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蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。
由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2一、实验目的1、学习蛋白质的两性反应；二、实验仪器pH计、电泳槽、电源、紫外分光光度计、比色皿、恒温水浴箱等。
三、实验原理蛋白质分子中含有大量的离子基团，它们可以接受或释放H+离子，从而表现出两性反应的特征。
根据pH的变化，蛋白质分子的电荷状态和溶解性都会发生改变。
不同蛋白质的两性反应的pH区间有所不同，但都表现出了一定的规律性。
一般来说，蛋白质的等电点（pI）即蛋白质分子带的净电荷等于零时的pH值。
在这个pH值附近，蛋白质分子的溶解度最低。
2、等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）是基于蛋白质分子的等电点原理，运用电场作用于溶液中的蛋白质使其向等电点运动，到达等电点时就不再运动，电场作用力为零，从而使蛋白质在等电点处聚焦。
该技术可以高效地将蛋白质分子分离开，并且不产生电荷的副反应。
IEF的缺点是需要高纯度的蛋白质样品和复杂的设备。
四、实验操作1、示范两性反应的现象制备两个100mL的肉汤。
其中一个加入适量的氢氧化钠溶液，并记录溶液的pH值。
将两个溶液放在一起，观察两溶液之间的相互作用。
2、测定牛血清白蛋白（BSA）的pI值将0.1g的BSA溶解于100mL的蒸馏水中，并调整pH至2.0。
加入适量的氢氧化钠溶液，逐渐增加溶液的pH值。
每次变化pH值0.5时，用pH计测定一次溶液的pH值，并记录BSA 对应的电泳距离。
将记录的数据制成曲线图。
由BSA的等电点的定义，等电点的pH值应该是曲线的最低点。
3、等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点（1）样品的制备制备10mL的蛋白质样品，如卵清蛋白（ovalbumin）、BSA、牛血浆血清白蛋白（BSC）、胰岛素等。
将蛋白质样品以蒸馏水稀释至10μg/μL。
（2）样品的前处理a. 加入10μL的pH 3-10缓冲液、10μL的非离子型洗涤剂和80μL的样品。
b. 活化酶处理：在样品中加入基质，辅助样品中蛋白酶的活化。
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感谢支持！(Thank you for downloading and checking it out!)蛋白质与蛋白质组学实验指南一、蛋白质组学基础蛋白质组学是一门综合性学科，旨在研究生物体内所有蛋白质的结构、功能、表达调控以及相互作用。
蛋白质组学研究对于揭示生物学过程中的分子机制、疾病发生发展规律以及药物作用机理具有重要意义。
本文将从蛋白质组学概述、蛋白质组学研究方法以及蛋白质组学应用领域三个方面进行介绍。
蛋白质组学概述蛋白质组学是在基因组学、转录组学和翻译组学的基础上发展起来的，它研究的是生物体内所有蛋白质的表达、修饰、相互作用以及功能。
蛋白质组学的发展涉及到多个学科，如生物信息学、生物技术、生物物理学和分子生物学等。
蛋白质组学研究对象不仅包括蛋白质的结构和功能，还包括蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质之间的相互作用等。
蛋白质组学研究方法蛋白质组学研究方法主要包括蛋白质分离、蛋白质鉴定、蛋白质定量以及蛋白质功能分析等。
在蛋白质分离方面，常用的技术有凝胶渗透色谱、离子交换色谱、亲和色谱等。
蛋白质鉴定主要采用质谱技术，通过测定蛋白质的肽质量指纹图谱来识别蛋白质。
蛋白质定量方法有西方印迹法、定量PCR等。
此外，蛋白质组学还可以采用蛋白质芯片技术、蛋白质蛋白质相互作用网络分析等方法来研究蛋白质的功能。
蛋白质组学应用领域蛋白质组学在多个领域具有广泛的应用，包括疾病机理研究、药物研发、生物标志物发现、个性化医疗等。
在疾病机理研究中，蛋白质组学可以帮助研究者发现与疾病相关的蛋白质及其相互作用网络，从而揭示疾病的发生发展规律。
等电聚焦电泳介绍点击次数：315 作者：佚名发表于：2008-08-07 00:00 转载请注明来自丁香园来源：互联网主要仪器试剂仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。
储存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）双－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；灌胶以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。
其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。
水：5.4ml；储存液1）：2.0 ml；载体两性电解质溶液pH3.5-10 48μl；载体两性电解质溶液pH4-6 240μl；超纯尿素 6.0 g ；10%过硫酸胺25μl； TEMED：20μl灌胶步骤：1.组装灌胶器；2.将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；3.加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；4.将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；5.插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；6.聚合约1小时；7.聚合完成，小心拔去梳子；8.将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。
注意：1.上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；2.现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.样品制备和上样一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15μl。
蛋白质等电点的测定实验报告一、实验目的1、了解蛋白质等电点的概念及其重要性。
2、掌握测定蛋白质等电点的基本原理和方法。
3、学会使用酸度计等仪器进行实验操作。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在溶液中会发生解离。
当蛋白质溶液处于某一 pH 值时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（pI）。
在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。
利用这一性质，可以通过调节溶液的 pH 值，使蛋白质沉淀，从而测定蛋白质的等电点。
本实验采用醋酸纤维素薄膜电泳法来测定蛋白质的等电点。
醋酸纤维素薄膜具有均一的微孔结构，对蛋白质分子的吸附作用小，电泳时泳动速度快，分辨率高。
在一定的电场强度下，不同 pH 值的缓冲溶液中，蛋白质分子会向与其所带电荷相反的电极方向移动。
当溶液的 pH值等于蛋白质的等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，泳动速度为零。
三、实验材料与仪器1、材料新鲜鸡蛋醋酸纤维素薄膜巴比妥缓冲液（pH 86、pH 74、pH 64、pH 54）蛋白质染色液（氨基黑 10B）漂洗液2、仪器电泳仪酸度计培养皿镊子剪刀直尺四、实验步骤1、醋酸纤维素薄膜的处理将醋酸纤维素薄膜剪成 2×8cm 的小条，在巴比妥缓冲液（pH 86）中浸泡 30 分钟，使其充分浸透。
用镊子取出薄膜，用滤纸吸干多余的缓冲液。
2、点样用毛细管吸取少量鸡蛋清样品，在薄膜的无光泽面距一端 15cm 处轻轻点样，点样宽度不超过 05cm。
3、电泳将点样后的薄膜光滑面朝下，搭在电泳槽的支架上，两端分别与电泳槽的正、负极相连。
在电泳槽中加入巴比妥缓冲液（pH 86），使薄膜完全浸没在缓冲液中。
接通电源，调节电压为 160V，电泳 40 分钟。
4、染色与漂洗电泳结束后，将薄膜取出，放入氨基黑 10B 染色液中染色 10 分钟。
取出薄膜，放入漂洗液中漂洗数次，直至背景无色，蛋白质条带清晰可见。
5、测定 pH 值分别配制 pH 74、pH 64、pH 54 的巴比妥缓冲液。
等电点聚焦测蛋白质等电点一．实验目的1. 了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。
二．实验原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF 实质就是在稳定的pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH 梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH 梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0 的区带，这时的pH 则是这种分子的pI 。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH 环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI 迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI 处得以“聚焦。
”三．实验步骤1. 凝胶制备按表1 的比例配制4ml 工作胶液，在真空干燥器中抽气10min 。
每组 4 管，每管加胶液1.8ml 。
混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm 处，在胶面上再覆盖3mm 厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min 即可聚合。
表1 凝胶工作液配比凝胶母液（丙烯酰胺30% ：甲叉双丙烯1ml酰胺0.8% ）10% 过硫酸铵0.02ml水 2.68ml载体两性电解液0.15ml蛋白样品液0.1ml,0.05mlTEMED 0.02ml2. 电泳吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。
于电泳槽下槽加入0.2 ％的500ml 硫酸作正极；上槽加入0.5 ％的800ml 乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为300V ，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min 后，停止电泳，全程约需3h 。
等电聚焦等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）目前已广泛用于蛋白质分析和制备中，是20世纪60年代后才迅速发展起来的重要技术。
IEF的基本原理是，在电泳槽中放入两性电解质，如脂肪族多氨基多羧酸（或磺酸型、羧酸磺酸混合型），pH 范围有3～10、4～6、5～7、6～8、7～9和8～10等。
电泳时，两性电解质形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，正极为酸性，负极为碱性。
蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中进行电泳。
样品可置于正极或负极任何一端。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。
当置于负极端时，因pH＞pI，蛋白质带负电向正极移动。
随着pH的下降，蛋白质负电荷量渐少，移动速度变慢。
当蛋白质移动到与其等电点相应pH 位置上时即停止，并聚集形成狭窄区带。
因此，IEF中蛋白质的分离取决于电泳pH梯度的分布和蛋白质的pI，而与蛋白质分子大小和形状无关。
IEF的优缺点。
优点：①分辨率很高，可把pI相差0. 01的蛋白质分开；②样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用。
③电泳结束后，可直接测定蛋白质pI。
④分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性。
缺点：①电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。
但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀，克服方法是在样品中多加些两性电解质。
②许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。
实验等电聚焦法测定蛋白质等电点一、原理等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是20世纪60年代建立起来的一种蛋白质分离分析手段，多年来发展很快，已成为单相电泳中具有最高分辨率的技术。
IEF的特点是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（AmPholine）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
1. 了解等电聚焦电泳（IEF）的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用等电聚焦电泳技术测定蛋白质的等电点（pI）。
3. 掌握实验操作技能，提高实验动手能力。
二、实验原理等电聚焦电泳（IEF）是一种利用pH梯度介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
其基本原理是在一个具有pH梯度的介质中，蛋白质分子根据其等电点在电场作用下向相应pH位置移动，直至聚焦于该位置。
蛋白质分子是两性电解质，其等电点（pI）是指蛋白质分子在溶液中呈电中性时的pH值。
在pH低于蛋白质的pI时，蛋白质分子带正电荷；在pH高于蛋白质的pI 时，蛋白质分子带负电荷。
在等电聚焦电泳过程中，当蛋白质分子移动到与其pI相等的pH位置时，其净电荷为零，停止移动，从而实现蛋白质的分离和聚焦。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：毛细管电泳仪、恒温水浴、pH计、移液器、超纯水系统等。
2. 试剂：蛋白质样品、两性电解质载体、尿素、磷酸、氢氧化钠、乙酸等。
四、实验步骤1. 准备样品：取适量蛋白质样品，加入适量两性电解质载体，制成蛋白质溶液。
2. 制备pH梯度：根据蛋白质的pI值，配制相应的pH梯度介质，置于毛细管中。
3. 样品上样：将制备好的蛋白质溶液加入毛细管中，注意避免气泡产生。
4. 设置参数：根据仪器要求，设置电泳电压、温度、时间等参数。
5. 运行实验：开启毛细管电泳仪，开始电泳实验。
6. 数据采集：实验结束后，采集数据，分析蛋白质的等电点。
五、结果与分析1. 根据实验数据，绘制蛋白质的迁移曲线，分析其等电点。
2. 与理论值进行比较，评估实验结果的准确性。
1. 等电聚焦电泳是一种有效的蛋白质分离和鉴定技术，具有分辨率高、操作简便等优点。
2. 通过本次实验，掌握了等电聚焦电泳的操作步骤，提高了实验动手能力。
3. 在实验过程中，需要注意以下几点：a. 精确配制pH梯度介质，确保pH梯度均匀。
b. 避免气泡产生，影响实验结果。
c. 严格控制实验参数，确保实验结果的准确性。
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高,重复性好,样品容量大，操作简便迅速,在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用.蛋白质分子是典型的两性电解质分子.它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子,向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中,即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下,不管这些蛋白质分子的原始分布如何,各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦"。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦,从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体,实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB 公司生产的Ampholine 和Pharmalyte,价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）6－8％尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
蛋白质等电点测定实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过等电点测定方法，确定蛋白质在不同 pH 条件下的等电点，并了解蛋白质在等电点时的电荷状态，为进一步研究蛋白质的性质和功能提供实验数据。
二、实验原理。
蛋白质的等电点是指在特定 pH 条件下，蛋白质带有的正负电荷相互抵消，呈电中性的状态。
当 pH 值等于蛋白质的等电点时，蛋白质呈等电点状态。
在等电点附近，蛋白质的电荷状态发生变化，可通过等电点电泳或等电点测定方法进行测定。
三、实验步骤。
1. 制备蛋白质溶液，取一定量的蛋白质样品，溶解于不同 pH 值的缓冲液中，制备不同 pH 条件下的蛋白质溶液。
2. 进行等电点电泳，将制备好的蛋白质溶液加载到等电点电泳仪中，根据蛋白质的等电点进行电泳分离。
3. 测定蛋白质的等电点，根据电泳结果，确定蛋白质在不同 pH 条件下的等电点。
四、实验结果与分析。
通过实验测定，得到了蛋白质在不同pH 条件下的等电点数据。
根据实验结果，可以得出蛋白质在等电点附近呈电中性状态，电泳图上呈现水平移动的状态。
在等电点附近，蛋白质的电荷状态发生变化，呈现出不同的电泳迁移率。
实验结果表明，蛋白质在不同 pH 条件下具有不同的电荷状态，进一步说明了蛋白质的电荷性质与pH 值的关系。
五、实验总结。
通过本次实验，我们成功地测定了蛋白质在不同 pH 条件下的等电点，并了解了蛋白质在等电点时的电荷状态。
这些数据为我们进一步研究蛋白质的性质和功能提供了重要的实验基础。
同时，实验过程中也发现了一些问题，例如在制备蛋白质溶液时需注意 pH 值的准确性，以及在等电点电泳过程中需要控制好电泳条件，以确保实验结果的准确性。
综上所述，蛋白质等电点测定实验为我们深入了解蛋白质的电荷性质提供了重要的实验数据，为进一步研究蛋白质的性质和功能奠定了基础。
希望通过本次实验，能够对蛋白质等电点测定方法有更深入的了解，为相关领域的研究工作提供有益的参考。
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定[2]一、实验目的2. 掌握测定蛋白质等电点的方法。
二、实验原理1. 蛋白质的两性反应蛋白质是一种复杂的高分子有机化合物，其分子中有许多含酸、含碱基的氨基酸残基。
因此，蛋白质具有两性反应。
当 pH 低于一个特定值时，氨基酸上的氨基质子化，成为带正电荷的离子型，蛋白质带正电；当 pH 高于另一个特定值时，氨基酸上的羧基失去质子，形成带负电荷的离子型，蛋白质带负电。
在这两个特定的 pH 值之间，蛋白质带有等量的正离子和负离子，呈等电点状态。
（1）等电聚焦法等电聚焦法是一种利用直流电场将蛋白质分离的方法。
在等电点时，蛋白质的总电荷为零，不受电场作用，停留在等电点位置，实现蛋白质的分离。
这种方法分辨率高、分离效率好，但设备复杂、操作难度大。
（2）等电点电泳法等电点电泳法是一种利用凝胶电泳原理测定蛋白质等电点的方法。
该方法在凝胶中涂上不同 pH 值的缓冲剂，形成不同 pH 值的电泳区，通过一定时间的电泳分离，观察蛋白质的运动位置，即可确定其等电点。
该方法比较简单、直观，分辨率较低。
三、实验步骤1. 预处理（1）将新鲜鸡蛋清取下，放在常温下静置 30 min，去除蛋清表面的泡沫和浮沫。
（2）采用冷环境离心机，将鸡蛋清离心 10 min，离心后取上清。
（1）将 1 mL 蛋清溶液分别加入 7 个不同 pH 值的缓冲溶液中，分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。
（2）观察各实验管中的蛋清溶液的颜色变化。
（1）将 0.2 mL 蛋清溶液加入 4 mL 聚丙烯酰胺凝胶缓冲液中，混合均匀倒入凝胶板中。
（2）试管中加入 3 mL 结晶紫染色溶液（10^-3 M），将凝胶板浸泡在染色溶液中，染色 30 min 后，倒掉染色溶液，用蒸馏水清洗凝胶板几次，至染色液流出凝胶板没有颜色为止。
（3）取出凝胶板，用透明胶带覆盖红色刻度线，用间隔开的两条直线将凝胶板对折，压平，用剪刀从中央向两侧剪开，取下其中一块凝胶，放入测定盒中，插上电极进行电泳。
实验五等电点聚焦测蛋白质等电点
Mangogola
等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要进展，其实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
IEF的关键是得到一定范围内的稳定pH梯度，即找到合适的两性载体。
载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧基的同系物和异构物的混合物，其氨基和羧基的比例不同，使pH和pI相异、相近。
经过适当电泳时间后，两性电解质将依等电点递增的次序在支持物中从正极到负极彼此相互衔接，形成一平滑稳定的pH梯度。
蛋白质靠近正极在低于其pI的环境中带正电荷，向负极移动，反之则向相反方向移动，最终停在其pI处。
聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离等电点分子因pH的改变而重新带上正或负电荷，从而又向pI迁移。
最后测出蛋白质停留位置的pH即为该蛋白质的pH。
一．实验过程
1.圆柱体凝胶制备
用封口膜将玻管[D4×120mm]的一端封口，将玻管套上橡胶塞放置在支架上，加入凝胶至10cm处（注意摇动玻管，震出底部气泡），轻轻铺上一层双蒸水，放置聚合1h。
凝胶T=%，C=%，共4mL
30%Acr，%Bis 1mL
10%过硫酸铵
双蒸水
载体两性电解质
样品液（BSA-10mg/mL）
样品液（肌红蛋白-5mg/mL）
TEMED
共作三支管，每管加胶液约
2.聚焦电泳
在电泳下槽注入%硫酸500mL，将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳上槽(注意塞紧所有孔，以防电极液下漏)，加入上槽溶液%乙醇胺约1000mL（注意排除凝胶下表面的气泡，凝胶上下表面都要接触电极液）。
接上电源，正极接酸，负极接碱，恒压160V至电流为0，再继续通电20min。
3.蛋白质染色及等电点测定
用注射器向胶管注水取出胶条，测量胶体总长度及肌红蛋白距酸端（碱端）距离。
将其中一胶条放在玻璃板上用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入装有2mL10mM的KCl溶液中，
浸泡过夜，次日用pH计测每支管中的pH值。
另外两只胶条在三氯乙酸中浸泡，等出现灰
色条带时量总长及其距酸端（碱端）距离。
二．数据记录和处理
1.标准曲线绘制
初始数据如下表：
标号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 pH值
由于存在碱端漂移，舍去前三个数据，将其余数据对凝胶长度作图，得标准曲线如下图：
即所得的标准曲线为计算样品等电点 总长/cm 1肌红蛋白距碱端距离/cm 2BSA 距碱端距离/cm
d1/cm d2/cm 胶条1 胶条2 8
注：d=
将胶条1和胶条2数据带入求平均值得： 肌红蛋白的等电点pI=；BSA 的等电点pI=。
三．注意事项
1.本实验凝胶选用化学聚合方法，而没有采用核黄素，是因为核黄素很难溶于水，经常失效，光照不合适难以聚合。
2.灌胶时要快速细致，出现气泡要及时将其弹震出去。
3.剥取胶时应将针头紧贴玻璃管壁，边向下延伸边注水，小心剥取。
4.剥出的胶条放置在平皿中，要及时吸干周围的水分，防止其中电解质溶解出来。
13
胶条总长
样品距碱端距离。
