金属螯合亲和层析技术及其应用

李淑娟等：金属萱台亲和层析介质用于六聚组氨酸融台蛋白的纯化研究度测定结果可粗略计算：２００血裂解液纯化后所得ｃＤｌ５５Ｄ１融合蛋白量约为２００旭。

２．５ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ－ｓｅｐｈａｒ∞ｅ用于六聚组氨酸融合蛋白大量纯化的初步研究根据小量纯化的优化条件，将介质体积放大２５倍纯化六聚组氨酸融合蛋白ｃＤｌ５５Ｄｌ，取５０％的ｃｏ－ｃＭ．Ａ叩一ｓｅｐｈａｒ姻ｅ悬浮液１．５ｍＬ与５ｍＬ含ｃＤｌ５５Ｄｌ的细胞裂解液孵育，ｃｏ．ｃＭ．Ａ８ｐ．ｓ８ｐＩｌ哪ｓｅ悬浮液装入层析柱中，洗柱后用５ｍＬ含２００ｍｍｌ，Ｌ咪唑的ｃ液洗脱蛋白，收集洗脱液５ｍＬ。

用Ｂｍｄ州法测定蛋白浓度并计算可知蛋白质总量为４．６ｎ蜗。

２．６Ｃｏ・ＣＭ－Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏ辨与Ｎｉ・ＮＴＡ・Ａ辨ｒｏ辨的比较将ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ—ｓｅｐｈ删ｓｅ与商品化Ｎｉ—Ｎ１俳Ａｇａｒｏｓｅ进行蛋白纯化的比较，取５０％的ｃｏ－ｃＭ．Ａ８ｐ．ｓｅｐｈａｌｏｓｅ悬浮液和５０％的Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａ静ｒｏ特悬浮液各６０皿分别与２００ｆｔＬ含六聚组氨酸融合蛋白ｇｐ４ｌ（分子量３６ｋＤ）的细胞裂解液孵育，并按各自清洗溶液对介质清洗后洗脱蛋白，对纯化后的剩余液和洗脱液进行ｓＤＳ．ＰＡＧＥ，结果如图６所示。

从图６中可看出经ｃ０．ＣＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏ∞与Ｑｉａｇｅｎ公司的Ｎｉ．Ｎ１ｒＡ．Ａ∞”介质纯化后剩余液中蛋白质的组成几乎一样，洗脱得到卵４１蛋白的量相当，说明两者蛋白结合容量差别不大。

但是，以Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａ朗ｆ０８ｅ纯化后的洗脱液电泳结果中可见有少量杂蛋白的条带，而且与ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ．ｓ印ｈａｒ∞ｅ相比，Ｎｉ，ＭｒＡ．Ａｇ啪眈介质纯化后剩余液泳道中杂蛋白减少较多，说明有较多的杂蛋白非特异性结合到Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａｇｍ”介质上，便影响了纯化后所得蛋白的纯度。

这与文献中报道含镍螯台介质可与不含六个组氨酸残端的蛋白结合，因而会表现出一定非特异性吸附的结果一致““。

而以ｃｏ－ｃＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏｓｅ纯化的洗脱液电泳条带中不存在杂蛋白，可见ｃｏ—ｃＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｍｓｅ对融合蛋白选择性高，非特异性吸附降低，因而表现出较好的纯化效果。

河北大学生命科学学院， 保定 $M"$$!
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摘
要
将重组人铜锌超氧化物歧化酶 （ />J5， 包含体 （经纯化后纯度达 K$Z 以上） 以稀释法或透析法初步复性后， 分 UBLFVY）
然清除剂， 是一种广泛存在于动植物和微生物中的金属酶， 在医药、 化妆品、 日化及食品等方面都有广泛的应用， 尤其在 临床应用中对于治疗氧中毒、 皮肤病、 心血管病和防止缺血
［!］ 再灌流综合征及抗辐射损伤等方面具有重要的功能 。研
制开发重组人超氧化物歧化酶不仅可解决人源 +23 的材料 来源有限和因血制品污染而带来的安全性问题， 而且可避免 异源 +23 在临床应用时可能出现的免疫性过敏反应。国内 外已有不少采用 /’,’ 纯化各种不同来源 +23 包括可溶性
中图分类号
</>(#’&(
（ />J5， V+,/,‘8/,;;2’B ’C /,1’-.2BAB9 H5-AB J5， UBLF58,/’‘23, Y2;-59A;, UBLFVY）2B : ) 0(,# /,;5(9; 2B 9>, C’/- ’C
2B;’(5.(, 2B1(5;2’B .’36 ) I5/296 ’C />FVY 2B1(5;2’B .’36 ?A; ’+,/ K$Z .6 2;’(A92’B AB3 85/2C21A92’B ) 7C9,/ 8/,(2-2BA/6 /,BA95/A92’B .6 1’B+,B92’BA( 32(592’B ’/ 32A(6;2;，,Ba6-, 8/,8A/A92’B; ?A; /,;8,192+,(6 85/2C2,3 .6 5;2B: J’88,/ [,9A(;LJ>,(A92B: ) 0>FVY ;8,12C21 A192+296 85/2C2,3 .6 [J7J（ C/’- 9>, ;A-8(, /,BA95/,3 8A/9(6 .6 7CC2B296 J>/’-A9’:/A8>6（ J’88,/L[J7J） 32A(6;2;）?A; ! \! 92-,; A; -51> A; 9>A9 .6 32A(6;2; AB3 8/’9,2B /,1’+,/6 ?A; #]Z ) 0>FVY ;8,12C21 A192+296 85/2C2,3 .6 [J7J （ C/’- 9>, ;A-8(, /,BA95/,3 8A/9(6 .6 32(592’B）?A; % \< 92-,; A; -51> A; 9>A9 .6 32(592’B AB3 8/’9,2B /,1’+,/6 ?A; !%Z ) =>, 9?’ />FVY 8/,8A/A92’B; 85/2C2,3 .6 [J7J >A3 ;8,12C21 A192+292,; A.’59 %$$$5^-: AB3 A192+296 /,1’+,/2,; ?,/, A(( ’+,/ "<$Z ’C 9>, ,Ba6-, A192+292,; 2B 9>, ;A-8(,; /,BA95/,3 8A/9(6 .6 32(592’B ’/ 32A(6;2; ) =>, A.’+,L-,B92’B,3 /,;5(9; 2B321A9,3 9>A9 J’88,/L [J7J /,;5(9,3 2B A 85/2C21A92’B AB3 C5/9>,/ /,BA95/A92’B ’C 9A/:,9 8/’9,2B ) FYFLI7TO ;>’?,3 9>A9 9>, 9A/:,9 8/’9,2B />FVY （"N@Y）?A; 85/2C2,3 >’-’:,B,’5;(6 AB3 *D= A192+296 23,B92C21A92’B 8/’+,3 9>A9 9>, 85/2C2,3 AB3 /,BA95/,3 />FVY >A3 +,/6 ;9/’B: FVY A192+296 ) RB 1’B1(5;2’B，J’88,/ [,9A(;LJ>,(A2B: 7CC2B296 J>/’-A9’:/A8>6 A88,A/; 9’ ., A ;2-8(,， /A823 AB3 ,CC212,B9 8/’1,35/, C’/ 85/2C62B: AB3 C5/9>,/ /,BA95/2B: />J5， UBLFVY .6 32(592’B ’/ 32A(6;2; ) =>, -,9>’3 8/’+23,3 A B,? 23,A C’/ 85/2C62B: AB3 /,BA95/2B: /,1’-.2BAB9 8/’9,2B; ,‘8/,;;,3 2B 9>, C’/- ’C 2B1(5;2’B .’36 2B : ) 0(,# ) ?-7 @)#+> （[J7J） ，/,BA95/A92’B，/>J5， [,9A(LJ>,(A92B: 7CC2B296 J>/’-A9’:/A8>6 UBLFVY，2B1(5;2’B .’36

z 缓冲液F： 8 M Urea，100 mM NaH2PO4，100
mM Tris·Cl，用高浓度HCl调节pH至6.3。 z 缓冲液G： 8 M Urea，100 mM NaH2PO4，100
mM Tris·Cl，用高浓度HCl调节pH至4.5。 各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 μm滤膜过滤备用。 注：也可按照可溶性蛋白的缓冲液配制与操作方式 进行，只需在缓冲液中加入8M脲或6M盐酸胍。
让介质自然沉降。
3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平
面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片
与介质接触面滞留气泡（如对实验要求并非十
分严格，为提高流速，可不覆盖上垫片）。
4) 在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可
先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒
出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所
层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。
3) 从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降
平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转
换杆与介质接触面间滞留气泡。
4) 在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下
上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中
滤网，清洗或更换后重新装柱。
4. 过柱：
1) 用5~10倍介质体积的缓冲液A平衡亲和柱；
六、 实验实例
1. Ni-NTA Agarose 纯化 His-tag 蛋白 z 层析介质：纯泰®NTA 1ml；对照介质（国际领
先品牌）1ml z 样品：表达可溶性 His-tag 融合 thioredoxin 的
大肠杆菌 BL21 裂解液 z 结合缓冲液：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，
3. 操作步骤：

!"卷#期$%%%年&月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12’()*!"+(*#,-).!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!$%%%金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究孙旭东李红旗隋洪艳沈忠耀（清华大学化工系北京!%%%1#）摘要金属螯合亲和层析是近$%年发展起来的一项新型分离技术。

它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

本文从单组分蛋白质入手，考查了23值、铵离子浓度、不同铵盐等对蛋白质洗脱的影响，并进行了分析。

还对不同的金属螯合柱和不同性质蛋白质的洗脱性能进行了研究，比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别，为实际体系的分离研究打下了基础。

关键词金属螯合亲和层析，牛血清白蛋白，血红蛋白，分离中图分类号41!5文献标识码6文章编号!%%%07%"!（$%%%）%#0%#/50%5金属螯合亲和层析，又称固定化金属离子亲和层析（899(:;);<=>?=@A)8(B6C C;B;@.D E F(9A@(0 G F A2E.，简称8?6D），是近$%年发展起来的一项新型分离技术。

最早由H A F(@E等人［!，$］提出。

该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸，例如组氨酸、色氨酸、赖氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而对蛋白质加以分离［7］。

由于它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一［#］。

本文主要以单组分蛋白质牛血清白蛋白（I J6）和血红蛋白为研究对象，考查了23值、铵离子浓度及阴离子等不同洗脱条件对出峰时间的影响。

对不同的金属螯合柱的性能和不同单组分蛋白质的洗脱性能进行了研究，比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别，为实际生物产品的分离奠定了基础。

2. 样品处理：
1) 冰上融化冻存菌体，待其完全融化后按每克湿 重菌体/5ml缓冲液E的比例充分悬浮菌体。
2) 室温条件下振摇菌体15～60min，通过温和涡旋 振荡或超声处理裂解菌体，注意避免产生泡沫。 溶液变得透明表明裂解完全。
3) 4℃、13000rpm离心15min，收集上清液或用 0.45μm滤膜过滤，并用高浓度NaOH调节 pH至 8.0待上样。
按每克湿重菌体/4~5ml缓冲液A的比例充分悬
-1-
浮离心收集的菌体，400w功率下，每个循环超声3s， 冷却2s，共循环180次破碎菌体；4℃、13000rpm离 心15m，收集上清液或用0.45μm滤膜过滤，并用高 浓度NaOH调节 pH至8.0待上样。
3. 装柱：
z 聚苯乙烯层析柱
1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析
2) 上样；
3) 用5~10倍介质体积缓冲液A洗去层析柱中未结
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3. 操作步骤：
1.低分子量 Marker； 2.上样液； 3.纯泰®NTA-流穿液； 4.纯泰®NTA-洗脱液； 5.对照-流穿液； 6.对照-洗脱液
2. Ni-IDA Agarose 纯化 His-tag 蛋白 z 层析介质：纯泰®IDA 1ml；纯泰®NTA 1ml z 样品：表达 His-tag 融合 thioredoxin 的大肠杆
网址：
合蛋白； 4) 用缓冲液B和缓冲液C配制的不同浓度缓冲液D

ida金属螯合亲和层析介质引言：ida金属螯合亲和层析介质是一种重要的生物分离技术，广泛应用于生物医学、生物化学和生物工程等领域。

它是通过金属离子与靶分子之间的特异性配位作用，实现对靶分子的高效分离和纯化的方法。

本文将介绍ida金属螯合亲和层析介质的原理、制备方法、应用领域及发展前景。

一、ida金属螯合亲和层析介质的原理ida金属螯合亲和层析介质的原理基于金属离子与靶分子之间的特异性配位作用。

ida（亚铁二胺四乙酸）是一种广泛应用的金属螯合剂，它能够与多种金属离子形成稳定的配合物。

通过将ida固定在载体上，可以构建ida金属螯合亲和层析介质。

二、ida金属螯合亲和层析介质的制备方法制备ida金属螯合亲和层析介质的方法主要包括固定化ida的选择、载体的选择和固定化方法的选择。

固定化ida时，可以选择将ida 直接固定在载体上，也可以选择使用交联剂将ida与载体交联。

常用的载体包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。

三、ida金属螯合亲和层析介质的应用领域ida金属螯合亲和层析介质在生物医学、生物化学和生物工程等领域有广泛的应用。

在生物医学领域，ida金属螯合亲和层析介质可用于药物分离纯化、疾病诊断和治疗等方面。

在生物化学领域，ida 金属螯合亲和层析介质可用于蛋白质纯化、酶分离和多肽合成等方面。

在生物工程领域，ida金属螯合亲和层析介质可用于基因工程药物的纯化和制备等方面。

四、ida金属螯合亲和层析介质的发展前景ida金属螯合亲和层析介质作为一种高效、选择性的分离技术，具有广阔的发展前景。

随着生物医学和生物工程领域的不断发展，对高纯度生物分子的需求越来越大，ida金属螯合亲和层析介质作为一种有效的分离工具将会得到更广泛的应用。

同时，随着新型材料和新型固定化方法的不断涌现，ida金属螯合亲和层析介质在分离效率和选择性上将会有更大的突破。

结论：ida金属螯合亲和层析介质是一种重要的生物分离技术，通过金属离子与靶分子之间的特异性配位作用，实现对靶分子的高效分离和纯化。

镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用摘要：蛋白质纯化是进行基因工程中最重要的环节，选取纯化蛋白的工具对纯化结果影响巨大。

镍离子亲和层析柱具有特异性高、纯度高、成本低、产量大等优点，镍离子亲和层析柱的国产化将极大促进蛋白质纯化产业的发展并会产生巨大的市场效益。

关键词：镍离子亲和层析柱、蛋白质纯化、国产化亲和层析（Affinity chromatography，AC）是利用生物大分子和固定相表面的亲和配基之间可逆的特异性相互作用，进行选择性分离的一种液相层析分离方法。

常用的亲和层析方式为金属螯合亲和层析,又称固定化金属离子亲和层析( Immobilized metal lchelated affinity chromatography, IMAC)，利用金属离子(Ni2+，Cu2+等)与氨基酸表面的残基(如组氨酸的咪唑基)的配位鳌合作用，来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质。

由于IMAC 具有螯合介质制备简单方便，吸附容量大，选择性及通用性较好，易于再生，成本低等优点, 逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

镍离子亲和层析柱成为金属螯合亲和层析的代表产品。

目前，国外有3-4家镍离子亲和层析柱产品在国内销售，但价格昂贵，国内已有数家公司开展了镍离子亲和层析柱产品的销售，其中，广州精达公司采用最新的镍离子亲和层析柱的制备技术，顺利完成了该种产品的国产化。

I、镍离子亲和层析柱的制备工艺1、Ni2+吸附融合蛋白原理Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有His（组蛋白）标签的碱性蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸（碱性氨基酸）。

同时Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合，利用咪唑梯度洗脱，从而获得纯度较高的融合蛋白。

而利用基因工程技术制备的融合蛋白常携带6个组氨酸的标签，因6个组氨酸标签因肽片段小，故对目标蛋白质的生物活性影响较小，因此被广泛用于重组蛋白的制备及纯化。

2、固相载体的选择常见的固相载体包括为普通琼脂糖颗粒及GE公司生产的Sepharose琼脂糖系列产品。

千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质是一种用于蛋白质纯化的重要工具，在生物技术领域广泛应用。

本文将从其原理、特点、应用以及未来发展方向等方面进行介绍和分析。

一、原理千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质的原理主要是利用镍离子与蛋白质中的组氨酸残基结合的特性，实现对蛋白质的选择性结合和分离。

在琼脂糖基质的支持下，镍nta螯合亲和层析介质可以与目标蛋白质发生专一性结合，并通过洗脱等步骤实现对蛋白质的分离纯化。

二、特点1.高选择性：镍nta螯合亲和层析介质具有较高选择性，能够与蛋白质中的组氨酸残基结合，实现对目标蛋白质的有效分离。

2.良好的生物相容性：介质材料琼脂糖在生物体内具有良好的生物相容性，不会对生物体产生毒副作用。

3.稳定性：介质具有良好的稳定性，可以承受一定的流速和压力，适合于在不同操作条件下进行蛋白质的层析纯化。

三、应用千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质在生物制药、基因工程、生物化学等领域有着广泛的应用，主要体现在以下几个方面：1.蛋白质纯化：通过千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质可以实现对蛋白质的高效分离和纯化，为后续的生物学研究和药物开发提供优质的蛋白质样品。

2.蛋白质结构分析：可用于蛋白质的结构研究和功能分析，为了解蛋白质的结构和功能提供有效手段。

3.抗体制备：可用于从复杂混合物中纯化目标抗体，为抗体制备提供技术支持。

四、未来发展方向千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质作为一种重要的蛋白质纯化工具，其未来发展方向主要有以下几个方面：1.多功能化：将其与其他螯合亲和剂结合，开发出具有多功能性能的层析介质，实现对不同类型蛋白质的快速纯化。

2.自动化：结合自动化技术，实现对层析过程的自动控制，提高工作效率和操作便捷性。

3.高通量：发展高通量的层析介质，满足大规模蛋白质纯化的需求。

千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质作为一种重要的蛋白质纯化工具，在生物技术领域具有重要的应用价值，并且其具有良好的发展前景。

金属螯合预装柱（5ml）说明书1. 简介金属螯合亲和层析，又称固定化金属离子亲和层析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC）。

该法利用蛋白质表面的某些氨基酸（如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等）和金属离子（Cu2+、Zn2+、Ni2+等过渡金属离子）发生特殊的相互作用的原理，从而实现蛋白质的分离。

琼脂糖金属螯合介质（Ni-IDA QZT 6FF）是将亚氨基二乙酸（IDA）键合在高流速、高强度的琼脂糖微球上，并螯合金属离子Ni2+而形成的一种亲和层析介质，广泛用于蛋白质、核酸及多肽，尤其是组氨酸标签蛋白质的分离纯化。

2. 产品概述金属螯合预装柱预装了5 ml的Ni-IDA QZT 6FF亲和介质，可直接用于组氨酸标签蛋白质等生物分子的分离纯化，具有使用方便、操作简单、分离纯化效率高的特点。

Ni-IDA QZT 6FF亲和介质具有良好的稳定性、生物相容性和溶剂相容性，这不仅有利于保持产品的生物活性和提高产品的收率，还有利于扩大层析操作条件的选择范围。

Ni-IDA QZT 6FF亲和介质的理化性质和溶剂相容性分别如表1和表2所示。

表1. Ni-IDA QZT 6FF预装柱的理化性质及特征参数参数指标基质6%交联琼脂糖凝胶配基-N(CH2COOH)2 (IDA)形状球形平均粒径90 μm (45~165)金属离子密度~40 μmol Zn2+/ml wet gel动态载量a~25-30 mg蛋白(LDH)/ml wet gel柱体积1ml或5ml柱尺寸（内径x高度）0.9*1.57 cm (1ml柱子) 0.9*1.57 cm (5ml柱子)推荐流速b1ml/min (1ml柱子)或5ml/min (5ml柱子)地址：北京市海淀区中关村北二条1号中国科学院过程工程研究所最高流速b4ml/min (1ml柱子)或20ml/min (5ml柱子) 最高耐压b0.3 MPa (3 bar)化学稳定性c 避免使用的试剂0.01M HCl、0.1 M NaOH（37 °C, 7天）；1M NaOH、70%乙酸（12 h）；30%异丙醇（30 min）；2% SDS（1 h）螯合剂，如EDTA、EGTA、柠檬酸等pH稳定性c2-14（短期，2 h）；3-12（长期，7天）储存条件20%乙醇，4-30 o C动态载量a：样品：平衡缓冲液中含1mg/ml histidine-tagged LDH（Mr 140000）；计算方法：根据10%穿透点计算介质动态载量（Q B, 10%）；柱体积：1 ml或5 ml；流速：0.5 ml/min或2.5 ml/min；平衡缓冲液：20mM PB + 0.1M NaCl + 50 mM 咪唑, pH 7.4；洗脱缓冲液：20mM PB + 0.1M NaCl + 0.5 M 咪唑, pH 7.4；注意：动态载量与蛋白种类和操作条件密切相关。

简述几种柱层析的特点作者：张弓【摘要】柱层析技术在近几十年得到了广泛的应用和不断地发展，已成为各行各业离不开的重要技术。

本文就其中几种常用的柱层析的特点做了综述。

【关键词】凝胶过滤柱层析离子交换柱层析疏水作用柱层析亲和柱层析金属螯合层析在过去的三十年中,分离生物大分子的各种技术和方法得到了不断的发展。

随着各种介质的完善和商品化,使以填料为核心的柱层析技术在蛋白质等粗提后的纯化中起到了重要作用。

本文总结了几种柱层析的特点：一，凝胶过滤柱层析（Gel Filtration Chromatography, GFC）GFC是以分子大小和形状为分离基础的。

具体说就是利用不同大小分子通过凝胶滞留时间的差别来分离混合物的柱层析方法。

另外一种说法是分离是以分子体积的大小为基础的,分子体积即分子溶剂化后的体积,受分子形状和相对分子质量两方面因素的影响。

有时加入变性剂（尿素、盐酸胍等）以破坏蛋白质的三、四级结构,可以使分离主要受控于相对分子质量的大小。

GFC特别适用于分离相对分子质量大于2000的高分子化合物和相对分子质量差异大的混合物及低聚物。

GFC的分离不依赖于流动相和固定相的相互作用,所以不必使用梯度洗脱。

但是由于电荷屏蔽的因素,为了降低填料与生物分子之间的相互作用,往往会适当提高盐浓度,至少高于0.05 mol/LNaCl。

由于试样在柱中的保留时间不会超出柱中溶剂的总体积(Vt) ,所以不会出现在其他液相色谱中经常出现的由于色谱峰的弥散而引起的检测极限。

GFC的容量通常由流动相效应来控制。

由于GFC的分离靠大小组分流程途径长短之差达到分离,柱要有足够的长度(75～100 cm ,)但由于微小的粒子在GFC也有扩散的效应,柱子又不可过长,上样量不可过多(< 20 % Vt)。

因为GFC 洗脱时间可粗略估计,所以再隔一定时间连续进样,提高柱的使用效率,缩短纯化周期。

除了以上特点外,GFC还有回收率较高,洗脱条件温和,不易发生副反应,使用寿命较长,同时可用作换盐等特点。

Ｊ ａ ｎ ． ２ ０ １ ３
铁离 子螯合 亲和层 析分 离抗 氧化 活性核桃肽
吕 莹 刘 静 陈湘 宁
（ 农 产品有 害微生物及农残 安全检 测与控制北 京市重点 实验室 北京农学 院食品科学 与工程学院 ， 北京 摘 要 １ ０ ２ ２ ０ ６ ）
采 用铁 离子 螯合 亲和 层析 方 法分 离出具 有 不 同抗 氧化 活 性 的核桃 肽 ， 并探 讨 核桃 肽 的抗 氧 化 活
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 材料
１ ０ ％和 １ ３ ． ２ ２ ％ ， 具有 与金属离子螯合的可能性。 但 目前 有 关核 桃 肽抗 氧化 活性 的研究 多 集 中在核 桃
蛋 白酶解 条件 优 化 、 酶解 工 艺 的确定 上 ， 而有 关 核 桃 肽 的金 属 离子 螯 合 能力 与其 抗 氧 化 活性 的相关 性 鲜
肽 的铁 结合 能力越 强 ， 其抗 氧化 活性 越 高 。 关键 词 核桃 肽 铁 结合 能力 抗 氧化 文 献标 识码 ： Ａ 铁 离子 螯合 亲和层 析 文 章编 号 ： １ ０ ０ ３— ０ １ ７ ４ （ ２ ０ １ ３ ） ０ １— ０ ０ ６ ５— ０ ５ 中 图分类 号 ： Ｔ Ｓ ２ ５ ５
网络 出版 时 间 ： ２ ０ １ ２— ０ ８— ２ ９ １ ０： ３ ０ 网络 出版地 址 ： ｈ ｔ ｔ ｐ： ／ ／ ｗ ｗ ｗ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． ｎ ｅ ｔ ／ ｋ ｃ ｍ ｓ ／ ｄ ｅ ｔ ａ ｉ ｌ ／ １ １ ． ２ ８ ６ ４ ． Ｔ Ｓ ． ２ ０ １ ２ ０ ８ ２ ９ ． １ ０ ３ ０ ． ０ ０ ４ ． ｈ ｔ ｍ ｌ
２ ０ １ ３年 １月
中国粮油学报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｃ ｅ ｒ ｅ ａ ｌ ｓ ａ ｎ ｄ Ｏ ｉ ｌ ｓ Ａｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ

网址：
合蛋白； 4) 用缓冲液B和缓冲液C配制的不同浓度缓冲液D
洗脱； 9 最高纯度洗脱方案：用含0、60、100、150、
200、250mM 咪唑的缓冲液D分步洗脱，每 个梯度2~3倍介质体积洗脱； 9 最高收率洗脱方案：先用5~10倍介质体积 含20mM咪唑的缓冲液D洗脱，再用5~10倍 介质体积含250mM咪唑的缓冲液D洗脱。 注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速 保持在0.5ml/min为宜。 5. 介质清洗与再生： 如果使用一段时间以后，介质上有杂质沉积导 致介质颜色改变和蛋白结合能力下降，需对介质进 行清洗或再生。 z 介质清洗： 1) 用10倍介质体积0.5M NaOH过柱，适当调整流 速，或洗脱至10倍介质体积时停30min后继续洗 脱，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30min 以上。 2) 用10倍介质体积去离子水洗去层析柱中的碱 液。 3) 用10倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。 z 介质再生： 1) 用2~5倍介质体积脱镍缓冲液（50mM Na3PO4， 300mM NaCl，100mM EDTA，pH 8.0）过柱； 2) 用5-10倍介质体积0.5M NaOH过柱，适当调整 流速，如流速较快，则洗脱至10倍介质体积时 停30min后继续洗脱，保证介质与NaOH溶液接 触时间达到30min以上； 3) 用10倍介质体积去离子水洗柱； 4) 用3倍介质体积10mM Na3PO4，1M NaCl，pH 7.4 缓冲液平衡层析柱； 5) 用3倍介质体积20mM NiCl2或NiSO4 (溶于去离 子水)过柱； 6) 用3倍介质体积10mM Na3PO4，1M NaCl，pH 7.4 缓冲液洗柱； 7) 用5倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。
网址：
分离His融合蛋白及能被金属离子吸附的多肽、 蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。

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亲和层析的过程
1、寻找可与底物专一可逆结合的配基 2、将配基通过共价键偶联到基质，并要求偶
联后配基与配体的亲和力不变 3、配基与配体吸附并与杂质分离，将杂质洗
出 4、洗脱目标物
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亲和层析的分类
1、生物亲和层析 2、免疫亲和层析 3、金属离子亲和层析 4、有机染料亲和层析 5、拟生物亲和层析
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2、IMAC与重组技术相结合可以使带六聚组氨 酸的蛋白质固定在基质上，从而为研究蛋白 质的相互作用开辟了新的途径。
例：Celia等用Ni2+负载的金属螯合脂质定向 膜捕获组氨酸MHC分子，再通过表面等离 子体共振技术考察它们对 T细胞受体的结合。
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（三）、用于提取目的蛋白
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（二）、用于蛋白质分析鉴定
1、1）科学家通过金属离子亲和层析对糖基化 导致α一胰凝乳蛋白酶结构变化进行了研究， 证明糖基化作用产生两个截然不同的蛋白质， 他们对金属离子的亲和性完全相反。
2） 蛋白质的磷酸化和去磷酸化是生命体 代谢调控的重要机制，已发现IMAC能鉴定 磷酸化的蛋白，其中Fe3-IMAC已被用来选 择性纯化和浓缩磷酸化的蛋白和多肽。
在基因重组过程中加入聚组氨酸六肽作为 亲和标识物来分离纯化目的蛋白
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（四）、用于核苷酸的纯化
IMAC也可以应用于核苷酸的纯化，比如用 组氨酸标记的PCR产品，单链、双链核苷酸 及嘌呤等
例：从质粒DNA产物中除去被损坏的染色体 DNA
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（五）、其他应用
过渡金属亲和吸附蛋白的特性也成功应 用在生物传感器和蛋白质芯片领域。

蛋⽩纯化His-tag介绍、优势及原理1、什么是His-tag？His-tag单抗⼜叫6*His-tag单抗，或6*His单克隆抗体，⽤⼩⿏制备，His可被镍柱吸附，⽤于纯化重组蛋⽩，⽆论表达的蛋⽩是可溶的或者包涵体都可以⽤固定⾦属离⼦亲和层析（IMAC）纯化。

⾦属螯合亲合层析，⼜称固定化⾦属离⼦亲合层析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC），是近30年发展起来的⼀种新型分离技术。

最早由Paroth等⼈提出。

该⽅法利⽤蛋⽩质表⾯的⼀些氨基酸，如组氨酸、⾊氨酸、半胱氨酸等能和⾦属离⼦发⽣特殊的相互作⽤的原理，从⽽对蛋⽩质加以分离。

这些作⽤包括配价键结合、静电吸附、共价键结合，其中以配价键结合为主，⽽且这其中⼜以6组氨酸标签（His-Tag）应⽤最为⼴泛。

His-tag 是蛋⽩质重组技术中经常⽤到的⼀种标签，其序列为6个组氨酸HHHHHH，其特点是分⼦量⼩，只有不到0.84 KD，基本不改变蛋⽩质的⽣物结构，不改变蛋⽩质的溶解性，更重要的是它使蛋⽩质的纯化变得极为⽅便。

根据组氨酸上的咪唑环可以与⼆价⾦属离⼦结合的原理，His-Tag 可结合在⽬的蛋⽩的 C 末端或 N 末端，形成特殊的结构，以便于进⾏下⼀步的纯化及检测。

⼈们可以利⽤⾦属离⼦亲和层析技术纯化带有His标签的蛋⽩，即将含有⽬的蛋⽩的裂解液通过固定的⼆价⾦属离⼦（通常是⼆价Ni离⼦）填料，带有6*his-tag的蛋⽩质即与填料结合，其它蛋⽩不与填料结合，最后再⽤⾼浓度的咪唑即可将⽬的蛋⽩洗脱下来。

以实验⼩⿏为宿主制备的His-tag单抗叫His-tag⿏单抗。

其制备⽅法通常是这样的：⼈⼯合成6*His多肽，即氨基酸序列为HHHHHH的多肽，必要时在末端添加偶联载体⽤到的特殊氨基酸。

合成好此多肽后，通过化学⽅法将此多肽与载体蛋⽩偶联（如KLH、BSA、OVA等），偶联完成后，再⽤偶联好的全抗原免疫实验⼩⿏，免疫结束后杀死免疫好的⼩⿏，⽆菌条件下取脾脏，与⾻髓瘤细胞进⾏融合，⽤ELISA或者其它⼿段进⾏筛选出阳性的克隆，筛选到的细胞经过克隆化后即形成稳定的细胞株，将此细胞株进⾏体外培养或⼩⿏体内诱⽣腹⽔形成，再从培养基或者腹⽔中纯化即可得到His-tag⿏单抗，再⽤Western blot或其它⼿段进⾏鉴定即可。

铁离子螯合亲和层析分离抗氧化活性核桃肽吕莹;刘静;陈湘宁【摘要】采用铁离子螯合亲和层析方法分离出具有不同抗氧化活性的核桃肽,并探讨核桃肽的抗氧化活性与铁结合能力的关系.结果表明,核桃肽在酸性条件(pH 5.5)下与铁的结合能力最强,随着pH逐渐升高,结合能力下降.磷酸氢二钠对吸附到铁亲和层析柱上核桃肽的洗脱效果最好,通过阶段洗脱,得到铁结合能力逐渐增强的核桃肽组分(F1、F2和F3).对其总还原能力和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除能力进行测定,发现其抗氧化能力为F3＞F2＞F1(P＜0.05).结果表明,核桃肽的铁结合能力越强,其抗氧化活性越高.%walnut is an important forestry product. The peptides hydrolyzed from walnut protein have the antioxidant activities. In this study, immobilized metal affinity chromatography (IMAC) was used to separate the walnut peptides with different antioxidant activities. The results showed that the binding abilities of walnut peptides on iron column were highest at pH 5.5. The binding amount of peptides decreased with the increasing of pH. The amount of eluted walnut peptides from column with Na2HPO4 was higher than that of other solutions. With stepwise elution, there fractions ( F1, F2, and F3) were obtained. Furthermore, the antioxidant activities of the tree fraction were evaluated with reducing power and 2,2- Azinobis - (3 - ethylbenzthiazoline - 6 - sulphonate) (ABTS) system. The peptides from F1 to F3(P<0. 05) presented improving antioxidant activity. Our results showed that the stronger iron binding ability of the walnut peptides, the higher antioxidant activities.【期刊名称】《中国粮油学报》【年(卷),期】2013(028)001【总页数】5页(P65-69)【关键词】核桃肽;铁结合能力;抗氧化;铁离子螯合亲和层析【作者】吕莹;刘静;陈湘宁【作者单位】农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室北京农学院食品科学与工程学院,北京102206;农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室北京农学院食品科学与工程学院,北京102206;农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室北京农学院食品科学与工程学院,北京102206【正文语种】中文【中图分类】TS255核桃是我国重要的林产品，目前核桃除鲜食外，深加工主要集中在生产核桃乳或核桃油。

imac固定化金属亲和层析
固定化金属离子亲和层析（IMAC）是一种蛋白质纯化技术，其主要原理是利用蛋白质中的组氨酸、半胱氨酸和色氨酸侧链与过渡金属（如Cu2+、Ni2+、Co、Zn3+等）的相互作用，将金属离子固定在载体上，从而实现蛋白质的纯化。


I MAC技术的操作简单、纯化效果好，因此被广泛应用于蛋白质纯化实验。

在实验过程中，常用的缓冲液浓度为20-100mM，可以使用磷酸盐、Tris、硼酸盐、HEPES和乙酸盐等缓冲液。

此外，非离子型表面活性剂、尿素、盐酸胍等物质不会影响IMAC 对组氨酸的吸附作用。



IMAC技术除了用于蛋白质纯化外，还具有以下应用：
1.酶联免疫吸附实验（ELISA）：ELISA是一种诊断工具，通过固定化金属离子亲和层析技术，可以将His标记的抗原固定在微孔板表面，用于检测抗体与抗原的相互作用。

2.芯片技术：将His标记蛋白质固定在芯片表面，用于研究与其他分子的相互作用，如通过SPR技术进行蛋白质鉴定。

3.蛋白质相互作用研究：利用固定化金属离子亲和层析技术，可以研究蛋白质与其他分子的相互作用，如酶与底物的结合、蛋白质与配体的结合等。

4.生物传感器：基于IMAC技术制备的生物传感器，可用于实时监测生物分子间的相互作用。

5.药物筛选：利用固定化金属离子亲和层析技术，可以筛选与特定金属离子结合的药物分子，从而进行药物研发。


总之，固定化金属离子亲和层析（IMAC）技术在生物科学研究、药物研发和临床诊断等领域具有广泛的应用前景。

亲和层析中文名称：亲和层析英文名称：affinity chromatography定义1：利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。

可以选用生物化学、免疫化学或其他结构上吻合等亲和作用而设计的各种层析分离方法。

如用寡脱氧胸苷酸-纤维素分离纯化信使核糖核酸；用DNA-纤维素分离依赖DNA的DNA聚合酶；用琼脂糖-抗体制剂分离抗原；用金属螯合柱分离带有成串组氨酸标签的重组蛋白质等。

应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义2：利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。

应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布百科名片亲和层析将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。

那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。

利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其它分子的层析技术。

目录亲和层析(affinity chromatography)原理载体的基本要求和选择名词解释亲和层析(affinity chromatography)在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。

生物分子间的这种结合能力称为亲和力。

亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。

原理亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。