下载文档原格式
0541电泳法
第六法等电聚焦电泳法
等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法
除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
(1)水(电阻率不低于 18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶
1。
等电聚焦电泳的原理和应用1. 原理等电聚焦电泳是一种基于蛋白质等电点（pI）差异的分析方法。
在等电聚焦电泳中，蛋白质被置于一个电荷梯度进行分离，直到达到其等电点时停止运动。
原理可分为以下几个步骤：1.1 准备电荷梯度电荷梯度是等电聚焦电泳中的关键。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶，其中有两个极性的电解质进行稀释，创建一个pH梯度。
这个梯度会在凝胶中生成氢离子（H+）和氢氧根离子（OH-）。
1.2 样品加载样品通常会混合在一种称为“载体溶胶”的缓冲液中，以保持样品的pH稳定。
这些样品会在载体溶胶上浮，准备好进行电泳分离。
1.3 离子迁移一旦样品加载完成，电泳过程就开始了。
在电场的作用下，蛋白质在电荷梯度中迁移。
1.4 等电点停止当蛋白质在凝胶中达到其等电点时，它们的净电荷为零，停止迁移。
等电点是蛋白质的理论中性点。
2. 应用等电聚焦电泳在生物医学和生物化学研究中具有广泛的应用。
以下是一些应用示例：2.1 蛋白质分离和纯化等电聚焦电泳常用于蛋白质的分离和纯化。
通过优化电荷梯度和其他实验条件，可以实现对复杂样品的高分辨率分离。
这种方法对于深入了解蛋白质的结构和功能非常有帮助。
2.2 蛋白质组学研究等电聚焦电泳在蛋白质组学研究中发挥重要作用。
通过等电聚焦电泳，可以分析和比较不同样品中蛋白质的表达水平。
这对于研究疾病相关蛋白质的变化以及寻找生物标志物非常重要。
2.3 药物分析等电聚焦电泳在药物分析中也有应用。
它可以用来研究药物-蛋白质相互作用和药物的释放动力学。
这对于药物的开发和优化具有重要意义。
2.4 食品分析等电聚焦电泳在食品分析中也得到了广泛应用。
它可以用来检测食品中的蛋白质含量和质量，包括检测过敏原和添加剂。
这对于食品质量和安全性的监测非常重要。
3. 结论等电聚焦电泳是一种基于蛋白质等电点差异的分析方法。
它在分离和纯化蛋白质、蛋白质组学研究、药物分析和食品分析等领域都有广泛的应用。
这种方法具有高分辨率和灵敏度，对于研究生物分子在不同条件下的特性具有重要意义。
1. 了解等电聚焦电泳（IEF）的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用等电聚焦电泳技术测定蛋白质的等电点（pI）。
3. 掌握实验操作技能，提高实验动手能力。
二、实验原理等电聚焦电泳（IEF）是一种利用pH梯度介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
其基本原理是在一个具有pH梯度的介质中，蛋白质分子根据其等电点在电场作用下向相应pH位置移动，直至聚焦于该位置。
蛋白质分子是两性电解质，其等电点（pI）是指蛋白质分子在溶液中呈电中性时的pH值。
在pH低于蛋白质的pI时，蛋白质分子带正电荷；在pH高于蛋白质的pI 时，蛋白质分子带负电荷。
在等电聚焦电泳过程中，当蛋白质分子移动到与其pI相等的pH位置时，其净电荷为零，停止移动，从而实现蛋白质的分离和聚焦。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：毛细管电泳仪、恒温水浴、pH计、移液器、超纯水系统等。
2. 试剂：蛋白质样品、两性电解质载体、尿素、磷酸、氢氧化钠、乙酸等。
四、实验步骤1. 准备样品：取适量蛋白质样品，加入适量两性电解质载体，制成蛋白质溶液。
2. 制备pH梯度：根据蛋白质的pI值，配制相应的pH梯度介质，置于毛细管中。
3. 样品上样：将制备好的蛋白质溶液加入毛细管中，注意避免气泡产生。
4. 设置参数：根据仪器要求，设置电泳电压、温度、时间等参数。
5. 运行实验：开启毛细管电泳仪，开始电泳实验。
6. 数据采集：实验结束后，采集数据，分析蛋白质的等电点。
五、结果与分析1. 根据实验数据，绘制蛋白质的迁移曲线，分析其等电点。
2. 与理论值进行比较，评估实验结果的准确性。
1. 等电聚焦电泳是一种有效的蛋白质分离和鉴定技术，具有分辨率高、操作简便等优点。
2. 通过本次实验，掌握了等电聚焦电泳的操作步骤，提高了实验动手能力。
3. 在实验过程中，需要注意以下几点：a. 精确配制pH梯度介质，确保pH梯度均匀。
b. 避免气泡产生，影响实验结果。
c. 严格控制实验参数，确保实验结果的准确性。
