 出来
较慢
较长
后从凝胶柱中洗脱 出来
(3) 电 泳 利 用 了 待 分 离 样 品带电中性各质的种差分异子栏 _______________大_以小及分子形本状身的 ________、________目链 的不同，迁使移带速电度分子产生不同的 __________，从而实现 接 样品中各种分子的分离。
四、蛋白质的提取和分离过程
蛋白质的提取和分离一般分为四步样：品_处__理_____、 粗分离纯、化________和纯度鉴定。
床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径
较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较
栏
多的凝胶颗粒内，
目
链
〉
接
韧ü 床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用
分子筛可将分子量不同的物质分离。分子量大小不同
的多种成分在通过凝胶床时，按照分子量大小 “排
队”，凝胶表现出分子筛效应。
答案：D
二、血红蛋白的提取和分离的实验操作
2.电泳原理及方法
电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过
程。许多重要的分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核
苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的
pH中会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电
栏 目

②底塞的制作：选择适合封堵玻璃管口的橡皮塞→打 孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用 100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。
注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的
凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋
白质分离不彻底。
③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 ④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。
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2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白
质的叙述，正确的是
A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质
量较大的蛋白质
B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质
量较大的蛋白质
C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质
量较大的蛋白质
D 二者根本无法比较
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有机溶剂 无色透明的甲苯层 脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液 红色透明液体
红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物
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4、透析（粗提取）： 去除小分子的杂质
取1ML血红蛋白溶液装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH 为7.0）透析12小时。
1mL
1mL
20mmol/L磷酸缓冲液
透析袋：小分子自由通过，而大
保证血红蛋白的正常结构和功能， 便于观察(红色)和科学研究(活性)
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(三)电泳
1.电泳的概念 指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.
2 .原理：
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离 的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 相反的电极移动。

二、血红蛋白的提取和分离的实验操作
1．样品处理 (1)红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。采用低速短时间离心， 吸出上层透明的黄色血浆，再加入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次， 直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数过少，无法去 除血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀， 达不到分离的效果。 (2)血红蛋白的释放：红细胞在蒸馏水和甲苯的作用下破裂，释放出血红蛋 白。
③ 根据老师的提示抓住老师的思路。老师在教学中经常有一些提示用语，如“请注意”、“我再重复一遍”、“这个问题的关键是····”等等，这些 用语往往体现了老师的思路。来自：学习方法网
④ 紧跟老师的推导过程抓住老师的思路。老师在课堂上讲解某一结论时，一般有一个推导过程，如数学问题的来龙去脉、物理概念的抽象归纳、语 文课的分析等。感悟和理解推导过程是一个投入思维、感悟方法的过程，这有助于理解记忆结论，也有助于提高分析问题和运用知识的能力。
(3)分离血红蛋白溶液：将混合液进行离心后，会明显看到试管中的溶液的分层情 况：第3层的红色透明液体是血红蛋白的水溶液。 (4)透析：目的是除去样品中的相对分子质量较小的杂质。 2．凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的装填： ①装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。 ②凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发现存在气泡，必须重装。
例2 －聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用是( ) A．增大蛋白质的相对分子质量 B．改变蛋白质分子的形状 C．掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别 D．减少蛋白质分子的相对分子质量
解析：SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和 分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二、三级结构。在样品 和凝胶中加入还原剂SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链 和SDS结合成蛋白－SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质 分子原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异，使电泳迁移率 完全取决于分子的大小。 答案：C

4、 本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？
在本课题中使用的缓冲液是:_磷__酸__缓___冲__液,其 目的是: 利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，
保证血红蛋白的正常结构和功能， 便于观察(红色)和科学研究(活性)
(三)电泳
1.电泳的概念 指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.
2 .原理：
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离 的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。
一、基础知识--蛋白质提取和分离原理 蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学
性质：
形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、 亲和力等千差万别。
提取 分离 方法
凝胶色谱法 凝胶电泳法
(一)凝胶色谱法（分配色谱法）：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法
1、原理： 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；
过滤
烧杯
离心管
分离血红蛋白溶液
有机溶剂 无色透明的甲苯层 脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液 红色透明液体 红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物
4、透析（粗提取）： 装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。
1mL
1mL 20mmol/L磷酸缓冲液
利用透析袋透析
透析过程
（二）纯化－－凝胶色谱操作 1.凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填： 3.样品的加入和洗脱
1、红细胞的洗涤：
（1）步骤： 血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水 →缓慢 搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色
（2）目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固
柜式离心机
初次离心后的结果

测定时,通常采用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法,用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中,关于蛋白质的叙述,
正确的是( ) A
A．相对分子质量较小的蛋白质路程大于相对分子质量较大的蛋白质
课题3 血红蛋白的提取和分离
刷基础
B．相对分子质量较小的蛋白质路程小于相对分子质量较大的蛋白质 C．相对分子质量较小的蛋白质路程等于相对分子质量较大的蛋白质 D．二者根本无法比较
课题3 血红蛋白的提取和分离
刷基础
5．[福建厦门双十中学2019高二下月考]在蛋白质的提取和分离实验中,下列关于对样品处理过程的分析,不正 确的是( ) B A．用生理盐水洗涤红细胞,目的是去除杂蛋白 B．洗涤红细胞和分离血红蛋白都要离心,离心速度可相同 C．血红蛋白的释放要加蒸馏水和甲苯 D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质
解析
在一定范围内,缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变,A错误；缓冲溶 液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成,B正确；调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH 范围内使用的缓冲液,C正确；在利用凝胶电泳法分离蛋白质时,需要加入缓冲溶液,可以维持蛋白质 所带电荷不发生改变,D正确.
解析
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于分子的大小和所带净电荷等因素,A错误；由于在凝 胶中加入带负电荷较多的SDS,与蛋白质形成“蛋白质－SDS复合物”,蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺 凝胶电泳中的迁移率完全取决于分子的大小,B正确；SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于蛋白质混 合组分分离的原理是不同蛋白质的相对分子质量不同,因此SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于蛋 白质相对分子质量的测定, C正确；凝胶中加入负电荷较多的SDS可以消除净电荷对迁移率的影响, 使蛋白质迁移率仅取决于分子大小,D正确.

(三)电泳
1、概念：带电粒子在 电场 的作用下发生迁移的过程。 2、原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸 等 都具有 可解离的基团 ， 在 一定的PH 下，这些 基团会带上正电或负电 。在电场的作用下，这些带 电分子会向着与其 所带电荷相反的电极移动。电泳利 用了待分离样品中各种分子 带电性质的差异 以及分 子本身 大小 、 形状 的不同使带电分子产生不同 的 迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。
③缓冲溶液的组成和作用机理
3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：
①样品的处理 ②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题： 1、含量
占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物
2、组成元素 C、H、O、N (大多数含S) 3、相对分子质量 高分子化合物
实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤
样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定
（二）操作过程
1.样品处理：
可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血 液来分离血红蛋白。
1、人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？
鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取； 猪牛羊（哺乳动物）成熟的红细胞无细胞核，血红蛋白含 量丰富便于提取血红蛋白。
9 、蛋白质的鉴定方法 10、生理功能
细胞和生物体的结构物质，是一切生命活动的主要承担者。
基础知识
问：依据什么来分离和提取蛋白质 根据蛋白质各种特性的差异，
如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和 吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不 同蛋白质。
基础知识 （一） 凝胶色谱法
3、分类：琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。 测定蛋白质相对分子质量通常用十二烷基硫酸钠 （SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳