实验五 等电聚焦测蛋白质等电点

蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。

初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。

二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。

在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。

在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。

对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。

最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。

根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。

其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。

由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。

离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。

紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。

其余反离子则构成扩散层。

滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。

滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。

固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。

ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。

一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。

对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。

实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2一、实验目的1、学习蛋白质的两性反应；二、实验仪器pH计、电泳槽、电源、紫外分光光度计、比色皿、恒温水浴箱等。

三、实验原理蛋白质分子中含有大量的离子基团，它们可以接受或释放H+离子，从而表现出两性反应的特征。

根据pH的变化，蛋白质分子的电荷状态和溶解性都会发生改变。

不同蛋白质的两性反应的pH区间有所不同，但都表现出了一定的规律性。

一般来说，蛋白质的等电点（pI）即蛋白质分子带的净电荷等于零时的pH值。

在这个pH值附近，蛋白质分子的溶解度最低。

2、等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）是基于蛋白质分子的等电点原理，运用电场作用于溶液中的蛋白质使其向等电点运动，到达等电点时就不再运动，电场作用力为零，从而使蛋白质在等电点处聚焦。

该技术可以高效地将蛋白质分子分离开，并且不产生电荷的副反应。

IEF的缺点是需要高纯度的蛋白质样品和复杂的设备。

四、实验操作1、示范两性反应的现象制备两个100mL的肉汤。

其中一个加入适量的氢氧化钠溶液，并记录溶液的pH值。

将两个溶液放在一起，观察两溶液之间的相互作用。

2、测定牛血清白蛋白（BSA）的pI值将0.1g的BSA溶解于100mL的蒸馏水中，并调整pH至2.0。

加入适量的氢氧化钠溶液，逐渐增加溶液的pH值。

每次变化pH值0.5时，用pH计测定一次溶液的pH值，并记录BSA 对应的电泳距离。

将记录的数据制成曲线图。

由BSA的等电点的定义，等电点的pH值应该是曲线的最低点。

3、等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点（1）样品的制备制备10mL的蛋白质样品，如卵清蛋白（ovalbumin）、BSA、牛血浆血清白蛋白（BSC）、胰岛素等。

将蛋白质样品以蒸馏水稀释至10μg/μL。

（2）样品的前处理a. 加入10μL的pH 3-10缓冲液、10μL的非离子型洗涤剂和80μL的样品。

b. 活化酶处理：在样品中加入基质，辅助样品中蛋白酶的活化。

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感谢支持！(Thank you for downloading and checking it out!)蛋白质与蛋白质组学实验指南一、蛋白质组学基础蛋白质组学是一门综合性学科，旨在研究生物体内所有蛋白质的结构、功能、表达调控以及相互作用。

蛋白质组学研究对于揭示生物学过程中的分子机制、疾病发生发展规律以及药物作用机理具有重要意义。

本文将从蛋白质组学概述、蛋白质组学研究方法以及蛋白质组学应用领域三个方面进行介绍。

蛋白质组学概述蛋白质组学是在基因组学、转录组学和翻译组学的基础上发展起来的，它研究的是生物体内所有蛋白质的表达、修饰、相互作用以及功能。

蛋白质组学的发展涉及到多个学科，如生物信息学、生物技术、生物物理学和分子生物学等。

蛋白质组学研究对象不仅包括蛋白质的结构和功能，还包括蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质之间的相互作用等。

蛋白质组学研究方法蛋白质组学研究方法主要包括蛋白质分离、蛋白质鉴定、蛋白质定量以及蛋白质功能分析等。

在蛋白质分离方面，常用的技术有凝胶渗透色谱、离子交换色谱、亲和色谱等。

蛋白质鉴定主要采用质谱技术，通过测定蛋白质的肽质量指纹图谱来识别蛋白质。

蛋白质定量方法有西方印迹法、定量PCR等。

此外，蛋白质组学还可以采用蛋白质芯片技术、蛋白质蛋白质相互作用网络分析等方法来研究蛋白质的功能。

蛋白质组学应用领域蛋白质组学在多个领域具有广泛的应用，包括疾病机理研究、药物研发、生物标志物发现、个性化医疗等。

在疾病机理研究中，蛋白质组学可以帮助研究者发现与疾病相关的蛋白质及其相互作用网络，从而揭示疾病的发生发展规律。

等电聚焦电泳介绍点击次数：315 作者：佚名发表于：2008-08-07 00:00 转载请注明来自丁香园来源：互联网主要仪器试剂仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。

储存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）双－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；灌胶以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。

其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。

水：5.4ml；储存液1）：2.0 ml；载体两性电解质溶液pH3.5-10 48μl；载体两性电解质溶液pH4-6 240μl；超纯尿素 6.0 g ；10%过硫酸胺25μl； TEMED：20μl灌胶步骤：1.组装灌胶器；2.将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；3.加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；4.将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；5.插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；6.聚合约1小时；7.聚合完成，小心拔去梳子；8.将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。

注意：1.上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；2.现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.样品制备和上样一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15μl。

蛋白质等电点的测定实验报告一、实验目的1、了解蛋白质等电点的概念及其重要性。

2、掌握测定蛋白质等电点的基本原理和方法。

3、学会使用酸度计等仪器进行实验操作。

二、实验原理蛋白质是两性电解质，在溶液中会发生解离。

当蛋白质溶液处于某一 pH 值时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（pI）。

在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。

利用这一性质，可以通过调节溶液的 pH 值，使蛋白质沉淀，从而测定蛋白质的等电点。

本实验采用醋酸纤维素薄膜电泳法来测定蛋白质的等电点。

醋酸纤维素薄膜具有均一的微孔结构，对蛋白质分子的吸附作用小，电泳时泳动速度快，分辨率高。

在一定的电场强度下，不同 pH 值的缓冲溶液中，蛋白质分子会向与其所带电荷相反的电极方向移动。

当溶液的 pH值等于蛋白质的等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，泳动速度为零。

三、实验材料与仪器1、材料新鲜鸡蛋醋酸纤维素薄膜巴比妥缓冲液（pH 86、pH 74、pH 64、pH 54）蛋白质染色液（氨基黑 10B）漂洗液2、仪器电泳仪酸度计培养皿镊子剪刀直尺四、实验步骤1、醋酸纤维素薄膜的处理将醋酸纤维素薄膜剪成 2×8cm 的小条，在巴比妥缓冲液（pH 86）中浸泡 30 分钟，使其充分浸透。

用镊子取出薄膜，用滤纸吸干多余的缓冲液。

2、点样用毛细管吸取少量鸡蛋清样品，在薄膜的无光泽面距一端 15cm 处轻轻点样，点样宽度不超过 05cm。

3、电泳将点样后的薄膜光滑面朝下，搭在电泳槽的支架上，两端分别与电泳槽的正、负极相连。

在电泳槽中加入巴比妥缓冲液（pH 86），使薄膜完全浸没在缓冲液中。

接通电源，调节电压为 160V，电泳 40 分钟。

4、染色与漂洗电泳结束后，将薄膜取出，放入氨基黑 10B 染色液中染色 10 分钟。

取出薄膜，放入漂洗液中漂洗数次，直至背景无色，蛋白质条带清晰可见。

5、测定 pH 值分别配制 pH 74、pH 64、pH 54 的巴比妥缓冲液。

等电点聚焦测蛋白质等电点一．实验目的1. 了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。

二．实验原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF 实质就是在稳定的pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。

在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH 梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH 梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0 的区带，这时的pH 则是这种分子的pI 。

聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。

一旦偏离其等电点后，由于pH 环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI 迁移。

因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI 处得以“聚焦。

”三．实验步骤1. 凝胶制备按表1 的比例配制4ml 工作胶液，在真空干燥器中抽气10min 。

每组 4 管，每管加胶液1.8ml 。

混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm 处，在胶面上再覆盖3mm 厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min 即可聚合。

表1 凝胶工作液配比凝胶母液（丙烯酰胺30% ：甲叉双丙烯1ml酰胺0.8% ）10% 过硫酸铵0.02ml水 2.68ml载体两性电解液0.15ml蛋白样品液0.1ml,0.05mlTEMED 0.02ml2. 电泳吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。

于电泳槽下槽加入0.2 ％的500ml 硫酸作正极；上槽加入0.5 ％的800ml 乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为300V ，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min 后，停止电泳，全程约需3h 。

等电聚焦等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）目前已广泛用于蛋白质分析和制备中，是20世纪60年代后才迅速发展起来的重要技术。

IEF的基本原理是，在电泳槽中放入两性电解质，如脂肪族多氨基多羧酸（或磺酸型、羧酸磺酸混合型），pH 范围有3～10、4～6、5～7、6～8、7～9和8～10等。

电泳时，两性电解质形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，正极为酸性，负极为碱性。

蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中进行电泳。

样品可置于正极或负极任何一端。

在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。

当置于负极端时，因pH＞pI，蛋白质带负电向正极移动。

随着pH的下降，蛋白质负电荷量渐少，移动速度变慢。

当蛋白质移动到与其等电点相应pH 位置上时即停止，并聚集形成狭窄区带。

因此，IEF中蛋白质的分离取决于电泳pH梯度的分布和蛋白质的pI，而与蛋白质分子大小和形状无关。

IEF的优缺点。

优点：①分辨率很高，可把pI相差0. 01的蛋白质分开；②样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用。

③电泳结束后，可直接测定蛋白质pI。

④分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性。

缺点：①电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。

但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀，克服方法是在样品中多加些两性电解质。

②许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。

实验等电聚焦法测定蛋白质等电点一、原理等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是20世纪60年代建立起来的一种蛋白质分离分析手段，多年来发展很快，已成为单相电泳中具有最高分辨率的技术。

IEF的特点是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（AmPholine）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。