凝胶等电聚焦法测定蛋白质等电点

等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点【实验原理】等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。

在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。

当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。

因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。

根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF．【试剂与器材】1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。

2．1％(V/V)TEMED溶液。

3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。

4．40％两性电解质载体。

5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。

6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。

7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。

8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。

9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。

10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。

11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。

12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。

食品安全检测农药兽药残留土壤成分分析焦炭成分分析【操作步骤】1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。

实验五等电点聚焦测蛋白质等电点Mangogola等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要进展，其实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。

IEF的关键是得到一定范围内的稳定pH梯度，即找到合适的两性载体。

载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧基的同系物和异构物的混合物，其氨基和羧基的比例不同，使pH和pI相异、相近。

经过适当电泳时间后，两性电解质将依等电点递增的次序在支持物中从正极到负极彼此相互衔接，形成一平滑稳定的pH梯度。

蛋白质靠近正极在低于其pI的环境中带正电荷，向负极移动，反之则向相反方向移动，最终停在其pI处。

聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离等电点分子因pH的改变而重新带上正或负电荷，从而又向pI迁移。

最后测出蛋白质停留位置的pH即为该蛋白质的pH。

一．实验过程1.圆柱体凝胶制备用封口膜将玻管[D4×120mm]的一端封口，将玻管套上橡胶塞放置在支架上，加入凝胶至10cm处（注意摇动玻管，震出底部气泡），轻轻铺上一层双蒸水，放置聚合1h。

凝胶T=%，C=%，共4mL30%Acr，%Bis 1mL10%过硫酸铵双蒸水载体两性电解质样品液（BSA-10mg/mL）样品液（肌红蛋白-5mg/mL）TEMED共作三支管，每管加胶液约2.聚焦电泳在电泳下槽注入%硫酸500mL，将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳上槽(注意塞紧所有孔，以防电极液下漏)，加入上槽溶液%乙醇胺约1000mL（注意排除凝胶下表面的气泡，凝胶上下表面都要接触电极液）。

接上电源，正极接酸，负极接碱，恒压160V至电流为0，再继续通电20min。

3.蛋白质染色及等电点测定用注射器向胶管注水取出胶条，测量胶体总长度及肌红蛋白距酸端（碱端）距离。

将其中一胶条放在玻璃板上用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入装有2mL10mM的KCl溶液中，浸泡过夜，次日用pH计测每支管中的pH值。

另外两只胶条在三氯乙酸中浸泡，等出现灰色条带时量总长及其距酸端（碱端）距离。

蛋白质等电点的测定蛋白质是生命体内构成最广泛的一类生物大分子，具有各种生物功能。

在生物体内，蛋白质具有正负电荷，并在不同PH值的溶液中表现出不同的电性质。

蛋白质在pH等于其等电点时，蛋白质的电荷处于中性状态，亦是纯蛋白质最稳定的情况，因此准确测定蛋白质等电点对于分离、纯化和鉴定蛋白质具有重要意义。

本文中将介绍三种测定蛋白质等电点的方法。

方法1. 等电点电泳法等电点电泳法是一种电泳分离方法，利用蛋白质在不同pH值下的电荷变化探测其等电点。

该方法的原理为将蛋白质经过电泳分离，直到电泳缓冲液pH等于蛋白质的等电点，此时蛋白质处于中性带中心。

与常规电泳仪不同的是，该仪器在酸性电极和碱性电极之间加入溶液，以确保酸碱缓冲系统能够维持所需的pH值。

等电点电泳法可以快速而准确地测定蛋白质等电点，但需要特殊仪器和耗时较长，且样品纯度较高。

方法2. 等电聚焦法等电聚焦法是一种电泳技术，利用在连续的pH梯度中，使具有等电点的蛋白质依次停止迁移，从而分离蛋白质。

该方法的原理是，利用蛋白质在不同pH值下的等电点特性，将样品置于pH梯度中，通过电压控制，使蛋白质在等电点处停止迁移，从而实现蛋白质分离。

等电聚焦法具有高分辨率和高分离效率，同时还可以同时分离出等电点相似但分子量不同的蛋白质，但样品量较小，需要特殊仪器和大量控制。

方法3. pH梯度管柱法pH梯度管柱法是一种可溶性蛋白质的标准测定方法，也是等电点法中最广泛应用的方法之一。

该方法的基本原理是，在含有不同pH值的缓冲液梯度的柱子上，蛋白质会在不同的pH值时呈现出不同的电荷状态。

在pH值等于其等电点时，蛋白质处于中性状态，停止迁移。

通过检测蛋白质在不同pH值下的吸收值，可以确定样品的等电点。

pH梯度管柱法的优点包括样品量较大，操作简单，数据可靠，但分辨率较低，需要特殊的柱子。

三种测定蛋白质等电点的方法各有侧重，实验操作难度大小也不同，一般来说，选择合适的测定方法应根据样品特点和实验条件。

等电聚焦凝胶电泳-依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离
等电聚焦凝胶电泳-依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离，蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以将蛋白质进行分离。

学术术语来源——
蛋白质组学相关技术在骨关节炎研究中的应用与进展
文章亮点：
1 此问题的已知信息：新兴的蛋白质组学相关技术已经成为研究包括骨关节炎的临床各类慢性疾病筛查和早期诊断蛋白质分子生物标记物的有效工具，同时也为骨关节炎发生和发展的具体机制研究提供了可靠的技术平台。

2 文章增加的新信息：骨关节炎关节软骨、滑膜和滑液组织与其同起源的正常组织的比较蛋白质组学研究为骨关节炎分子标志物的确定和靶向治疗药物的设计提供了最直接和最合理的研究途径。

生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件。

3 临床应用的意义：人类基因组计划的完成，科学家们开始着眼于下一步解释生物系统的正常和异常功能。

因此，在这些研究步骤中的一个焦点是关于蛋白质的功能。

随着后基因组时代的进入，已经发展出了新的工具来研究蛋白的表达、蛋白的相互作用以及确定骨关节病诊断和预后的新型生物标记物。

关键词：
组织构建；组织工程；综述；骨关节炎，蛋白质组，分子标志物；生物信息；国家自然科学基金
主题词：
骨关节炎；蛋白质组；质谱法
摘要
背景：蛋白质组学研究已经彻底改革了研究疾病的方式，提供了解开骨关节炎病理生理机制的途径。

目的：了解蛋白质组相关技术的研究成果及其在骨关节炎早期诊断、治疗效应。

血清蛋白等电点
血清蛋白的等电点是指在酸碱平衡下，蛋白质在溶液中呈电中性的pH值。

等电点是指蛋白质带有净电荷的平均电荷为零的pH值。

血清蛋白是血液中含有的各种蛋白质的总称，包括白蛋白、球蛋白、纤维蛋白等。

不同的血清蛋白具有不同的分子结构和氨基酸组成，因此它们的等电点也不同。

血清蛋白的等电点可以通过实验方法或计算方法来确定。

一种常见的实验方法是等电聚焦（isoelectric focusing），利用电场将蛋白质在凝胶中移动，直到它们达到零电荷状态。

这样，通过测量最终停止迁移时的pH值，可以确定血清蛋白的等电点。

另一种计算等电点的方法是基于蛋白质的氨基酸序列和对应的pKa值。

每种氨基酸都有特定的pKa值，表明该氨基酸在溶液中的酸碱性质。

通过计算氨基酸组成和对应pKa值，可以预测血清蛋白的等电点。

血清蛋白的等电点对于了解其电荷性质和在体内功能的理解具有重要意义。

在特定pH值下，蛋白质可能表现出特定的生理功能、相互作用和电泳行为。

因此，研究血清蛋白的等电点可以有助于深入了解其在健康和疾病状态下的变化和作用。

实验四等电点聚焦测蛋白质等电点宫魁六组200928006841083一、实验原理：等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。

在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。

聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。

一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。

因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。

二、实验仪器和用具：玻璃管（4支）、封口膜、试管架、细长滴管、注射器和长针头、培养皿、刀片、烧杯、微量移液器、圆盘电泳槽及电泳仪三、试剂：0.1M磷酸（500ml）、0.1M氢氧化钠（1000ml）、丙烯酰胺储液、两性载体电解质、TEMED、牛血清蛋白样品（0.5mg/ml）、过硫酸铵（10%）、三氯乙酸（10%）等四、实验步骤：1、先将玻管洗净，用封口膜封的一端垂直放在架上；2、配胶：丙烯酰胺储液0、67ml两性载体电解质0、2mlTEMED 0、004ml牛血清蛋白质样品0、04ml蒸馏水 2.9ml过硫酸铵0.02ml3、用细长滴管加入溶液至10cm高处，胶面上加3—3cm高水层，进行封闭，聚合10—50min，吸出上层水，用滤纸稍微吸取；4、在电泳槽上槽加800ml磷酸，下槽500ml氢氧化钠；5、将管接入电泳槽，要求上端浸入液面，下端不接触下槽底面，注意排除凝胶下表面的气泡；6、接上电源，正极接酸，负极接碱；恒定160v，4h左右，电泳至电流为“0”；7、取胶将聚胶后的含蛋白质样品的凝胶借助注射器针头注水取出；8、量取三条胶的长度；9、pH梯度的测定取KCl溶液分别加入2ml于10只小管中，将欲测pH 梯度的胶条置于玻片上，用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入有标号的小管中，盖好盖子，室温下过夜；10、次日用pH计测每只小瓶中浸泡液的pH值。

蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。

蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。

蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。

本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。

一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。

这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。

1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。

因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。

2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。

因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。

3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。

此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。

由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。

二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。

测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。

常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。

在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。

可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。

2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。

3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。

聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点一、目的：学习聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理及方法。

二、原理：等电点聚焦（isoelectric focusing, IEF）或简称电聚焦（electrof ocusing），也曾称等电点分离聚焦电泳等。

它是60年代中期出现的技术，克服了一般电泳易扩散的缺点。

近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。

由于它的分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便、迅速，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。

等电点聚焦电泳产生pH 梯度的方法有两种：一是用两种不同的pH缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度，此为人工pH梯度。

这种pH梯度不稳定，常用于制备电泳；另一种是利用载体两性电解质在电场作用下形成自然pH梯度。

本实验就是利用载体两性电解质形成的自然pH梯度进行蛋白质样品等电焦聚电泳的。

理想的载体两性电解质应该在其本身的等电点处有足够的缓冲能力和良好的导电性，且分子量要小，组成与被分析样品有所区别，对分析样品无变性作用或发生化学反应。

常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，即是一系列的异构物和同系物，分子量在300—1000之间，各组分的等电点(pI)既有差异又相接近，pI的范围在2.5—11之间。

合成载体两性电解质的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反应如下：R1 和R2为氢或带有氨基的脂肪基。

这一反应的特点是生成众多的异构物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。

混合物中各成分的含量、等电点的分布，取决于原材料的性质、比例和合成条件。

目前常用的载体两性电解质的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Phar macia公司）、 Serralyty（Serva公司），近来已有国产商品了。

不同厂家合成的方法不同，电泳的条件也略有不同。

实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点引言：蛋白质是生物体中一类重要的生物大分子，它们的功能和性质与其结构密切相关。

等电点是指蛋白质在溶液中存在时呈电荷中性的pH值。

当蛋白质的溶液中pH等于它的等电点时，蛋白质的正电荷和负电荷相等，从而净电荷为0。

等电点测定是一种常用的方法，用于确定蛋白质的等电点。

实验目的：1.掌握等电点聚焦技术的原理和操作方法。

2.利用等电点聚焦技术测定其中一种蛋白质的等电点。

材料与方法：1.实验仪器：等电点聚焦仪。

2.实验试剂：蛋白质样品、等电点聚焦凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、溶液缓冲液等。

3.样品制备：取适量的蛋白质样品，加入等电点样品溶液缓冲液，使其浓度适当。

4.等电点聚焦凝胶制备：根据实验需要，选择适当的pH梯度，制备等电点聚焦凝胶。

5.实验操作：将已制备好的等电点聚焦凝胶放置于等电点聚焦仪中，按照仪器操作说明进行调试和操作。

将样品加载到凝胶上，通过电场力使其在凝胶中聚焦移动，最终形成pH梯度。

根据蛋白质的等电点，蛋白质在凝胶中会聚焦在对应的位置。

6.凝胶分离与染色：等电点聚焦结束后，取出凝胶，根据需要进行分离和染色。

结果与讨论：等电点聚焦技术是一种高效、准确的测定蛋白质等电点的方法。

它利用电场力将蛋白质在凝胶中聚焦，根据蛋白质在不同pH条件下的电荷变化，最终确定其等电点。

该方法操作简便、结果可靠，适用于各类蛋白质的等电点测定。

结论：本实验利用等电点聚焦技术成功地测定了一种蛋白质的等电点，并通过凝胶分离和染色展示了等电点聚焦的结果。

等电点聚焦技术在蛋白质等电点测定中具有重要的应用价值，可以为蛋白质结构和功能的研究提供重要的参考。

[1]赵海洋.蛋白质等电点聚焦技术[J].广西科技大学学报，2024[2]张桂泉,王运青,刘晓东.蛋白质等电点聚焦的实验教学及质量考察[J].高等教育化学研究，2024。

等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。

在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。

因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。

脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。

充分溶解后，离心去除不溶杂质。

2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。

3, 配胶：胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）6－8％尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。