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等电聚焦（isoelectric focusing , IEF ）目前已广泛用于蛋白质分析和制备中， 是 20 世纪 60 年代后才迅速发展起来的重要技术。
IEF 的基本原理是，在电泳槽 中放入两性电解质,如脂肪族多氨基多羧酸（或磺酸型、羧酸磺酸混合型） , pH 范围有3〜10、4〜6 5〜7、6〜8 7〜9和8〜10等。
电泳时，两性电解质形成 一个由阳极到阴极逐步增加的 pH 梯度,正极为酸性,负极为碱性。
蛋白质分子 是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性 pH 梯度中进行电泳。
样 品可置于正极或负极任何一端。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的 pH 环 境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的 pH 环境中以阳离子形式向负 极移动。
当置于负极端时，因pH >pI ，蛋白质带负电向正极移动。
随着pH 的下 降，蛋白质负电荷量渐少，移动速度变慢。
当蛋白质移动到与其等电点相应 pH 位置上时即停止，并聚集形成狭窄区带。
因此， IEF 中蛋白质的分离取决于电泳 pH 梯度的分布和蛋白质的pl ,而与蛋白质分子大小和形状无关。
IEF 的优缺点。
优点：①分辨率很高，可把 pI 相差0. 01的蛋白质分开；② 样品可混入胶中或加在任何位置， 在电场中随着电泳的进行区带越来越窄， 克服 了一般电泳的扩散作用。
③电泳结束后，可直接测定蛋白质 pl 。
④分离速度快， 蛋白质可保持原有生物活性。
缺点： ①电泳中应使用无盐样品溶液， 否则高压中 电流太大而发热。
但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀， 克服方法是在样 品中多加些两性电解质。
②许多蛋白质在 pI 附近易沉淀而影响分离效果，可加 些脲或非离子去垢剂解决。
一、基本原理（1） 人工 pH 梯度：在分离蛋白质时常用一个直立的性，以蔗糖密度梯度 防止对流。
当两个不同pH 的缓冲液互相扩散时，在其混合区间即形成pH 梯度， 称为“人工 pH 梯度”。
蛋白质双向电泳注意点
蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing, IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按亚基分子量大小进行分离。
经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
注意事项：
1. 一向聚焦与二向电泳之间需要平衡，时间视蛋白质的性质而定，一般为10min，最多不超过15min。
2. 过量的上样量会引起双向图形畸形，特别在一向聚焦时，当样品浓度超过5mg时，则蛋白质凝聚和沉淀，使二向时产生水平和垂直条纹。
3. 含尿素的试剂均应避免过高的温度处理，一般不要超过30℃，否则尿素分解产生异硫氰酸盐会引起羧基甲酰化而导致电荷不均一性。
4. 第一向中过量的去污剂会严重影响双向电泳图谱，因此聚焦完毕进行平衡前，用双蒸馏水冲洗胶条，以除去残留的去污剂。
5. 双向电泳中双向凝胶间的界面紧密接触非常重要，如果接触不好或者两者之间留有气泡，则导致转移时分子扩散。
6. 双向电泳中的条纹现象是常见的问题。
水平条纹可能与一向电泳时间不够，聚焦不好有关，或者在加样处产生沉淀和引起重新溶解所致；纵向条纹则表明样品没溶解，这可以通过调整样品量，增加电泳时间，改善样品的溶解状态，同时在加样前通过高速离心以除掉所有不溶物。
icief的检测原理ICIEF全称为等电点异电聚焦电泳，是基于蛋白质等电点的差异而进行的一种电泳分离技术，广泛应用于蛋白质药物研发、体外和体内性质研究等领域。
以下是ICIEF的检测原理及步骤。
1. 原理ICIEF的原理是利用全自动等电点聚焦电泳仪对样品中蛋白质等电点进行分离。
等电点是指蛋白质带电量为零时的pH值，而异电点则是指带电量正负相等的蛋白质在一定的pH值下呈现出不同的电荷状态。
ICIEF通过将样品中的蛋白质在pH梯度中进行电泳分离，进而获得蛋白质的等电点和异电点等信息，实现对样品的分离和分析。
2. 步骤（1）样品准备：将待检测的蛋白质样品进行预处理，如加入缓冲液、去除杂质等，以确保样品质量的精准和稳定。
（2）试剂制备：制备等电点聚焦电泳所需的缓冲液、样品浸泡液等，在实验室中准备好。
（3）电泳分离：将样品在电泳仪中进行分离，先将试管中的样品放入等电点聚集层，然后采用电场作用将样品分离到等电点的对应位置上。
经过异电点聚焦电泳、固定化定位等步骤，得到以等电点或异电点为参照标记的蛋白质荧光图谱。
（4）图像处理：将得到的蛋白质荧光图谱进行数据提取和峰和面积计算等处理，进而得到蛋白质的等电点和异电点等自身性质。
（5）数据分析：根据处理得到的荧光特征图谱数据，通过ITC或DSC等热化学实验或计算方法，对样品中的蛋白质等电点和异电点等性质进行更加深入的分析和研究。
总之，ICIEF是一种基于蛋白质等电点差异的一种高分辨率分离技术。
它在蛋白质药物研发与生产等方面都有广泛应用，可以快速高效地进行蛋白质荧光特征分析和等电点测定，准确地获取样品中的蛋白质等电点和异电点等自身性质，帮助研究人员更好地了解和研究蛋白质药物的性质和特征，从而推动药物研发和创新发展。
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
蛋白质分子是典型的两性电解质分子。
它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性184电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
等电点聚焦电泳等电点聚焦电泳（Isoelectric Focusing，简称IEF）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
它基于蛋白质在特定条件下在电场中的移动速度与其等电点相关的原理，能够将混合蛋白质样品分离成不同的带状区域，从而实现对蛋白质的纯化和分析。
等电点是指蛋白质在电场中呈等电状态的pH值。
蛋白质在不同的pH值下带有正电荷或负电荷，当蛋白质的等电点与运行缓冲液的pH值相等时，蛋白质净电荷为零，停止运动。
这时，蛋白质会聚焦在等电点处，形成锐利的带状区域。
在进行等电点聚焦电泳实验时，先将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，凝胶中存在着一种称为聚丙烯酰胺的高分子物质，它能够提供电泳的通道。
然后，在两端施加电场，使蛋白质在凝胶中向两极运动。
同时，凝胶中的pH值梯度能够使蛋白质在移动过程中逐渐接近其等电点，最终停留在等电点处。
等电点聚焦电泳的优势在于能够分离各种不同等电点的蛋白质，从而实现高分辨率的蛋白质分析。
它可以用于研究蛋白质的异构体、修饰和突变等信息，对于蛋白质组学研究、生物药物的质量控制等具有重要意义。
在等电点聚焦电泳中，pH梯度的建立是关键步骤之一。
常用的方法包括使用缓冲液体系和添加胶体等。
缓冲液体系可以通过选择不同的酸碱成分和浓度来调节pH梯度的范围和形状；而添加胶体则能够改变凝胶中的离子浓度分布，从而调节蛋白质的电泳速度。
等电点聚焦电泳的结果可以通过染色或质谱等方法进行检测和分析。
染色方法可以使用酸性、碱性或中性染料，如银染色、Coomassie 蓝染色等，以可视化蛋白质的带状区域。
质谱分析则可以进一步确定蛋白质的分子量和序列等信息。
除了等电点聚焦电泳，还有其他一些蛋白质分离和分析技术，如SDS-PAGE、凝胶过滤层析、离子交换层析等。
这些方法在不同的情况下可以互补使用，以实现更全面的蛋白质分析。
等电点聚焦电泳是一种基于蛋白质等电点的分离和分析技术。
它通过建立pH梯度，在电场中将蛋白质聚焦在等电点处，实现高分辨率的蛋白质分离。
等电聚焦电泳技术在蛋白质研究中的应用随着生物技术研究的发展，蛋白质研究成为了生物学领域中的一个热门研究方向。
而等电聚焦电泳技术（isoelectric focusing, IEF）则成为了一种非常重要的蛋白质分离技术之一。
本文将介绍等电聚焦电泳技术在蛋白质研究中的应用，并探讨其在该领域中的意义和挑战。
等电聚焦电泳技术是一种基于蛋白质等电点差异的分离方法。
所谓等电点，是指蛋白质在特定条件下具有等电荷的状态，即净电荷为零。
而等电聚焦电泳就是利用电场的作用将蛋白质在胶体中移动，直至达到等电点所在位置停止运动。
这种技术的主要优势在于其高分辨率和高效率，能够有效地分离蛋白质混合物中具有微小等电点差异的成分。
首先，等电聚焦电泳技术在蛋白质研究中的一大应用是在蛋白质组学研究中的蛋白质分离和定量分析。
蛋白质组学是一门旨在研究生物体内所有蛋白质的种类、结构和功能的科学，而等电聚焦电泳则是其中一种重要的蛋白质分离技术。
通过等电聚焦电泳技术，我们可以将复杂的蛋白质混合物进行高效分离，获得不同pH值下的蛋白质谱带图谱。
这为后续的质谱分析和蛋白质鉴定提供了基础。
其次，等电聚焦电泳技术在疾病诊断和治疗中也有着重要的应用价值。
疾病的发生与蛋白质异常表达密切相关，因此研究蛋白质组学能够帮助我们更好地理解疾病的发生机制。
等电聚焦电泳技术在诊断疾病时，能够帮助我们发现和鉴定蛋白质异常表达的情况，从而为疾病的早期诊断提供依据。
此外，等电聚焦电泳技术还可以用来筛选和鉴定疾病标志物，为疾病的治疗和预后评估提供指导。
此外，等电聚焦电泳技术还在蛋白质结构和功能研究中发挥着重要作用。
蛋白质的结构和功能密切相关，而等电聚焦电泳技术可以帮助我们分离不同等电点的蛋白质，进一步研究其结构和功能特性。
通过等电聚焦电泳技术，我们可以对蛋白质进行进一步的研究，包括电泳迁移率差异、翻译后修饰、蛋白质亚型和蛋白-蛋白相互作用等。
尽管等电聚焦电泳在蛋白质研究中具有广泛的应用前景，但也存在一些挑战。
等电聚焦等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）目前已广泛用于蛋白质分析和制备中，是20世纪60年代后才迅速发展起来的重要技术。
IEF的基本原理是，在电泳槽中放入两性电解质，如脂肪族多氨基多羧酸（或磺酸型、羧酸磺酸混合型），pH 范围有3～10、4～6、5～7、6～8、7～9和8～10等。
电泳时，两性电解质形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，正极为酸性，负极为碱性。
蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中进行电泳。
样品可置于正极或负极任何一端。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。
当置于负极端时，因pH＞pI，蛋白质带负电向正极移动。
随着pH的下降，蛋白质负电荷量渐少，移动速度变慢。
当蛋白质移动到与其等电点相应pH 位置上时即停止，并聚集形成狭窄区带。
因此，IEF中蛋白质的分离取决于电泳pH梯度的分布和蛋白质的pI，而与蛋白质分子大小和形状无关。
IEF的优缺点。
优点：①分辨率很高，可把pI相差0. 01的蛋白质分开；②样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用。
③电泳结束后，可直接测定蛋白质pI。
④分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性。
缺点：①电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。
但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀，克服方法是在样品中多加些两性电解质。
②许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。
实验等电聚焦法测定蛋白质等电点一、原理等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是20世纪60年代建立起来的一种蛋白质分离分析手段，多年来发展很快，已成为单相电泳中具有最高分辨率的技术。
IEF的特点是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（AmPholine）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
1. 了解等电聚焦电泳（IEF）的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用等电聚焦电泳技术测定蛋白质的等电点（pI）。
3. 掌握实验操作技能，提高实验动手能力。
二、实验原理等电聚焦电泳（IEF）是一种利用pH梯度介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
其基本原理是在一个具有pH梯度的介质中，蛋白质分子根据其等电点在电场作用下向相应pH位置移动，直至聚焦于该位置。
蛋白质分子是两性电解质，其等电点（pI）是指蛋白质分子在溶液中呈电中性时的pH值。
在pH低于蛋白质的pI时，蛋白质分子带正电荷；在pH高于蛋白质的pI 时，蛋白质分子带负电荷。
在等电聚焦电泳过程中，当蛋白质分子移动到与其pI相等的pH位置时，其净电荷为零，停止移动，从而实现蛋白质的分离和聚焦。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：毛细管电泳仪、恒温水浴、pH计、移液器、超纯水系统等。
2. 试剂：蛋白质样品、两性电解质载体、尿素、磷酸、氢氧化钠、乙酸等。
四、实验步骤1. 准备样品：取适量蛋白质样品，加入适量两性电解质载体，制成蛋白质溶液。
2. 制备pH梯度：根据蛋白质的pI值，配制相应的pH梯度介质，置于毛细管中。
3. 样品上样：将制备好的蛋白质溶液加入毛细管中，注意避免气泡产生。
4. 设置参数：根据仪器要求，设置电泳电压、温度、时间等参数。
5. 运行实验：开启毛细管电泳仪，开始电泳实验。
6. 数据采集：实验结束后，采集数据，分析蛋白质的等电点。
五、结果与分析1. 根据实验数据，绘制蛋白质的迁移曲线，分析其等电点。
2. 与理论值进行比较，评估实验结果的准确性。
1. 等电聚焦电泳是一种有效的蛋白质分离和鉴定技术，具有分辨率高、操作简便等优点。
2. 通过本次实验，掌握了等电聚焦电泳的操作步骤，提高了实验动手能力。
3. 在实验过程中，需要注意以下几点：a. 精确配制pH梯度介质，确保pH梯度均匀。
b. 避免气泡产生，影响实验结果。
c. 严格控制实验参数，确保实验结果的准确性。
等电聚焦[IEF]电泳技术等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。
⒈IEF的基本原理在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH 值逐渐增大。
如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。
同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。
可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
⒉pH梯度的组成pH梯度的组成方式有二种，一种是人工pH梯度，由于其不稳定，重复性差，现已不再使用。
另一种是天然pH梯度。
天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在正极端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢氧化钠、氨水等。
电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。
电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。
由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。
pH稍高的第二种两性电解质，其等电点为pI2，也移向正极，由于pI2＞pI1，因此定位于第一种两性电解质之后，这样，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列，形成了从正极到负极等电点递增，由低到高的线性pH梯度，如图16-3所示。
等电聚焦电泳（Isoelectric Focusing Electrophoresis，简称IEF）是一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质分子的电泳技术。
它是生物化学和分子生物学领域中常用的一种重要的蛋白质分离方法，广泛应用于蛋白质组学、生物制药、临床诊断等领域。
等电聚焦电泳的原理是根据蛋白质分子的等电点（pI）不同，在具有连续pH梯度的介质中进行电泳分离。
蛋白质分子的等电点是指其电荷为零时所处的pH值。
由于蛋白质分子中含有可解离的氨基酸残基，如酸性氨基酸（Asp、Glu）和碱性氨基酸（Lys、Arg），因此蛋白质分子在一定条件下可以带正电荷或负电荷。
当溶液的pH值等于蛋白质分子的等电点时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，净电荷为零，此时蛋白质分子在电场中不发生移动。
在等电聚焦电泳过程中，首先将待分离的蛋白质样品加入到具有连续pH 梯度的凝胶介质中，然后施加直流电压使样品中的蛋白质分子根据其等电点在凝胶中迁移。
由于凝胶介质具有连续的pH梯度，蛋白质分子会迁移到与其等电点相对应的pH区域并停止移动。
经过一段时间的电泳，各种蛋白质分子根据其等电点分布在不同的pH区域，从而实现了蛋白质的分离。
等电聚焦电泳具有分辨率高、重复性好、样品用量少等优点，尤其适用于复杂蛋白质样品的分离。
然而，该方法的缺点是操作过程较为繁琐，需要较长的时间进行电泳分离，且对设备和试剂的要求较高。
尽管如此，等电聚焦电泳仍然是生物化学和分子生物学研究中不可或缺的重要技术手段。
在等电聚焦电泳过程中，凝胶介质的选择至关重要。
常用的凝胶介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和纤维素凝胶等。
其中，聚丙烯酰胺凝胶是目前最常用的凝胶介质，具有较高的分辨率和较好的稳定性。
琼脂糖凝胶则具有良好的透明度和生物相容性，适用于生物制药领域。
纤维素凝胶则具有较好的机械强度和较低的成本，适用于大规模生产。
此外，为了提高等电聚焦电泳的分离效果，还可以采用多种策略对凝胶介质进行处理。
等点聚焦电泳等点聚焦电泳（Isoelectric Focusing，简称IEF）是一种基于蛋白质等电点差异的分离技术。
它能够将样品中的蛋白质按照等电点的大小进行分离，从而实现蛋白质的高分辨率分离。
本文将介绍等点聚焦电泳的原理、操作步骤及其在生物学研究中的应用。
一、原理等点聚焦电泳是基于蛋白质在带电条件下在电场中的迁移速率与其等电点相关的原理。
蛋白质在特定pH值下，带有正、负电荷，而其等电点则是蛋白质在该pH值下带电量为零的点。
在等点聚焦电泳中，样品被置于pH梯度胶体中，然后通过电场作用，蛋白质会向其等电点迁移，直到在等电点处停止迁移。
二、操作步骤1. 准备样品：将待分离的蛋白质样品进行预处理，如去除杂质、浓缩等。
2. 准备等电聚焦胶：在胶板上形成pH梯度，通常使用聚丙烯酰胺胶。
可以通过添加缓冲剂或聚电解质来形成pH梯度。
3. 样品加载：将预处理的样品加载到胶上特定位置。
4. 等电聚焦：通过施加电场，使蛋白质在pH梯度中迁移，直到达到其等电点处停止迁移。
5. 胶固定：固化胶，使蛋白质分布固定在胶中。
6. 显色与成像：使用染色剂对蛋白质进行染色，然后使用成像设备进行成像分析。
三、应用领域等点聚焦电泳在生物学研究中具有广泛的应用。
以下是一些主要的应用领域：1. 蛋白质分析：等点聚焦电泳能够实现对复杂蛋白质混合物的高分辨率分离，为后续的质谱分析、蛋白质鉴定等提供了重要的前处理步骤。
2. 蛋白质组学研究：通过等点聚焦电泳可以对不同细胞、组织或生理状态下的蛋白质进行分离，从而揭示蛋白质组的差异，进一步研究蛋白质功能和调控机制。
3. 生物医学研究：等点聚焦电泳可以用于检测蛋白质的变异或突变，从而为疾病的诊断和治疗提供重要依据。
4. 药物研发：等点聚焦电泳可以用于筛选药物靶点、评估药物对蛋白质的作用，为药物研发提供重要的分析手段。
5. 环境监测：等点聚焦电泳可以用于分析环境中的污染物对生物体内蛋白质的影响，从而评估环境污染的程度和影响。
一、原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）6－8％尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。
