脱氧雪腐镰刀菌烯醇( DON) ELISA 快速检测试剂盒操作 …

ELISA检测试剂盒操作流程1.准备实验材料和试剂-检验样本：例如血清、尿液、细胞上清液等。

-ELISA试板：根据样本数量选择96孔或384孔的板。

- 试剂盒：包括标准品、washes缓冲液、检测抗体、底物等。

2.样本处理-对于血清等生物液体样本，可用离心将固体物质沉淀并分离下清液。

-样本需储存或运输途中应避免反复冻融。

3.实验板的板液处理-将实验板从包装中取出，将不需要的孔进行盖膜封闭。

- 根据试剂盒说明书，添加适量的板液（Coating Buffer）到每个孔中，使其充分覆盖孔内壁。

-封闭板液的孔，将实验板在2-8℃下放置静置一夜或在37℃下1-2小时孵育。

4.样本添加-倒掉盘液，用PBS或TBST洗板3次，去除残留物。

-将样本加到每个孔中，根据需要添加正样本、负样本和待测样本。

-注意每个样本的剂量和添加的体积，通过试剂盒说明书和实验设计标准控制。

5.抗体添加-清洗步骤同上，将洗板缓冲液加到孔中，重复3次。

-加入检测抗体，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。

-要确保抗体的浓度和添加的体积适宜。

6.洗涤-洗涤步骤同上，用洗涤缓冲液洗板，重复3次。

-每次洗涤时，将洗液完全加满孔，静置1分钟，然后倒出洗液。

-注意洗涤时间和洗涤次数的准确控制，以将非特异性结合物质彻底清除。

7.底物添加-清洗步骤同上，将洗液加到孔中，重复3次。

-加入底物，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。

-底物液体应完全覆盖孔底，防止反应过程中氧化。

8.反应停止-根据试剂盒说明书，将反应停止液加入到孔中，停止底物的反应。

-注意反应停止液的体积和浓度，以保证反应的准确停止。

9.色谱分析-用ELISA板读板仪读取各个孔的OD值。

-根据试剂盒说明书和实验设计的标准曲线确定样本中目标物质的含量。

-注意设置适当的控制组和标准曲线来保证测量结果的准确性。

总结：ELISA检测试剂盒的操作流程主要包括实验板处理、样本添加、抗体添加、洗涤、底物添加、反应停止和色谱分析。

简述使用elisa试剂盒的操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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ELISA试剂盒操作方法ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学试验技术，用于检测体内或体外的蛋白质、抗体、抗原等物质。

ELISA试剂盒是用于进行ELISA实验的一种常见装置。

下面将为您介绍ELISA试剂盒的操作方法。

1.准备工作a.预热-将试剂盒中的所有试剂预热到适当的温度，通常为室温至37°C之间。

b.样品处理-准备好待测样品，可以是血清、细胞上清液、组织提取物等。

如果样品中含有大量的蛋白质或杂质，可以进行样品处理，如稀释、蛋白质去除等。

c.标准品准备-试剂盒通常包含一系列浓度已知的标准品，用于制作标准曲线。

按照说明书的要求，用缓冲液或适当的稀释液将标准品稀释为不同浓度的工作液。

2.涂膜板的处理a.涂膜板选择-根据实验需求选择合适的涂膜板，通常有96孔、384孔等。

b.板钉定位-使用板钉或其他适当的方法将涂膜板固定在适当的工作台上。

c.预涂底物溶液加入-将试剂盒提供的预涂底物溶液加入涂膜板的孔中，注意保持各孔液面平整。

3.样品与试剂添加a.标准品和样品加入-按照实验设计的需要，将标准品和待测样品分别加入涂膜板的孔中。

b.阳性对照和阴性对照加入-根据试剂盒的要求，加入阳性对照和阴性对照。

c.洗涤液加入-在每次试剂或样品加入后，使用专用的洗涤液将孔洗涤，以清除无关物质。

4.反应与显色a.结合抗体加入-按照试剂盒说明书要求，加入适当的结合抗体，用于与待测物质结合形成复合物。

b.二抗加入-加入带有底物标记的二抗，与结合抗体结合形成复合物。

c.显色底物加入-加入含有适当底物的显色底物试剂，使底物与酶结合并发出信号。

5.反应停止与测量a.反应停止液加入-在适当的时间点，根据试剂盒的说明，加入反应停止液，停止底物的酶反应。

b.光密封膜或保护板加盖-加盖光密封膜或保护板，防止溶液蒸发或污染。

6.读取和数据处理a.读取吸光度-使用ELISA读板仪读取各孔的吸光度值。

一、概要
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol）又称呕吐毒素（Vomitoxin）属于霉菌的单端孢菌素族，由某些镰刀霉真菌属产生。

呕吐毒素多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中，含量通常是mg/kg(μg/mL，ppm)级的，由于其具有高的细胞毒素及免疫抑制性质，对人类及动物构成了健康威胁。

本试剂盒是应用ELISA技术研发而成的检测产品，能最大限度地减少操作误差和工作强度。

二、试验原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被呕吐毒素抗原，样本中的呕吐毒素和微孔条上预包被的抗原竞争抗呕吐毒素抗体（抗试剂），同时抗呕吐毒素抗体与酶标二抗（酶标物）相结合，，经TMB底物显色，样本吸光度值与其所含呕吐毒素量呈负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中呕吐毒素的含量。

三、适用范围
可定性、定量检测，本试剂盒适用于饲料样本中呕吐毒素的含量检测。

四、交叉反应率
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）…………………………100%
3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (1)
五、检测步骤
1、将所需试剂从冷藏环境中取出
2、取出需要数量的微孔板
3、洗涤工作液在使用前也需回温。

4、编号
5、加标准品/样本
6、洗板
7、显色
8、测定
六、检测方法灵敏度、准确度、精密度
样本最低检测限：
饲料……………………………………………………150µg/kg
回收率：
饲料……………………………………………………95±15%
七、贮藏条件及保存期
贮藏条件：保存试剂盒于2~8℃。

保存期：该产品有效期为12个月。

谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定方法1 主题内容与适用范围本标准规定了谷物及其制品(蛋糕、饼干、面包等)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法及免疫测定法(ELISA)的基本要求。

本标准适用于谷物(小米、玉米、大麦等)及其制品(蛋糕、饼干、面包等)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。

第一法的最低检出浓度为0.1mg/kg。

第二法的最低检出浓度为0.1ng/kg。

第一篇薄层色谱测定法2 原理谷物及其制品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层展开后，加热薄层板。

由于在制备薄层板时加入了三氯化铝，使脱氧雪腐镰刀菌烯醇在365nm紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较。

3 试剂以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水。

3.1 三氯甲烷。

3.2 无水乙醇。

3.3 甲醇。

3.4 石油醚(60～90℃或的30～60℃)。

3.5 乙酸乙酯。

3.6 乙腈。

3.7 丙酮。

3.8 异丙醇。

3.9 乙醚。

3.10 无水乙醚。

3.11 氯化铝(AlCl3·6H2O)：化学纯。

3.12 中性氧化铝：层析用，经300℃活化4h，置干燥器中备用。

3.13 活性炭：20g活性炭，用3mol/L盐酸溶液浸泡过夜、抽滤后，用热蒸馏水洗至无氯离子，在120℃烘干备用。

3.14 硅胶G：薄层层析用。

3.15 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(以下简称DON)标准溶液，精密称取5.0mg DON，加乙酸乙酯－甲醇(19∶1)溶解。

转入10m 容量瓶中，用乙酸乙酯－甲醇(19∶1)稀释至刻度，此标准溶液含DON0.5mg/mL。

吸取此标准溶液0.5mL，用乙酸乙酯－甲醇(19∶1)稀释至10mL，此溶液每毫升含DON25?g。

4 仪器4.1 小型粉碎机。

4.2 电动振荡器。

4.3 75mL玻璃蒸发皿。

4.4 层析柱：内径2cm，长10cm，不具活塞。

4.5 10mL具塞浓缩瓶：底部具0.2mL刻度尾管。

4.6 玻璃板：5×20cm。

呕吐毒素快速检测试纸条使用说明书【产品简介】脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol）又称呕吐毒素（Vomitoxin），本产品为呕吐毒素胶体金快速检测卡，用于定性检测谷物样品中呕吐残留，整个检测过程只需要5分钟，检测卡灵敏度为250ng/ml（2 50ppb）。

谷物样品的检测限为1μg/ml（1ppm）。

【检测原理】基于竞争法胶体金免疫层析技术，检测液中如果含有呕吐毒素，其浓度又高于检测试纸的灵敏度，则会与试纸卡上的抗体结合形成复合物，使应该在试纸上出现的红色T线不显色，结果判为阳性。

反之为阴性。

【适用范围】快速筛查粮食或饲料中呕吐毒素是否超标以及食物中毒发生后快速筛查中毒因子是否为呕吐毒素。

【包装组成】●呕吐毒素胶体金法检测卡（40份）●一次性塑料滴管（40支）●塑料一次性手套（5只）●使用说明书（1份）【样品处理】1.取5g以上有代表性的粉碎后的谷物样品（过20目筛），准确称取0.5g均匀粉碎试样，加入到配套的15 ml离心管中。

2．向离心管中准确加入纯净水和乙酸乙酯各2mL，将瓶塞盖紧密封，用力振荡5分钟，4000rpm离心1分钟（备注：如实验室没有大离心机设备，可以用小离心管取1.5ml上清液，用小离心机离心）。

3．用吸管取0.6mL上清液到小玻璃杯中，吹干滤液，然后用0.3ml体积稀释液复溶杯底固体。

此溶解液即为检测液.4．取出试纸，开封后平放在桌面，用滴管向试纸孔缓慢而准确地逐滴加入3滴检测液。

5．5~10分钟判断结果，半小时后的结果判读无效。

【结果判断】阴性（－）：C、T线均显色。

表示样品中不含有待检测物质或其浓度低于检测限。

阳性（＋）：检测T线不显色，则表示样品中待检测物质浓度高于检测限。

无效：质控C线未显色，表明操作过程不正确或试纸条已失效。

【贮存条件及有效期】2-30℃，密封干燥，检测卡保存时间18个月，乙酸乙酯为易挥发性有机溶剂，保存为12个月。

真菌毒素胶体金检测试纸基于抗原抗体的免疫原理，利用纳米胶体金层析技术，在真菌毒素的现场检测时具有以下优势：1) 单个样品即可检测，无需仪器设备，特别适合现场检测；2) 灵敏度高: 免疫层析法可检出量可达ng级，ELISA法最低检出量可达pg级，并可定量测定。

粮油检测与品质分析小麦入库快速检测呕吐毒素的方法小麦入库快速检测呕吐毒素的方法*戴木香颜楹（福建省储备粮管理有限公司南安直属库362341）摘要通过对比液相色谱法和酶联免疫测定法检测呕吐毒素，发现两种方法测定的结果相近。

酶联免疫测定法具有检测时间短、检测成本低的优点，比液相色谱法更适用于粮库的实际需要，可以更快地得到所测小麦样品的呕吐毒素指标。

关键词呕吐毒素小麦液相色谱法免疫测定法呕吐毒素（Vomitoxin），又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），主要由某些镰刀菌产生的毒性代谢产物，是赤霉病麦中毒的病原物质，小麦中最为常见。

因为呕吐毒素（DON）的性质十分稳定，高压、高温等食品加工对它的影响很小，有研究表明当温度达到210ħ也要处理30min 40min才能被破坏。

所以人和牲畜在误食被毒素污染的粮油后会产生广泛的毒性效应，会引起呕吐、拒食、免疫系统和造血系统受到损害，有一定的致畸、致突变作用，致癌作用暂时不明确。

为了减少呕吐毒素（DON）对人和牲畜的危害，目前很多地区和国家都制定了相应的标准来限制谷物及其制品中的呕吐毒素（DON）的含量，根据《食品中真菌毒素限量》（GB2761－2017）标准：规定谷物及其制品中的呕吐毒素（DON）的限量为1000μg/kg。

而根据调查，农户虽然多次用药，但因南方阴雨天气偏多，光照不足，使用药的效果不佳，导致今年部分省份小麦呕吐毒素超标现象较为严重，直接影响了收粮的质量安全。

因此加强对小麦中的呕吐毒素的检测成为了粮食部门每年收购的重要工作之一。

粮油检测中比较常见的呕吐毒素检测法是高效液相色谱法和酶联免疫法（ELISA）。

高效液相色谱法是用提取液提取试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素），经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱紫外检测器测定，外标法定量。

高效液相色谱法虽然准确度高，但是前处理复杂，而且仪器也非常昂贵，不适合于粮食收购量大而条件简单的基层粮食检测酶联实验室。

ELISA试剂盒操作方法ELISA（酶联免疫吸附法）是一种常用的实验技术，用于检测目标物（如蛋白质、抗原或抗体）的存在和浓度。

ELISA试剂盒是ELISA实验的核心，包括特定的试剂和材料，用于执行特定的步骤和操作。

以下是一般ELISA试剂盒的操作方法，包含以下步骤：1.准备实验样品：收集所需分析物的样品（例如血清、细胞上清液或组织提取液等），并适当保存或稀释以便后续操作。

2.预处理步骤：根据实验的目的和试剂盒的要求，进行样品的预处理。

这可能包括去除干扰物质、离心、稀释或加热等处理步骤。

3.涂覆酶联免疫板：打开试剂盒中提供的酶联免疫板，将其放置在工作台上。

将涂覆物质（如抗体或抗原）加入到每个酶联免疫孔中，通常使用多通道移液器或微量移液器进行操作。

涂覆后，尽量避免泡沫和交叉污染。

4.触发剂孵育：将涂覆后的酶联免疫板放入孵育箱或板上孵育器中，在适当的温度下孵育一段时间。

此步骤的目的是固定涂覆物质，并优化其活性。

5.洗涤：将试剂盒中提供的缓冲液加入酶联免疫孔中，并倾斜孔盘轻轻敲打或使用洗板仪进行洗涤，以去除未结合的物质和杂质。

通常，洗涤液需要多次更换，充分洗涤以获得更好的准确性和灵敏度。

6. 过量引物（Block）：加入试剂盒提供的阻断缓冲液至孔中，目的是防止非特异性结合的发生。

阻断时间可以根据试剂盒的要求进行调整。

7.加入样品和控制物质：将处理好的样品和控制物质，如阳性对照和阴性对照，加入到各个酶联免疫孔中。

注意要根据试剂盒的要求进行适当的稀释。

8.孵育和洗涤：将孔盘放回孵育箱或板上孵育器中，按照试剂盒的要求进行孵育。

完成孵育后，继续进行洗涤步骤，以去除未结合的物质。

9.检测剂加入：将检测试剂（通常是特异性抗体或酶标记物质）加入酶联免疫孔中。

如有需要，可以进一步稀释试剂以适应实验要求。

10.再次孵育和洗涤：将孔盘放回孵育箱或板上孵育器中，对要求进行的步骤进行孵育。

完成孵育后，进行洗涤步骤以去除未结合的物质。

《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法》编制说明《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法》标准起草组2011年11月《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法》编制说明1．任务来源及工作过程国务院粮食管理流通条例和粮食卫生标准都明确规定粮食收购要对真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行检验控制，而我国标准体系中缺少呕吐毒素快速检测的方法及标准因此，该项研究迫在眉睫。

我国是农业大国，农产品种植区分布广泛，粮食收购多集中在县以下单位的粮食收储库点。

时间短，收购量大，存在很多隐患。

主要集中在以下方面：一方面粮食入库时间短，不宜长时间露天存放，因此对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测需要快速定性。

另一方面收购企业技术力量和硬件设备不足，利用大型仪器检测收购粮真菌毒素无法普及。

因此目前在粮食收购环节最需要解的问题就是建立高效、快速、低成本的定性检测方法。

传统上，真菌毒素的分析一般采用薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)。

TLC虽然简便，但灵敏度差；HPLC虽然灵敏度高，但样品处理烦琐，操作复杂，仪器昂贵。

这两种方法都不适合在收购原粮时进行快速定性检测。

因此需要脱氧雪腐镰刀菌烯醇快速检测方法的研究，从源头解决储备粮真菌毒素污染问题。

为了确保公民的饮食安全，进一步保证产品质量、规范生产、为市场监督提供依据，需要制定《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇——胶体金快速测试卡检测方法》标准，按照GB2760-2007的要求，对小麦粉及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量进行监督。

本行业标准的制定是根据国家粮食局标准质量中心下达的年国家标准制修订任务，由北京市粮油食品检验所负责起草。

项目编号：2. 编制过程第一阶段工作第一阶段为收集国内外脱氧雪腐镰刀菌烯醇测试分析标准及相关资料，了解掌握脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定方法的最新技术发展情况阶段。

本阶段查阅了大量的文献资料，参考国内外脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定方法的国家标准和行业标准。

ELISA kit for quantitative detection of deoxynivalenol一、概要呕吐毒素(V omitoxin)，是一种单端孢霉烯族毒素，主要由禾谷镰刀菌和粉红镰刀菌产生，化学名称为脱氧腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，容易存在于各种谷物类粮食及加工产品中，污染水平一般为mg/kg（ppm）级。

DON具有很强的细胞毒性。

人误食DON含量高的食物后，容易导致急性中毒头昏、腹胀、恶心、呕吐，以及白细胞缺乏症。

目前通常应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）对谷物（小米、玉米、大麦等）及其制品（蛋糕、饼干、面包等）中的DON含量进行快速、定量检测。

二、原理本试剂盒是利用间接酶联免疫吸附微孔模式进行检测，灵敏度可达12.5 µg/kg（ppb）。

样品或标准品中游离的呕吐毒素与包被在微孔中的抗原竞争结合游离单克隆抗体上的结合位点，形成抗原抗体结合物，经洗板洗去多余的抗体与呕吐毒素后，加入酶标记的二抗与单克隆抗体结合，经再次洗板后加入显色剂与反应底物，其与酶标物作用而成蓝色，加入反应停止液后颜色由蓝色转变为黄色，黄色越深则表明呕吐毒素越少，用酶标仪在450 nm处测定光吸收值可准确定量检测样品中的呕吐毒素污染水平。

三、试剂盒构成1、反应板支架…………………………………………………………………………1块2、呕吐毒素抗原包被反应板………………………………………………………….36孔3、呕吐毒素标准品溶液（0 ppb，12.5 ppb，25 ppb，50 ppb，100 ppb，200 ppb）…1套4、呕吐毒素单克隆抗体………………………………………………………1瓶5、稀释液……………………………………………………………………1瓶6、酶标二抗溶液………………………………………………………………1瓶7、显色剂溶液………………………………………………………………………1瓶8、反应底物溶液………………………………………………………………1瓶9、终止液………………………………………………………………………………1瓶10、浓缩洗涤液（20 X）………………………………………………………1瓶四、注意事项1、试剂盒请置放于2-8℃条件下保存，使用过程中不要让微孔干燥，使用后立即将试剂放回至2-8℃条件下冷藏。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准是近年来新出现的一种血液学检测标志物，被广泛应用于临床医学领域。

这种标准的出现对于疾病的早期诊断及治疗具有重要的意义。

下面将详细介绍脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准的应用及检测步骤。

一、脱氧雪腐镰刀菌烯醇的意义脱氧雪腐镰刀菌烯醇简称DHEA，是一种人体内合成的激素，它主要具有调节免疫系统、抗氧化、抗应激等功能。

科学研究发现，DHEA水平的降低与多种疾病存在关联性，如糖尿病、心血管疾病、癌症等。

因此，DHEA水平的检测可作为疾病预防、早期诊断及治疗的重要参考。

二、脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准的测定方法1、采血脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测需要抽取静脉血。

在此之前需请患者前一天晚上禁食8-12小时，以保证血液样本处于空腹状态，不会有外界条件的干扰。

2、制备血清将采集的血液样本放置在离心管中，并在室温下静置约30分钟。

待血液凝结后，使用离心机将其离心，分离出血清。

3、检测DHEA水平使用高灵敏度的化学发光法或酶联免疫吸附法检测DHEA水平。

首先将样本加入试剂盒中，分别加入标准品和对照品。

经过混合后读取样本的吸光值，并将其与标准品和对照品的吸光值进行比较，以获得样本DHEA浓度值。

三、脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准的应用1、肿瘤筛查DHEA水平的异常变化有一定的与肿瘤相关。

例如在肺癌、支气管癌、卵巢癌等较多的疾病中可以发现DHEA的含量有着明显变化。

因此，通过测定DHEA水平，可以对肿瘤进行早期筛查、诊断及观察。

2、心血管疾病评估DHEA在调节心血管系统中具有重要作用。

研究表明，DHEA水平不足可引起心脏疾病的发生和加重。

因此，测定DHEA水平有助于对心血管疾病的早期诊断、治疗、观察及预防。

3、调节人体免疫系统DHEA可以提高人体免疫力，并增加机体对应激的适应性能力。

且在老年人中，DHEA水平通常较低。

因此，DHEA水平的检测可以预防免疫系统的降低，改善人体健康状况。

在生活中，随着人们对健康的重视，脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准的应用将会越来越广泛，它将会成为一种常见的体检指标，对人们的健康日常管理提供更为稳妥的指导。