细胞化学染色实验

【注意事项】
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1．过氧化氢必须新鲜配制。过氧化氢的最适 浓度是0．05mol／L左右，浓度过高，反 而抑制酶作用。一般采用5ml蒸馏水，加3 ％过氧化氢一滴。若用30％的过氧化氢时， 只能在100ml蒸馏水中加1～2滴。涂片中 粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或
阳性：颗粒略粗，分布较密集。
强阳性：颗粒粗大，密布于整个胞质中。
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2．粒细胞系统：早期原始粒细胞阴性，晚 期(分化好)原始粒细胞以下各阶段呈阳性， 粒细胞越成熟POX反应越强。但衰老的中 性粒细胞酶活性降低，反应程度减弱，甚 至呈阴性反应。嗜酸性粒细胞颗粒更粗大， 呈深蓝色，嗜碱性粒细胞阴性。
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一液5--8滴，使盖满整个血膜，作用1-2min. 2．滴加等量的第二液，混匀，染4--8min。 3．勿倾去染液，直接用水冲洗。 4．干燥后再用瑞氏染液复染。
【结果】
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在细胞的胞浆中出现蓝色或蓝棕色颗粒为阳 性反应。
1．阳性反应强度的判断：
阴ห้องสมุดไป่ตู้：无颗粒。
弱阳性：颗粒小，分布稀疏。
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【临床意义】 POX染色是鉴别急性粒细胞白血病(简
称急粒)、急性单核细胞白血病(简称急单)、 急性淋巴细胞白血病(简称急淋)类型的重 要细胞化学方法。
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1．急性粒细胞白血病：细胞分化较好时，原 始粒细胞呈阳性反应，阳性率可>30%， 在分化较差的白血病，如AML-M0和未分 化型（AML-M1）的部分病例，原粒细胞 的POX染色也可呈阴性。
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【步骤和方法】
1.选骨髓小粒丰富的骨髓片，用甲醇固定 10min，待干。 2．玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，染色 30min(可置37℃环境) 3. 用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染 10—15min。 4．流水冲洗、待干、镜检。
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5、急性单核细胞白血病：原单和幼单POX 多呈弱阳性或阴性，单核细胞呈弱阳性， 阳性率常>3%，阳性颗粒较为细小、稀疏。
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6、中性粒细胞髓过氧化酶缺陷症：中性 粒细胞POX染色，纯合子呈阴性，杂合子 多为弱阳性。在一些髓系细胞白血病，如 部分慢性髓细胞白血病（CML）患者，中 性粒细胞POX染色可呈阴性或弱阳性，提 示POX获得性缺陷。
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二、铁 染 色(Iron Stain)
【目的和原理】 骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，
其中的三价铁与分子中的蛋白质结合不牢， 经稀盐酸处理后而游离，并能在酸性亚铁 氰化钾溶液中产生普鲁士蓝反应。细胞内 铁也可用此法显示。
【材料】
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一、过氧化物酶(Peroxidase Stain，POX) 染色
【目的和原理】 细胞内的过氧化物酶能将底物的过氧
化氢分解，产生新生态氧。后者将试剂中 的联苯胺氧化为联苯胺蓝，后者与亚硝基 铁氰化钠结合，进而形成棕色化合物沉淀 于酶的所在部位。
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1.酸性亚铁氰化钾溶液
取200g／L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓 缓滴加浓盐酸，边滴边摇匀，至出现白色沉淀， 再滴加200g／L亚铁氰化钾溶液，亦边滴边摇匀， 至白色沉淀消失为止，备用。
2．2g／L核固红-硫酸铝溶液 取硫酸铝2g溶于 100ml蒸馏水中，再加入核固红 (Emerk出 品)0.2g。置37℃水浴中1h并随时振荡，使溶解， 过滤后使用。
【结果】
(1)幼红细胞核呈鲜红色，浆呈淡黄红色，铁粒 呈蓝绿色。 (2)细胞外铁：用低倍镜观察涂片，特别是涂片 尾部和髓粒附近，注意翠蓝色颗粒的存在，可分 五级标准。
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(-)：无颗粒 (+)：有少数铁颗粒或偶见铁小珠(颗粒体 积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者称为铁珠)。 (++)：有较多的铁颗粒和小珠。 (+++)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小 块状。 (++++)：有极多铁颗粒、小珠，有很多 的小块，密集成堆。
2．急性早幼粒细胞白血病时白血病细胞呈强 阳性反应。
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3．急性淋巴细胞呈阴性反应，FAB分型规定 POX阳性率<3％。
4．急性粒单细胞白血病：原始细胞POX染 色多呈阳性，阳性率一般>20%，但难于 区分原粒和原单时可进一步作酯酶染色鉴 别。
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3．单核细胞系统：除早期原始阶段外皆呈弱 阳性反应。其颗粒细小，弥散分布，可覆 盖核上，有的也可呈阴性反应。
4．正常网状细胞(分化型)及吞噬细胞：可呈 不同程度阳性反应。
5．淋巴细胞、浆细胞、红细胞、巨核细胞系 统等：均为阴性。
6．Auer小体：呈阳性。
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【器材和试剂】
1．第一液
联苯胺 0．3g
360g／L亚硝基铁氰化钠饱和液 lml
95％L醇 加至 lOOml
贮存于棕色瓶中，可保存一年。小瓶分装 备用。
2．第二液 (稀过氧化氢液，新鲜配制)
3％过氧化氢 0．3ml
蒸馏水
25ml
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【步骤和方法】 1．于新鲜干燥血涂片或骨髓涂片上，滴加第
绿色，即示过氧化氢过浓。若过氧化氢加 于血片上不产生气泡，则示无效。
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2.染色时稀释过氧化氢之后必须与联苯胺液 充分混合，否则同一涂片细胞染色情况不 一致。
【评价】
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POX染色是鉴别急性白血病类型最常 用的细胞化学染色方法。但若原始细胞均 呈阴性（阳性率<3％），并不能肯定是急 性淋巴细胞白血病，因为分化较差的白血 病性原粒细胞、原单细胞、原巨核细胞、 原淋巴细胞均可呈阴性，此时应结合其他 细胞化学染色、细胞免疫表型分析等进行 鉴别。