下载文档原格式
等电聚焦电泳的两种方法等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）6－8％尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定1常灏，黄耀江，沈光涛中央民族大学生命与环境科学学院，北京（100081）E-mail：haobio@摘要：作为一种新型的速效局部止血药和工具酶，凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛，牛血浆是其重要的来源之一。
等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤，测定其等电点后，再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。
本实验的目的是通过测定胰蛋白酶的等电点建立载体两性电解质等电聚焦电泳的方法，并以该方法结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等电点。
经双向电泳后，SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点，分别测定它们的分子量和等电点，其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa，其等电点为5.19。
关键词：牛凝血酶，等电点，等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 引言凝血酶（Thrombin，EC3.4.21.5）是一种丝氨酸蛋白水解酶，在血液凝固系统中起重要作用。
它能催化溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。
[1][2]凝血酶在参与凝血作用的同时，对底物还具有高度的特异性，可以专一性地切割X-Arg-Gly或Gly-Arg-X序列中由精氨酸羧基参与形成的肽键。
[3]由于凝血酶具有以上的特性，近年来使其成为一种新型的速效局部止血药，在临床上被广泛应用于消化道出血和外科手术止血。
[1]此外，利用其作用的特异性，还可作为工具酶用来加工目的产物，在医学和生物学研究上的用途也很广泛。
现在，制备凝血酶的原料多为牛、猪和人的血浆。
我国猪血的来源相当广泛，随着开发利用猪血的意识逐渐提高，有关猪凝血酶提取方法的文献报道也越来越多。
目前，凝血酶的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法3种。
[1]其中等电点沉淀法是最简单易行的分离方法，也是后续纯化工作的基础。
凝血酶的等电点在5.0～5.5之间[1]，但物种之间是有差异的。
等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法（Isoelectric focusing，IEF）是一种高效的分离蛋白质的方法，它基于蛋白质在特定pH 值下的等电点电荷状态差异进行分离。
该方法可用于分离电荷异构体、突变体、异构蛋白质和翻译后修饰的蛋白质。
IEF 方法需要一个pH 梯度凝胶，通常使用聚丙烯酰胺凝胶。
样品被加到凝胶的一侧，然后用电场沿pH 梯度进行电泳。
当蛋白质移动到与其等效的pH 值处时，电荷变为中性，停止运动。
这种分离方法可以在同一凝胶中完成多个样品的分离，并且它可以与其他分离方法例如SDS-PAGE 结合使用，从而实现更高的分辨率。
IEF 方法已被广泛应用于生命科学中的蛋白质研究和分析，例如生物医学、生物化学和分子生物学等领域。
0541电泳法
第六法等电聚焦电泳法
等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法
除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
(1)水(电阻率不低于 18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶
1。
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性184电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
等电聚焦电泳等电聚焦电泳（dielectrophoreticfocusing）是一种用于细胞、分子、纳米颗粒和其他微流体的微流控技术，通过利用非线性电势场的电力作用力而形成。
等电聚焦电泳被广泛应用于医学、生物、农业等领域，用于扩大细胞、分子的空间分布，增强特定类型的细胞和分子的活性，以及改善生物和化学分离等。
等电聚焦电泳技术是借助电力作用力而产生的，它可以控制和操纵介观尺寸细胞及其他形态、性质及体积的微流体，并将它们集中在一定的位置上，使得它们可以形成一个固定的浓度差，从而有效地改变细胞组织或分子组织。
此外，等电聚焦电泳可以将细胞和分子单独分离，用于研究其功能、形态和特性，对细胞组织的分离比传统的手工分离有更高的灵活性和精确度。
等电聚焦电泳技术主要包括三个关键步骤：电场的制备，细胞或分子组织的悬浮和集中以及离心纯化等步骤。
首先，电场的制备涉及制造一个稳定的电场，也就是控制静电场的强度，以及形成旋转电场的大小及方向，以使细胞或分子组织能够在最佳的条件下在电场中运动。
其次，通过几种方法将细胞或分子组织悬浮在溶液中，并且在电场中形成一定的浓度差。
最后，采用离心力来调节浓度差，以集中细胞或分子组织。
等电聚焦电泳技术有许多优势可以利用，其中最大的优势是可以在低成本、高效率和高精确度的情况下分离细胞、分子和纳米颗粒。
等电聚焦电泳技术也具有较强的灵活性，可以根据实验需求设计合适的电场，以实现一些特殊的功能要求，例如分离染色体、调整细胞的形态和性质、对微流体进行排序，并且可以在体外环境实现实验工作，不会受到体内环境的限制。
等电聚焦电泳技术是一种重要的技术，它可以确保细胞、分子和纳米颗粒的有效分离，有助于研究各种特定类型的细胞及其功能，也可以用于分离细胞组织或分子组织，增强特定类型的细胞和分子的活性，以及改善生物和化学分离。
随着技术的进步和发展，等电聚焦电泳技术的应用也会越来越广泛，在不久的将来会得到更多的应用，有助于推动科学和技术的发展。
一、什么是生物工程？简述现代生物工程的体系组成。
生物工程（B i oe n g i n e e ri ng ）又称生物技术或生物工艺学，是20 世纪70 年代发展起来的一门新的综合性应用科学,是基于分子生物学和细胞生物学的新兴技术领域。
通常把生物技术分为发酵工程、酶工程、基因工程、细胞工程四个分科，它们相互依存，相互促进。
其中，酶工程是生物工程的重要组成成分。
二、什么是酶工程？研究酶与酶工程的意义？酶工程是随着酶学研究迅速发展，特别是酶的应用推广使酶学与工程学相互渗透结合，发展而成的新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术。
它是从应用的目的出发研究酶，是在一定生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化为有用物质的技术。
酶工程包括下列主要内容（酶的产生酶的制备酶和细胞固定化酶分子改造有机介质中的酶反应酶反应器抗体酶酶传感器酶技术应用）酶与酶工程研究的重要意义:1研究酶的理化性质及其作用机理，尤其是从酶分子水平去探讨酶与生命活动、代谢调节、疾病、生长发育的关系，具有重大科学意义。
2酶是分子生物学研究的重要工具，限制性内切酶H in d Ⅱ的发现使核酸序列测定有了突破，促进了DN A 重组技术的诞生，推动了基因工程的发展3酶的高效率、专一性及不需要高温高压或强酸强碱的反应条件，对普通的化学催化反应产生了决定性的飞跃。
它丰富充实了现代化学中的催化理论4酶在工、农、医各方面都应用已久。
现在，从与人们生活休戚相关的衣食住行到各行各业的高技术革命，几乎都与酶有关。
三、酶作为生物催化剂的显著特点是什么？影响酶活性的因素有哪些？催化效率高；高专一性；易失活；调节性。
（1．酶浓度的调节 2. 激素调节 3. 共价修饰调节 4. 限制性蛋白水解作用与酶活力调控 5. 抑制剂的调节 6. 反馈调节 7. 金属离子和其他小分子化合物的调节）？除[E]、[S]外，外界因素：温度、pH、激活剂、抑制剂？四、解释典型的（米氏）酶动力学曲线，K m、K s、V max和k cat的定义是什么？说明这些常数之间的关系？K m：反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。
蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。
蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。
蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。
本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。
一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。
这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。
1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。
因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。
2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。
因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。
3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。
此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。
由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。
二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。
测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。
常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。
在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。
可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。
2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。
3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。
等电点常用的检测方法等电点是指在溶液或介质中，正负离子的浓度相等时的pH值。
在生物学研究中，等电点被广泛应用于蛋白质、细胞膜和DNA等生物大分子的研究中。
为了准确测定分子的等电点，科学家们开发了许多检测方法。
以下是一些常用的等电点检测方法。
1. 等电聚焦电泳法等电聚焦电泳法是一种基于电荷的分离技术，它使用特定的缓冲液体系和电场梯度，将混合的蛋白质在等电点处停留并分离。
这种方法通常用于检测蛋白质的等电点，其优点是操作简单、分离效果好、分离时间短。
2. 等电点电位仪法等电点电位仪法是一种基于电位的检测方法，它利用电位计测量溶液中蛋白质的等电点。
这种方法适用于检测高分子的等电点，如DNA和RNA等，它的优点是精度高、可靠性好。
3. 等电点扫描仪法等电点扫描仪法是一种基于光学的检测方法，它使用可见光和紫外线光谱技术，测量溶液中分子的吸收率和发射率，以确定分子的等电点。
这种方法适用于检测各种高分子的等电点，如蛋白质、DNA 和RNA等，其优点是准确度高、分析速度快。
4. 等电点显色法等电点显色法是一种基于化学反应的检测方法，它利用荧光染料和酸碱指示剂的颜色变化来测定分子的等电点。
这种方法适用于检测各种高分子的等电点，如蛋白质、DNA和RNA等，其优点是灵敏度高、测定精度高。
5. 等电点测定仪法等电点测定仪法是一种基于电泳和电学检测的方法，它利用电场和电荷的作用，将混合的分子在等电点处分离并检测。
这种方法适用于检测各种高分子的等电点，如蛋白质、DNA和RNA等，其优点是测定精度高、分离效果好。
以上这些方法都是常用的等电点检测方法，在生物学研究中都有广泛的应用。
不同的方法各有优缺点，选择适合自己研究的方法进行等电点检测，对于研究结果的准确性和科学价值都有着重要的意义。
0541电泳法第六法等电聚焦电泳法等电聚焦电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法适用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂(1)水(电阻率不低于18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶液 4ml，加水至 20ml。
加 0.1%甲基红溶液20μl。
(5)pI 标准商品化试剂，所选用的pI 标准的等电点范围一般应涵盖供试品的等电点。
(6)固定液称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g, 加水溶解并稀释至300ml。
(7)脱色液(平衡液) 取 95%乙醇 500ml、冰醋酸 160ml，加水稀释至2000ml。
(8)染色液称取考马斯亮蓝G250(或R250)0.35g，加脱色液300ml，在60〜70℃水浴中加热，使溶解。
(9)保存液取甘油30ml，加脱色液300ml，混匀。
(10)正极液(0.01mol/L 磷酸溶液) 取磷酸1ml，加水至1800ml。
(11)负极液(0.01mol/L 氢氧化钠溶液) 称取氢氧化钠0.4g，加水溶解并稀释至1000ml。
3.测定法(1)制胶装好垂直平板电泳槽，压水，于玻璃板和玻璃纸之间加入 60% 甘油 1ml。
取水 12ml、甘油 2ml、A 液 4.0ml、两性电解质(pH3〜10)溶液( 或其他两性电解质 )1.0ml, 混匀，脱气，再加 B 液 72 μl，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺3μl，混匀后注入槽内聚合，插入样品梳，注意避免气泡出现。
[模拟] 初级临床医学检验技士基础知识46以下每一道考题下面有A、B、C、D、E五个备选答案。
请从中选择一个最佳答案。
第1题：正常成人血液总量约占体重的A.5%～7%B.7%～9%C.9%～11%D.11%～13%E.13%～15%参考答案：B正常人血量约为(70±10)ml／kg，成人约4～5L，约占体重的6%～8%。
第2题：血细胞计数池深度是A.0.01mmB.0.05mmC.0.10mmD.0.15mmE.0.20mm参考答案：A计数池两侧各有一条支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高为0.01mm 的计数池。
第3题：ABO血型鉴定使用玻片法的错误的说法是A.操作简便B.适用于反定型C.适合大批量标本D.反应时间长E.不需要离心参考答案：B玻片法：操作简单，适于大量标本检查，但反应时间长；被检查者如血清抗体效价低，则不易引起红细胞凝集，因此，不适于反向定型。
第4题：氰化高铁血红蛋白最大吸收峰波长为A.405nmB.450nmC.500nmD.540nmE.640nm参考答案：D氰化高铁血红蛋白在540nm处有一吸收峰。
第5题：导致红细胞病理性减少的原因是A.库欣病B.真性红细胞增多症C.异常血红蛋白病D.遗传性球形细胞增多症E.肺气肿参考答案：D异常血红蛋白病、肺气肿可导致组织缺氧，EPO代偿性增高促使RBC继发性增多；真性RBC增多症是原发性RBC增多的一种。
库欣病患者会有毛细血管扩张、多血质的特点，而无RBC病理性减少，遗传性球形红细胞增多症属于RBC膜缺陷引起贫血的一种疾病，可导致RBC病理性减少。
第6题：蛋白尿指尿蛋白定量超过A.10mg／24hB.20mg／24hC.50mg／24hD.100mg／24hE.150mg／24h参考答案：E蛋白尿指尿液中蛋白质超过150mg／24h或超过100mg／L。
第7题：透明管型的基质主要是A.球蛋白B.铁蛋白C.前清蛋白D.T-H蛋白E.脂蛋白参考答案：D管型形成过程中尿液蛋白质和T-H蛋白为形成透明管型的基础物质。
凝血酶等电点一、引言凝血酶是凝血过程中的关键酶类，其等电点的研究对于了解凝血酶的结构和功能具有重要意义。
本文将对凝血酶的等电点进行探讨，从定义、影响因素、测定方法及应用方面进行全面详细的阐述。
二、等电点的定义等电点是指在溶液中，凝血酶带有净电荷的总量为零的pH值，此时凝血酶不带电荷，属于最稳定状态。
三、影响凝血酶等电点的因素3.1 氨基酸组成凝血酶是由氨基酸组成的蛋白质，其氨基酸残基的性质和数量对等电点的确定起重要作用。
不同氨基酸的酸碱性质不同，氨基酸残基的数量对凝血酶的电荷有直接影响。
3.2 溶剂条件溶剂的离子浓度和温度等都会对凝血酶的等电点产生影响。
溶液中的离子会改变溶液的电导性，从而影响凝血酶的电荷状态。
3.3 氧化还原性质凝血酶的氧化还原性质对其等电点也有直接影响。
在一些特定氧化还原体系中，凝血酶可能发生氧化还原反应，从而改变其电荷状态和等电点。
3.4 自然界pH凝血酶在生理情况下处于某种特定的环境中，自然界的pH范围是有限的，这也限制了凝血酶等电点的可能范围。
四、凝血酶等电点的测定方法4.1 等电点电泳法等电点电泳法是常用的蛋白质等电点测定方法之一。
该方法基于蛋白质在不同pH 条件下的电荷状态，通过电泳技术将蛋白质分离并确定其等电点。
4.2 等电点聚焦法等电点聚焦法是一种高效的蛋白质等电点测定方法。
该方法利用聚焦电泳的原理，通过控制pH梯度将蛋白质在凝胶中沿电泳方向定位到其等电点位置。
4.3 等电点测定仪等电点测定仪是一种自动化的蛋白质等电点测定设备。
该设备利用pH梯度和电泳技术，通过测量样品在不同pH条件下的电导率变化，确定样品的等电点。
五、凝血酶等电点的应用5.1 蛋白质纯化凝血酶等电点的确定对蛋白质的提纯具有指导作用。
在蛋白质分离纯化过程中，可以根据凝血酶的等电点选择适当的方法和条件，提高蛋白质纯度和产率。
5.2 药物研发凝血酶等电点的研究在药物研发领域有重要应用。
通过了解凝血酶等电点的变化规律，可以设计出更稳定和有效的药物，提高治疗效果。
等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定1常灏，黄耀江，沈光涛中央民族大学生命与环境科学学院，北京（100081）E-mail：haobio@摘要：作为一种新型的速效局部止血药和工具酶，凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛，牛血浆是其重要的来源之一。
等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤，测定其等电点后，再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。
本实验的目的是通过测定胰蛋白酶的等电点建立载体两性电解质等电聚焦电泳的方法，并以该方法结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等电点。
经双向电泳后，SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点，分别测定它们的分子量和等电点，其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa，其等电点为5.19。
关键词：牛凝血酶，等电点，等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 引言凝血酶（Thrombin，EC3.4.21.5）是一种丝氨酸蛋白水解酶，在血液凝固系统中起重要作用。
它能催化溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。
[1][2]凝血酶在参与凝血作用的同时，对底物还具有高度的特异性，可以专一性地切割X-Arg-Gly或Gly-Arg-X序列中由精氨酸羧基参与形成的肽键。
[3]由于凝血酶具有以上的特性，近年来使其成为一种新型的速效局部止血药，在临床上被广泛应用于消化道出血和外科手术止血。
[1]此外，利用其作用的特异性，还可作为工具酶用来加工目的产物，在医学和生物学研究上的用途也很广泛。
现在，制备凝血酶的原料多为牛、猪和人的血浆。
我国猪血的来源相当广泛，随着开发利用猪血的意识逐渐提高，有关猪凝血酶提取方法的文献报道也越来越多。
目前，凝血酶的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法3种。
[1]其中等电点沉淀法是最简单易行的分离方法，也是后续纯化工作的基础。
凝血酶的等电点在5.0～5.5之间[1]，但物种之间是有差异的。
已有报道显示，将猪血浆采用适宜的稀释度稀释后，用1%或2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可将猪凝血酶原粗制品沉淀出来。
[2][4][5][6]在我国，牛血的来源也是比较丰富的，因此从牛血中提取凝血酶也具有一定的社会意义。
欲利用等电点沉淀法得到牛凝血酶的粗制品，需预先得知其等电点。
虽然已有文献报道，将牛血浆稀释10倍后，用2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可沉淀出牛凝血酶原[7]，但其等电点的准确值在文献中尚未见报道。
随着系统生物学和蛋白质组学的迅速发展，作为其主要的研究手段之一的电泳，应用范围越来越广泛和普遍。
等电聚焦（Isoelectric Focusing, IEF）电泳技术，凭借其高分辨率等优点，现已成为一种被广泛采用的蛋白质分析和制备技术。
它不仅可以测定蛋白质的等电点，分离混合的蛋白质，而且与SDS-PAGE组成双向电泳后可大大提高分离蛋白质的能力。
因此，可以采用双向电泳的方法（第一向：IEF，第二向：SDS-PAGE），测定牛凝血酶的等电点。
根据凝胶过滤法的测定，牛凝血酶的相对分子质量为37 kDa，由两条多肽链通过一个二硫键相连，A链为5kD，B链为32kD。
[2]这样就可以在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中确定牛凝血酶的条带，从IEF中得知其等电点。
等电点测定后，使得采用等电点沉淀法获取牛凝血酶粗制品时纯度更高，有利于纯化操作和研究其功能，以及其它相关研究工作的进行。
2.等电聚焦基本原理1本课题得到学校“211工程”基金资助。
等电聚焦(Isoelectrofocusing, IEF)是1966年由瑞典科学家Harry Rilbe和Olov Vesterbery 建立的一种高分辨的蛋白质分离分析技术。
它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的不同在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离分析。
蛋白质是由不同数量和比例的L-α氨基酸组成的。
氨基酸侧链在不同的pH环境中带不同的电荷。
当pH>pI时，蛋白质带负电荷，在电场的作用下向正极移动；当pH<pI时，蛋白质带正电荷，在电场的作用下向负极移动；当pH=pI时，蛋白质所带的净电荷为零，在电场的作用下不发生移动。
蛋白质的等电点范围很宽，因此可以依据等电点来进行蛋白质的分离和分析。
在凝胶中放入载体两性电解质，通以直流电后即可形成从阳极到阴极逐步增加的pH梯度。
当带电的蛋白质分子进入此体系时即移动并聚焦于相当其等电点pH的位置。
因此，本技术可依据等电点的不同将蛋白质分子分离，并且反之根据蛋白带pH在梯度中的位置测得该蛋白质的等电点。
构成凝胶介质pH梯度的载体两性电解质是由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构物和同系物组成的。
载体两性电解质在凝胶中形成pH梯度的时间约为30分钟到1小时。
当蛋白质在电场中迁移到它的等电点位置时，本身没有净电荷，电场不能使其移动。
如有扩散，带有载体两性电解质的凝胶介质会使其荷电，阳、阴极则将重新吸引它回到等电点位置，因此蛋白质只能在它的等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的带。
这种“浓缩”或称“聚焦”效应使等电聚焦的分辨率大大高于常规电泳，是一向电泳中分辨率最高的电泳技术。
3.材料和方法3.1实验用品3.1.1样品及其处理胰蛋白酶（华美生物工程公司）、牛凝血酶（美国sigma分装，24.5U/mg，1000U）。
称取胰蛋白酶20mg，用重蒸水定容至10ml，制备成2mg/mL的胰蛋白酶样品。
根据牛凝血酶的比活力和分装的活力单位计算，可知酶的含量约为40mg，用20ml重蒸水将其溶解为2mg/ml的样品，分装成20份，于-20℃保存。
胰蛋白酶和牛凝血酶的溶解性都很好，溶解样品时无需再加入助溶剂。
3.1.2标准品及其处理等电点标准（英国Amersham Biosciences，pH3-10，235µg/vial），低分子量蛋白标准（英国Amersham Biosciences，分子量14.4kDa~97kDa，575µg/vial；中科院上海生化所，分子量14.4kDa~97.4kDa，40µg/种蛋白质）。
用100µL重蒸水溶解等电点标准，分装成10份，于-20℃保存，每次的上样量为10µL （3.25mg/ml）。
低分子量蛋白标准按使用说明书中的方法处理，分装后保存于-20℃。
3.1.3试剂乙醇（95%）、甲醇、冰醋酸、盐酸（6mol/L）、磷酸（1mol/L）、氢氧化钠（0.5mol/L，1mol/L）、磺基水杨酸、三氯乙酸、甘油、巯基乙醇。
（以上试剂除三氯乙酸为CP级、巯基乙醇为香港生产外，其它均系国产AR级。
）丙烯酰胺（美国sigma分装，电泳级，纯度：>99%）、甲叉双丙烯酰胺（瑞士Fluka）、过硫酸铵（华美生物工程公司）、TEMED（中科院上海生化所东风生化技术公司）、载体两性电解质（pH3~9.5，进口分装；pH5~7，北京科百奥生物科技有限公司）、考马斯亮蓝R250（瑞士Fluka分装）、甘氨酸（产地：上海，纯度：>99%），Tris Base（Promega Corporation）、SDS（sigma分装）、琼脂糖（华美生物工程公司）、溴酚蓝（北京化工厂）。
欲将干胶制作在玻璃板上，还要用到亲和硅烷和剥离硅烷。
3.1.4主要仪器和设备DYY-12C型电泳仪（北京市六一仪器厂）、DYCP-36型等电聚焦电泳槽（北京市六一仪器厂）、DYCZ-24D迷你垂直型电泳槽（北京市六一仪器厂）、层析实验冷柜（或恒温循环器）、酸度离子计（pH211）、脱色摇床、电子称、恒温培养箱、移液器。
3.1.5溶液的配制30%①凝胶单体贮液：等电聚焦电泳用C=3%的单体贮液：丙烯酰胺14.55g，甲叉双丙烯酰胺0.45g，重蒸水溶解，定容至50ml（4℃棕色瓶中，可保存两周）。
SDS-PAGE用C=2.6%的单体贮液：丙烯酰胺14.61g，甲叉双丙烯酰胺0.39g，重蒸水溶解，定容至50ml（4℃棕色瓶中，可保存两周）。
10%②SDS贮液：2.5gSDS溶于25ml重蒸水中（配制时需水浴加热以促溶解），室温保存。
20%③SDS贮液：5.0gSDS溶于25ml重蒸水中（配制时需水浴加热以促溶解），室温保存。
④电极液：pH3～9.5等电聚焦电泳电极液：阳极1mol/L H3PO4；阴极1mol/L NaOH。
pH5～7等电聚焦电极液：阳极0.5mol/L冰醋酸；阴极0.5mol/L NaOH。
SDS-PAGE电极液：每次用量以500ml计算，称取Tris Base 1.514g，甘氨酸7.207g，10%SDS贮液5ml,定容至500ml（pH 8.3，不用调pH值）。
SDS⑤-PAGE分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl 缓冲液）：称取Tris Base 18.171g，用6 mol/L 盐酸调pH值至8.9后，用重蒸水定容至100ml（4℃保存）。
SDS⑥-PAGE浓缩胶缓冲液（1.0mol/L Tris-HCl 缓冲液）：称取Tris Base 12.114g，用6 mol/L 盐酸调pH值至6.8后，用重蒸水定容至100ml（4℃保存）。
SDS⑦-PAGE上样缓冲液：称取SDS 1g，甘油5ml，巯基乙醇2.5ml，溴酚蓝2滴，浓缩胶缓冲液25ml，用重蒸水定容至50ml（4℃保存）。
⑧平衡液：巯基乙醇5ml，浓缩胶缓冲液6.25ml，20%SDS贮液11.5ml，甘油10ml，定容至100ml。
⑨固定液：35%甲醇（V/V），10%三氯乙酸（W/V），3.5%磺基水杨酸（W/V）。
⑩染色液：35%乙醇（95%）（V/V），10%冰醋酸（V/V），0.1%考马斯亮蓝R250（W/V），溶解后用滤纸过滤备用。
○11脱色液：25%乙醇（95%）（V/V），10%冰醋酸（V/V）。
○12保存液：10%甘油（V/V），25%乙醇（95%）（V/V），10%冰醋酸（V/V）。
○1310%过硫酸铵：0.1g过硫酸铵溶解于1ml重蒸水中，现用现配。
3.2方法和步骤通过3.0～9.5pH梯度胰蛋白酶等电点的测定，建立等电聚焦电泳的方法。
利用已建立的方法，经3.0～9.5pH梯度的测定，牛凝血酶等电点的范围在5～7，然后在5～7pH梯度的范围准确测定牛凝血酶的等电点。
因本实验中经5～7pH梯度的范围等电聚焦电泳后，牛凝血酶产生了13条带，故采用了双向电泳的方法（第二向：SDS-PAGE），从而以牛凝血酶相对分子质量为依据确定其条带和等电点。
3.2.1等电聚焦凝胶的配制和灌胶①凝胶的配制：按照表1-1的比例配制凝胶。
本实验采用T=5%的凝胶，每次灌胶时配制10ml 即可。
表1-1 等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶的配制溶液成分体积30%凝胶贮液/ml 1.7重蒸水/ml 7.675两性电解质/ml 0.625TEMED/µL 10 10%过硫酸铵/µL 25表1-2 SDS-PAGE凝胶的配制溶液成分分离胶浓缩胶T值7.5% 5% 30%凝胶贮液/ml 2.5 0.83 重蒸水/ml 4.8 3.4 分离胶缓冲液/ml 2.5 —浓缩胶缓冲液/ml—0.6310%SDS/µL 100 50 TEMED/µL 50 25 10%过硫酸铵/µL50 25 总体积/ml 10 5②灌胶：将玻璃板洗净晾干。
