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一、实验目的1. 掌握双缩脲试剂法测定血清总蛋白的原理和方法；2. 熟悉实验操作步骤，提高实验技能；3. 了解血清总蛋白的临床意义及检测方法。
二、实验原理血清总蛋白（Total Protein，TP）是指血液中所有蛋白质的总和，包括白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原等。
双缩脲试剂法是一种常用的蛋白质定量分析方法，其原理是蛋白质分子中的肽键在碱性溶液中能与铜离子发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。
该络合物在540nm处的吸光度与蛋白质含量在一定范围内呈线性关系，通过测定吸光度可计算出蛋白质含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）血清样本：采集患者空腹静脉血，分离血清；（2）双缩脲试剂：硫酸铜、酒石酸钾钠、碘化钾；（3）NaOH溶液：6.0mol/L；（4）蛋白质标准液：60～70g/L；（5）试管、移液器、分光光度计等。
2. 仪器：（1）分光光度计；（2）恒温水浴锅；（3）移液器；（4）试管架。
四、实验步骤1. 标准曲线的绘制：（1）取6支试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL蛋白质标准液；（2）向各试管中加入6.0mol/L NaOH溶液1.5mL；（3）向各试管中加入双缩脲试剂A液1.0mL；（4）混匀，室温放置10分钟；（5）向各试管中加入双缩脲试剂B液4.0mL；（6）混匀，室温放置10分钟；（7）以空白管调零，在540nm波长下测定吸光度；（8）以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 血清总蛋白的测定：（1）取血清样本0.5mL，按照步骤1的操作进行测定；（2）以标准曲线为依据，计算血清总蛋白含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：根据实验数据绘制标准曲线，计算线性回归方程。
2. 血清总蛋白测定：根据标准曲线，计算血清总蛋白含量。
3. 结果分析：（1）根据实验结果，与正常参考范围进行比较，判断患者是否患有蛋白质代谢异常；（2）分析血清总蛋白含量变化与疾病的关系，为临床诊断提供依据。
双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价吴文钦（广东医学院医学检验学院广东-东莞 523808）摘要：目的对双缩尿法测定血清总蛋白进行方法性能评价，达到提高分析方法质量的目的。
方法配制双缩脲试剂，并用所配制的双缩脲试剂与标准血清总蛋白进行批内重复性试验、回收试验以及线性范围评价试验，从而评价双缩尿法测定血清总蛋白的精密度、准确度和线性范围。
结果用分光光度计测定波540nm 处的吸光度A，进行相关数据分析，双缩脲法测定血清总蛋白的批内重复性试验的变异系数 CV%为2.36%，回收试验平均回收率为105%，线性范围评价试验R2为0.9980。
结论在严格规范操作下，双缩脲法测定血清总蛋白的精密度高，准确度以及线性范围较好，满足临床对血清总蛋白定量测定要求，是临床测定血清总蛋白的常规方法。
关键词：双缩脲法；血清总蛋白；方法学评价Biuret method was developed for the determination of protein evaluation methodologyAbstract Objective The purpose of the double reduction of urine protein determination of serum total performance evaluation methods, to improve the quality of analytical methods.Methods Biuret test preparation, and formulated with the biuret test standard serum total protein in the assay reproducibility test, recovery test and linear range of evaluation test to evaluate the double reduction of urine assay precision of serum total protein, accuracy and linear range.Results A spectrophotometer absorbance at 540nm wave, the associated data analysis, determination of intra-assay coefficient of variation of total serum protein test reproducibility CV% was 2.36%, the average recovery recovery test 105% biuret method, linear evaluation test range R2 is 0.9980.Conclusion In the strictly regulate the operation, biuret serum total protein, high precision, accuracy and linearity better meet the clinical requirements for quantitative determination of total serum protein, serum total protein conventional methods of clinical measurement.Key words Biuret method; Total serum protein; Evaluation Methodology为满足临床医疗对实验室检验的不断要求，实验室需要不断引进新方法或者改进原有的方法。
血清总蛋白检测方法进展及临床应用评价总蛋白由白蛋白和球蛋白共同组成，是临床生物化学检验的常规项目之一。
掌握血清总蛋白的检测原理、方法、注意事项及结果分析，有助于临床应用，以促进疾病的诊断和鉴别诊断。
笔者结合实际工作和学习体会，现总述如下。
1 血清总蛋白实验检测的常用方法1.1凯氏定氮法。
此法测定化合物或混合物中的总氮量，即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品，将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量。
此法是经典的蛋白质定量方法，目前仍然是建立各个具体方法时采用的参考方法。
1.2双缩脲比色法。
利用血清中蛋白质肽键(-CO-NH-)在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。
此反应和2个尿素分子缩合后生成的双缩脲(H2N-OC-NH-CO-NH2)在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应[1]。
这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。
该法是目前推荐的蛋白质定量首选方法。
1.3染料结合法。
蛋白质可与某些染料特异结合，如氨基黑与考马亮蓝。
这一性质除了可以用于电泳后的蛋白质区带染色，亦可用于总蛋白质的定量。
缺点是多种蛋白质与染料的结合力不一致。
考马亮蓝在与蛋白质结合后的吸收峰从465nm移向595nm，这一性质可用分光光度法来定量检测。
1.4散射比浊法。
用磺柳酸、三氯醋酸等配方对蛋白质进行沉淀反应后进行浊度分析。
此法甚为简便，不需特殊仪器，技术关键在于：①选择最佳试剂浓度及温度；②混匀技术；③选用的标准；④待测标本中的蛋白浓度控制[2]。
1.5采用280nm和215/225紫外吸收值，计算蛋白质含量。
280nm存在吸收峰是由于蛋白质分子中存在芳香族氨基酸所致，方法的特异性和准确性受蛋白分子中该种氨基酸的含量比例影响甚大。
血清蛋白检测结果的分析与评价【摘要】目的：对肾病患者血清蛋白结果进行分析。
方法：对39名肾病患者的血清蛋白结果进行分析，同时对30名健康成人进行同类分析。
结果：总蛋白与白蛋白的含量及比值跟对照组相比有明显的降低，从电泳图谱分析看，α和β的着色率明显高于正常对照组的。
两组比较差异有统计学意义。
结论：应把采集标本方便、灵敏度准确、临床符合率高作为肾脏疾病的实验室组合项目，发挥其本身的应用价值。
【关键词】血清蛋白；检测；肾病；患者肾病又称为肾病综合征(nephritic syndrome)，凡能引起肾小球毛细血管滤过膜损伤的各种疾病，均可发生肾病综合征[1]。
它不是一组独立的疾病，而是在许多疾病过程中损伤了肾小球毛细血管滤过膜的通透性而发生的一个综合症状。
本文为探讨该病在实验室的最佳检测综合指标，对39名患者进行血清蛋白分析和部分脂类的检测分析，同时对30名健康成人进行同类分析，现将结果报告如下：1临床资料与方法1.1一般资料肾病组：39名患者均来自我院肾病内科住院的患者，男性24名，年龄16~76岁，平均46岁；女性15名，年龄13~66岁，平均42岁。
②对照组：来自我院体检中心的健康体检者30名，男性17名，年龄15~75岁，平均44岁；女性13名，年龄13~60岁，平均42岁。
1.2方法抽取清晨空腹血，并及时分离血清。
分别进行血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)测定。
TP采用双缩脲法，ALB采用溴甲酚绿法，试剂为上海德赛有限公司生产的DiaSys生化检测试剂，仪器为日本东芝全自动生化分析仪，室内质控品由英国Randox实验诊断有限公司提供。
血清蛋白电泳采用琼脂糖电泳法，用法国Sebia自动电泳扫描仪检测，由合作检验中心协助检测。
1.3统计学处理：各项检测均采用标准化方法，统计分析全部数据输于计算机用SAS 6.12软件进行统计学处理分析，数值以x±s表示，数据处理采用成组t 检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
血清总蛋白测定的基质效应评价
何美琳;翟静;张捷
【期刊名称】《中国医学创新》
【年(卷),期】2011(008)036
【摘要】目的评价14种室间质量评价(EQA)材料和3种市售材料在4个检测系统上测定血清总蛋白的基质效应.方法参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP14-A2指南,以美国临床化学协会(AACC)推荐血清总蛋白双缩脲为参考方法,以4个检测系统为待评方法,评价制备物的基质效应.结果 9种制备物对各系统均无基质效应,1种制备物对所有系统均存在基质效应,其余样本对不同检测系统存在不同程度的基质效应.结论制备物样本的基质效应可影响血清总蛋白测定的准确性和可比性,在临床检测中应重视其对检验结果量值溯源的影响.
【总页数】4页(P12-15)
【作者】何美琳;翟静;张捷
【作者单位】100049,北京航天中心医院;100049,北京航天中心医院;北京大学第三医院
【正文语种】中文
【相关文献】
1.“双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价”综合性实验的教学实施 [J], 李江滨;蔡梦珊;李育超
2.自建检测系统测定血清总蛋白精密度性能的评价 [J], 吕赛平;刘琴;邹学森
3.血清ALT与AST测定的基质效应评价 [J], 郑松柏;王建兵;黄宪章;马艳;庄俊华;
徐宁;周华友;陈茶
4.两种校准品和3种双缩脲试剂测定血清总蛋白结果偏倚评估及方法学评价 [J], 王时南;杨欢
5.几种双缩脲试剂与校准品用于血清总蛋白结果偏倚测定的评估及方法学评价 [J], 易辉建
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血清总蛋白实验报告血清总蛋白实验报告血清总蛋白是指血液中所有蛋白质的总和，包括白蛋白和球蛋白等多种蛋白质成分。
血清总蛋白的测定可以为临床诊断和疾病监测提供重要的参考依据。
本实验旨在测定血清总蛋白的浓度，并探讨其在健康和疾病状态下的变化。
实验方法：1. 实验材料准备：- 血清样本：从健康志愿者中采集血液样本，离心获得血清。
- 标准品：使用已知浓度的血清总蛋白标准品。
- 试剂：包括染色剂、缓冲液等。
- 仪器：分光光度计、离心机等。
2. 样本处理：- 将采集的血清样本离心，以去除细胞和杂质。
- 取适量血清样本，加入染色剂和缓冲液，混匀后静置一段时间。
3. 光度测定：- 使用分光光度计，设置波长为标定波长。
- 以纯水为零点校准仪器，然后分别测定标准品和样本的吸光度值。
4. 计算浓度：- 根据标准品的吸光度与浓度的线性关系，绘制标准曲线。
- 根据样本的吸光度值，通过标准曲线插值计算出血清总蛋白的浓度。
实验结果：根据实验数据，我们得到了一组血清总蛋白的浓度数据。
通过计算，我们发现血清总蛋白的浓度在正常范围内，符合健康人群的标准。
这表明被检测者在本次实验中没有明显的蛋白质异常。
讨论与分析：血清总蛋白是反映人体蛋白质代谢和营养状况的重要指标。
正常情况下，血清总蛋白的浓度应在一定范围内，过高或过低都可能与某些疾病相关。
高血清总蛋白浓度常见于脱水、感染、炎症等情况下，这是因为在这些情况下，机体会释放更多的蛋白质来应对外界的挑战。
而低血清总蛋白浓度则可能与肝功能不全、营养不良、肾病等疾病有关。
值得注意的是，血清总蛋白的测定结果需要综合考虑患者的临床症状和其他实验指标，才能作出准确的诊断。
因此，在临床应用中，血清总蛋白的测定常与其他指标联合使用，以提高诊断的准确性。
结论：通过本次实验，我们成功测定了血清总蛋白的浓度，并发现被检测者的血清总蛋白浓度处于正常范围内。
血清总蛋白的测定在临床诊断和疾病监测中具有重要意义，可以为医生提供有价值的参考信息。
血清总蛋白测定方法及临床意义测定方法：1.比色法：最常用的方法是用双缩脲法测定血清总蛋白浓度。
该方法是将血清样本与染色剂结合，形成有色复合物后，通过比色法测定其吸光度从而确定血清总蛋白浓度。
常用的染色剂有布里尼尔蓝和卡移液醇。
该方法简便、快速、准确，是常规病理生化检验中常用的方法。
2.免疫测定法：免疫测定法主要是利用免疫反应将血清蛋白与特异性抗体结合，通过测定抗原与抗体结合程度来确定蛋白质的浓度。
免疫测定法可以检测特定的蛋白质或细胞表面的蛋白质，具有高灵敏度和高特异性。
临床意义：1.评估营养状态：血清总蛋白的测定可以用于评估一个人的营养状况，因为营养不良会导致血清总蛋白浓度下降。
营养不良主要指人体长期缺乏蛋白质、能量和其他营养素，如果发现血清总蛋白浓度降低，可以提醒医生进行相关的营养干预措施。
2.诊断肝功能异常：肝脏是合成血浆蛋白的重要器官，如果肝功能受损，可以导致血清总蛋白水平下降。
因此，通过测定血清总蛋白可以初步判断肝功能是否异常，指导临床医生进行进一步的评估和治疗。
3.评估免疫功能：血清蛋白是身体免疫功能的重要组成部分，包括免疫球蛋白等。
通过测定血清总蛋白可以初步评估人体的免疫功能，如果发现血清蛋白浓度降低，可能存在免疫缺陷或免疫系统异常，引起医生的重视。
4.监测疾病治疗效果：一些疾病的治疗可以导致血浆蛋白的变化，通过测定血清总蛋白可以监测疾病的治疗效果。
例如，肿瘤患者接受化疗后，血清总蛋白水平可能会下降，表明治疗效果良好。
5.评估疾病预后：一些疾病的预后与血清蛋白水平相关。
例如，对于癌症患者，血清总蛋白的水平与患者的生存期和预后相关，高水平的血清总蛋白可能提示预后不良。
总结起来，血清总蛋白测定方法简便，通过测定血清总蛋白浓度可以评估一个人的营养状况、肝功能、免疫功能，监测疾病治疗效果，并对疾病的预后进行评估。
因此，血清总蛋白测定在临床中具有重要的意义。
血清总蛋白测定的基质效应评价目的评价14种室间质量评价（EQA）材料和3种市售材料在4个检测系统上测定血清总蛋白的基质效应。
方法参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）EP14-A2指南，以美国临床化学协会（AACC）推荐血清总蛋白双缩脲为参考方法，以4个检测系统为待评方法，评价制备物的基质效应。
结果9种制备物对各系统均无基质效应，1种制备物对所有系统均存在基质效应，其余样本对不同检测系统存在不同程度的基质效应。
结论制备物样本的基质效应可影响血清总蛋白测定的准确性和可比性，在临床检测中应重视其对检验结果量值溯源的影响。
标签：血清总蛋白；双缩脲反应；参考方法；基质效应Evaluation of matrix effect for serum total protein HE Mei-lin*, ZHAI Jing*, ZHANG Jie.*The Space Center Hospital of Beijing, Beijing 100049, China【Abstract】Objective To evaluate the matrix effects of measurement for total protein in serum using 14 materials of external quality assessment(EQA) and 3 commercial reference materials in 4 measurement systems.Methods The matrix effects of 17 processed samples were evaluated by EP14-A2. The biuret method for serum total protein, recommended by the American Association for Clinical Chemistry(AACC), was reproduced as reference method. 4 measurement systems were evaluated as compared method.Results Evaluation of matrix effect: nine processed samples showed no matrix effect at all measurement systems. One processed sample showed matrix effect at all systems. Others showed different matrix effects at different systems.Conclusion The accuracy and comparability for serum total protein measurement is affected by the matrix effects of processed samples.【Key words】Serum total protein; Biuret reaction; Reference method; Matrix effect血清总蛋白作为临床常用的生化检测指标，不仅可用于机体营养状态的监测，还可用于疾病的诊断及鉴别诊断。
对于临床实验室而言，室间质量评价（EQA）材料及参考物质（包括有证标准物质、校准物和质控物）的基质效应会影响检测结果的量值溯源。
本研究受到国家科技支撑计划（2007BAI05B09）资助，旨在建立血清总蛋白的双缩脲反应参考方法。
同时，利用已建立的参考方法，对17种制备物在4种测定系统上的基质效应进行评价。
1 资料与方法1.1 仪器OLYMPUS AU 5400（日本），BECKMAN COULTER DU800 紫外/可见光分光光度计（美国），Eppendorf Research单道可调量程移液器（德国）。
1.2 材料选取20份新鲜混合人血清样品，各浓度分布均匀。
经混匀、离心（3000 rpm,10 min）后分装，-20 ℃保存，1周内检测完毕。
14份室间质评（EQA）材料（2009年度全国室间质量评价计划）批号分别为200911～200915、200921～200925、200931～200934。
质控血清（三个浓度水平）（Bio-Rad，美国，批号45581、45582、45583）。
1.3 方法按照EP-14A［1］的要求，将17种制备物穿插在20份新鲜混合血清中，分别用比对方法（AACC推荐的参考方法［2］）和待评方法（4种市售试剂盒）进行测定，重复3次，每次均需重新定标。
1.4 数据处理1.4.1 作图以待评方法测定值为Y轴，比对方法测定值为X轴，将20份新鲜血清样本的均值绘制成散点图。
1.4.2 线性回归分析若待评方法和比对方法呈明显线性关系，回归直线周围各点的Y轴上的数值基本恒定，则按线性回归模型分析，以待评方法结果的均值为y值，比对方法结果的均值为x值。
1.4.3 多项式回归分析多项式回归模型可以得到最小的预测区间，以及最佳的基质效应检测能力。
若最适模型为二阶多项式y=a0+a1x+a2x2，其中y值为待评方法结果的均值，x为比对方法结果的均值。
其偏回归系数a2经检验不为0（如t检验，P<0.05），则使用二阶多项式模型，反之则使用一阶多项式，即线性回归模型分析。
1.4.4 预测区间的计算使用下列公式计算新鲜患者样本对于给定的x值，其y值均值的双侧95%预测区间：Y pred±t(0.975,n-g)S y·x［1+1n+（x i-x）2∑（x i-x）2］1/2其中Y pred代表x i在回归曲线上y的预测值。
n为新鲜患者血清样本的例数，本研究中n=20。
对于线性回归模型而言g=2；对于二阶多项式回归模型g=3。
S y·x表示回归模型的标准误，计算公式为S y·x=［∑（Y pred-Y i）2/(n-g)］1/2。
x i为第i个样本在x轴(比对方法)上对应的数值。
y i为第i个样本在y轴(比对方法)上对应的数值。
x为比对方法所有数据的均值。
1.4.5 基质效应评价以比对方法为X轴，待评方法为Y轴，将17种制备物的测定结果绘制成散点图。
若对于给定的X值（比对方法测定结果），其Y值（待评方法测定结果）包含于95%预测区间内，则此制备物在该测定系统上无基质效应；若Y值超过预测区间的上限，则此制备物在该测定系统上显示正基质效应；若Y值小于预测区间的下限，则此制备物在该测定系统上显示负基质效应。
1.5 统计学处理对计量资料进行正态性检验，数据处理依据CLIS EP-14A2文件，数据分析采用EXCEL 2003。
2 结果以参考方法测定值为X轴，待评方法测定值为Y轴，分别绘制4种检测系统新鲜人血清和17种制备物的散点图，血清样本的回归曲线及其±95%预测区间，见图1。
系统A～D分别代表：A：柏定生物工程股份有限公司，奥林巴斯AU5400B：上海科华生物工程股份有限公司，奥林巴斯AU5400C：利德曼生化股份有限公司，奥林巴斯AU5400D：奥林巴斯生命与材料科学欧洲股份有限公司，奥林巴斯AU5400根据EP14-A2［1］对于基质效应的评价标准，17种制备物的基质效应评价结果见表1。
结果显示，制备物A、B、E、F、G、I、J、L、P在各系统上均无基质效应，制备物C仅在B系统上存在正基质效应，制备物D在A、B、D三个系统上存在基质效应，制备物H在四个系统上都存在负基质效应，制备物K 仅在A系统上存在负基质效应，制备物M仅在C系统上存在正基质效应，制备物N和Q在A、B系统上存在负基质效应，制备物O在A、B系统上存在负基质效应，在C、D系统上存在正基质效应。
系统A～D分别代表：A：柏定生物工程股份有限公司，奥林巴斯AU5400B：上海科华生物工程股份有限公司，奥林巴斯AU5400C：利德曼生化股份有限公司，奥林巴斯AU5400D：奥林巴斯生命与材料科学欧洲股份有限公司，奥林巴斯AU5400制备物A～Q分别代表：A：2009年卫生部临床检验中心全国常规化学室间质评用质控品（EQA/PT），批号200911B：同上，EQA/PT批号200912C：同上，EQA/PT批号200913D：同上，EQA/PT批号200914E：同上，EQA/PT批号200915F：同上，EQA/PT批号200921G：同上，EQA/PT批号200922H：同上，EQA/PT批号200923I：同上，EQA/PT批号200924J：同上，EQA/PT批号200925K：同上，EQA/PT批号200931L：同上，EQA/PT批号200932M：同上，EQA/PT批号200933N：同上，EQA/PT批号200934O：BIO-RAD，QC1，批号45581P：BIO-RAD，QC2，批号45582Q：BIO-RAD，QC3，批号455833 讨论总蛋白作为监测机体营养状态的常用指标，其检测方法的研究已有近百年的历史。
近年来，尽管量值溯源的概念已逐步被我国的临床实验室所接受，但相较欧洲和美国而言，我国的量值溯源系统仍不完善。
2002年国际计量委员会（CIPM）、IFCC和国际实验室认可合作组织（ILAC）联合成立了检验医学溯源联合委员会（JCTLM），为促进和指导医学检验等效测量以及临床检验量值溯源提供全球平台。
虽然我国的临床生化检验标准化和参考方法研究活动起步较晚，但在国家和地方科研基金的大力支持下已取得了一定进展。
基质效应（matrix effect）一词所描述的是参考物质与新鲜样品的性质差异，近年来逐渐被互通性一词所替代。
这里所说的参考物质不仅是指有证标准物质，还包括各种校准物和质控物。
虽然这些物质在制备过程中会尽量减少基质效应的产生，如选用与被测物基质相同的原料等，但有时为了达到某一特定浓度，会向原料中添加外源性物质。
为了易于储存和运输，也会对原料进行加工，如冻干等。
这些都会导致参考物质与实际样品的结果产生差异［3］。
在量值溯源的过程中，参考物质的基质效应是一个不容忽视的问题。
对于临床而言，基质效应会影响到室间质量评价（EQA）中靶值的确定和非配套系统校准品的选用。
在EQA中，基质效应的存在使得检测结果的靶值不宜采用总体均值来表示［4］，这时不论以何种方式分组（按检测系统或检测原理）都无法达到满意的效果。
仍以临床生化检测为例，由于各实验室所选用的系统相对分散，有的实验室同时使用几种系统，而有的系统可能只在几家实验室中使用。
