金属螯合亲和层析技术及其应用

李淑娟等：金属萱台亲和层析介质用于六聚组氨酸融台蛋白的纯化研究度测定结果可粗略计算：２００血裂解液纯化后所得ｃＤｌ５５Ｄ１融合蛋白量约为２００旭。

２．５ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ－ｓｅｐｈａｒ∞ｅ用于六聚组氨酸融合蛋白大量纯化的初步研究根据小量纯化的优化条件，将介质体积放大２５倍纯化六聚组氨酸融合蛋白ｃＤｌ５５Ｄｌ，取５０％的ｃｏ－ｃＭ．Ａ叩一ｓｅｐｈａｒ姻ｅ悬浮液１．５ｍＬ与５ｍＬ含ｃＤｌ５５Ｄｌ的细胞裂解液孵育，ｃｏ．ｃＭ．Ａ８ｐ．ｓ８ｐＩｌ哪ｓｅ悬浮液装入层析柱中，洗柱后用５ｍＬ含２００ｍｍｌ，Ｌ咪唑的ｃ液洗脱蛋白，收集洗脱液５ｍＬ。

用Ｂｍｄ州法测定蛋白浓度并计算可知蛋白质总量为４．６ｎ蜗。

２．６Ｃｏ・ＣＭ－Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏ辨与Ｎｉ・ＮＴＡ・Ａ辨ｒｏ辨的比较将ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ—ｓｅｐｈ删ｓｅ与商品化Ｎｉ—Ｎ１俳Ａｇａｒｏｓｅ进行蛋白纯化的比较，取５０％的ｃｏ－ｃＭ．Ａ８ｐ．ｓｅｐｈａｌｏｓｅ悬浮液和５０％的Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａ静ｒｏ特悬浮液各６０皿分别与２００ｆｔＬ含六聚组氨酸融合蛋白ｇｐ４ｌ（分子量３６ｋＤ）的细胞裂解液孵育，并按各自清洗溶液对介质清洗后洗脱蛋白，对纯化后的剩余液和洗脱液进行ｓＤＳ．ＰＡＧＥ，结果如图６所示。

从图６中可看出经ｃ０．ＣＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏ∞与Ｑｉａｇｅｎ公司的Ｎｉ．Ｎ１ｒＡ．Ａ∞”介质纯化后剩余液中蛋白质的组成几乎一样，洗脱得到卵４１蛋白的量相当，说明两者蛋白结合容量差别不大。

但是，以Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａ朗ｆ０８ｅ纯化后的洗脱液电泳结果中可见有少量杂蛋白的条带，而且与ｃｏ．ｃＭ．Ａｓｐ．ｓ印ｈａｒ∞ｅ相比，Ｎｉ，ＭｒＡ．Ａｇ啪眈介质纯化后剩余液泳道中杂蛋白减少较多，说明有较多的杂蛋白非特异性结合到Ｎｉ．ＮＴＡ．Ａｇｍ”介质上，便影响了纯化后所得蛋白的纯度。

这与文献中报道含镍螯台介质可与不含六个组氨酸残端的蛋白结合，因而会表现出一定非特异性吸附的结果一致““。

而以ｃｏ－ｃＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｒｏｓｅ纯化的洗脱液电泳条带中不存在杂蛋白，可见ｃｏ—ｃＭ．Ａｓｐ．ｓｅｐｈａｍｓｅ对融合蛋白选择性高，非特异性吸附降低，因而表现出较好的纯化效果。

!"卷#期$%%%年&月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12’()*!"+(*#,-).!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!$%%%金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究孙旭东李红旗隋洪艳沈忠耀（清华大学化工系北京!%%%1#）摘要金属螯合亲和层析是近$%年发展起来的一项新型分离技术。

它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

本文从单组分蛋白质入手，考查了23值、铵离子浓度、不同铵盐等对蛋白质洗脱的影响，并进行了分析。

还对不同的金属螯合柱和不同性质蛋白质的洗脱性能进行了研究，比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别，为实际体系的分离研究打下了基础。

关键词金属螯合亲和层析，牛血清白蛋白，血红蛋白，分离中图分类号41!5文献标识码6文章编号!%%%07%"!（$%%%）%#0%#/50%5金属螯合亲和层析，又称固定化金属离子亲和层析（899(:;);<=>?=@A)8(B6C C;B;@.D E F(9A@(0 G F A2E.，简称8?6D），是近$%年发展起来的一项新型分离技术。

最早由H A F(@E等人［!，$］提出。

该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸，例如组氨酸、色氨酸、赖氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而对蛋白质加以分离［7］。

由于它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一［#］。

本文主要以单组分蛋白质牛血清白蛋白（I J6）和血红蛋白为研究对象，考查了23值、铵离子浓度及阴离子等不同洗脱条件对出峰时间的影响。

对不同的金属螯合柱的性能和不同单组分蛋白质的洗脱性能进行了研究，比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别，为实际生物产品的分离奠定了基础。

ida金属螯合亲和层析介质引言：ida金属螯合亲和层析介质是一种重要的生物分离技术，广泛应用于生物医学、生物化学和生物工程等领域。

它是通过金属离子与靶分子之间的特异性配位作用，实现对靶分子的高效分离和纯化的方法。

本文将介绍ida金属螯合亲和层析介质的原理、制备方法、应用领域及发展前景。

一、ida金属螯合亲和层析介质的原理ida金属螯合亲和层析介质的原理基于金属离子与靶分子之间的特异性配位作用。

ida（亚铁二胺四乙酸）是一种广泛应用的金属螯合剂，它能够与多种金属离子形成稳定的配合物。

通过将ida固定在载体上，可以构建ida金属螯合亲和层析介质。

二、ida金属螯合亲和层析介质的制备方法制备ida金属螯合亲和层析介质的方法主要包括固定化ida的选择、载体的选择和固定化方法的选择。

固定化ida时，可以选择将ida 直接固定在载体上，也可以选择使用交联剂将ida与载体交联。

常用的载体包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。

三、ida金属螯合亲和层析介质的应用领域ida金属螯合亲和层析介质在生物医学、生物化学和生物工程等领域有广泛的应用。

在生物医学领域，ida金属螯合亲和层析介质可用于药物分离纯化、疾病诊断和治疗等方面。

在生物化学领域，ida 金属螯合亲和层析介质可用于蛋白质纯化、酶分离和多肽合成等方面。

在生物工程领域，ida金属螯合亲和层析介质可用于基因工程药物的纯化和制备等方面。

四、ida金属螯合亲和层析介质的发展前景ida金属螯合亲和层析介质作为一种高效、选择性的分离技术，具有广阔的发展前景。

随着生物医学和生物工程领域的不断发展，对高纯度生物分子的需求越来越大，ida金属螯合亲和层析介质作为一种有效的分离工具将会得到更广泛的应用。

同时，随着新型材料和新型固定化方法的不断涌现，ida金属螯合亲和层析介质在分离效率和选择性上将会有更大的突破。

结论：ida金属螯合亲和层析介质是一种重要的生物分离技术，通过金属离子与靶分子之间的特异性配位作用，实现对靶分子的高效分离和纯化。

镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用摘要：蛋白质纯化是进行基因工程中最重要的环节，选取纯化蛋白的工具对纯化结果影响巨大。

镍离子亲和层析柱具有特异性高、纯度高、成本低、产量大等优点，镍离子亲和层析柱的国产化将极大促进蛋白质纯化产业的发展并会产生巨大的市场效益。

关键词：镍离子亲和层析柱、蛋白质纯化、国产化亲和层析（Affinity chromatography，AC）是利用生物大分子和固定相表面的亲和配基之间可逆的特异性相互作用，进行选择性分离的一种液相层析分离方法。

常用的亲和层析方式为金属螯合亲和层析,又称固定化金属离子亲和层析( Immobilized metal lchelated affinity chromatography, IMAC)，利用金属离子(Ni2+，Cu2+等)与氨基酸表面的残基(如组氨酸的咪唑基)的配位鳌合作用，来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质。

由于IMAC 具有螯合介质制备简单方便，吸附容量大，选择性及通用性较好，易于再生，成本低等优点, 逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

镍离子亲和层析柱成为金属螯合亲和层析的代表产品。

目前，国外有3-4家镍离子亲和层析柱产品在国内销售，但价格昂贵，国内已有数家公司开展了镍离子亲和层析柱产品的销售，其中，广州精达公司采用最新的镍离子亲和层析柱的制备技术，顺利完成了该种产品的国产化。

I、镍离子亲和层析柱的制备工艺1、Ni2+吸附融合蛋白原理Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有His（组蛋白）标签的碱性蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸（碱性氨基酸）。

同时Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合，利用咪唑梯度洗脱，从而获得纯度较高的融合蛋白。

而利用基因工程技术制备的融合蛋白常携带6个组氨酸的标签，因6个组氨酸标签因肽片段小，故对目标蛋白质的生物活性影响较小，因此被广泛用于重组蛋白的制备及纯化。

2、固相载体的选择常见的固相载体包括为普通琼脂糖颗粒及GE公司生产的Sepharose琼脂糖系列产品。

千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质是一种用于蛋白质纯化的重要工具，在生物技术领域广泛应用。

本文将从其原理、特点、应用以及未来发展方向等方面进行介绍和分析。

一、原理千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质的原理主要是利用镍离子与蛋白质中的组氨酸残基结合的特性，实现对蛋白质的选择性结合和分离。

在琼脂糖基质的支持下，镍nta螯合亲和层析介质可以与目标蛋白质发生专一性结合，并通过洗脱等步骤实现对蛋白质的分离纯化。

二、特点1.高选择性：镍nta螯合亲和层析介质具有较高选择性，能够与蛋白质中的组氨酸残基结合，实现对目标蛋白质的有效分离。

2.良好的生物相容性：介质材料琼脂糖在生物体内具有良好的生物相容性，不会对生物体产生毒副作用。

3.稳定性：介质具有良好的稳定性，可以承受一定的流速和压力，适合于在不同操作条件下进行蛋白质的层析纯化。

三、应用千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质在生物制药、基因工程、生物化学等领域有着广泛的应用，主要体现在以下几个方面：1.蛋白质纯化：通过千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质可以实现对蛋白质的高效分离和纯化，为后续的生物学研究和药物开发提供优质的蛋白质样品。

2.蛋白质结构分析：可用于蛋白质的结构研究和功能分析，为了解蛋白质的结构和功能提供有效手段。

3.抗体制备：可用于从复杂混合物中纯化目标抗体，为抗体制备提供技术支持。

四、未来发展方向千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质作为一种重要的蛋白质纯化工具，其未来发展方向主要有以下几个方面：1.多功能化：将其与其他螯合亲和剂结合，开发出具有多功能性能的层析介质，实现对不同类型蛋白质的快速纯化。

2.自动化：结合自动化技术，实现对层析过程的自动控制，提高工作效率和操作便捷性。

3.高通量：发展高通量的层析介质，满足大规模蛋白质纯化的需求。

千纯镍nta螯合亲和琼脂糖层析介质作为一种重要的蛋白质纯化工具，在生物技术领域具有重要的应用价值，并且其具有良好的发展前景。

金属螯合预装柱（5ml）说明书1. 简介金属螯合亲和层析，又称固定化金属离子亲和层析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC）。

该法利用蛋白质表面的某些氨基酸（如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等）和金属离子（Cu2+、Zn2+、Ni2+等过渡金属离子）发生特殊的相互作用的原理，从而实现蛋白质的分离。

琼脂糖金属螯合介质（Ni-IDA QZT 6FF）是将亚氨基二乙酸（IDA）键合在高流速、高强度的琼脂糖微球上，并螯合金属离子Ni2+而形成的一种亲和层析介质，广泛用于蛋白质、核酸及多肽，尤其是组氨酸标签蛋白质的分离纯化。

2. 产品概述金属螯合预装柱预装了5 ml的Ni-IDA QZT 6FF亲和介质，可直接用于组氨酸标签蛋白质等生物分子的分离纯化，具有使用方便、操作简单、分离纯化效率高的特点。

Ni-IDA QZT 6FF亲和介质具有良好的稳定性、生物相容性和溶剂相容性，这不仅有利于保持产品的生物活性和提高产品的收率，还有利于扩大层析操作条件的选择范围。

Ni-IDA QZT 6FF亲和介质的理化性质和溶剂相容性分别如表1和表2所示。

表1. Ni-IDA QZT 6FF预装柱的理化性质及特征参数参数指标基质6%交联琼脂糖凝胶配基-N(CH2COOH)2 (IDA)形状球形平均粒径90 μm (45~165)金属离子密度~40 μmol Zn2+/ml wet gel动态载量a~25-30 mg蛋白(LDH)/ml wet gel柱体积1ml或5ml柱尺寸（内径x高度）0.9*1.57 cm (1ml柱子) 0.9*1.57 cm (5ml柱子)推荐流速b1ml/min (1ml柱子)或5ml/min (5ml柱子)地址：北京市海淀区中关村北二条1号中国科学院过程工程研究所最高流速b4ml/min (1ml柱子)或20ml/min (5ml柱子) 最高耐压b0.3 MPa (3 bar)化学稳定性c 避免使用的试剂0.01M HCl、0.1 M NaOH（37 °C, 7天）；1M NaOH、70%乙酸（12 h）；30%异丙醇（30 min）；2% SDS（1 h）螯合剂，如EDTA、EGTA、柠檬酸等pH稳定性c2-14（短期，2 h）；3-12（长期，7天）储存条件20%乙醇，4-30 o C动态载量a：样品：平衡缓冲液中含1mg/ml histidine-tagged LDH（Mr 140000）；计算方法：根据10%穿透点计算介质动态载量（Q B, 10%）；柱体积：1 ml或5 ml；流速：0.5 ml/min或2.5 ml/min；平衡缓冲液：20mM PB + 0.1M NaCl + 50 mM 咪唑, pH 7.4；洗脱缓冲液：20mM PB + 0.1M NaCl + 0.5 M 咪唑, pH 7.4；注意：动态载量与蛋白种类和操作条件密切相关。

简述几种柱层析的特点作者：张弓【摘要】柱层析技术在近几十年得到了广泛的应用和不断地发展，已成为各行各业离不开的重要技术。

本文就其中几种常用的柱层析的特点做了综述。

【关键词】凝胶过滤柱层析离子交换柱层析疏水作用柱层析亲和柱层析金属螯合层析在过去的三十年中,分离生物大分子的各种技术和方法得到了不断的发展。

随着各种介质的完善和商品化,使以填料为核心的柱层析技术在蛋白质等粗提后的纯化中起到了重要作用。

本文总结了几种柱层析的特点：一，凝胶过滤柱层析（Gel Filtration Chromatography, GFC）GFC是以分子大小和形状为分离基础的。

具体说就是利用不同大小分子通过凝胶滞留时间的差别来分离混合物的柱层析方法。

另外一种说法是分离是以分子体积的大小为基础的,分子体积即分子溶剂化后的体积,受分子形状和相对分子质量两方面因素的影响。

有时加入变性剂（尿素、盐酸胍等）以破坏蛋白质的三、四级结构,可以使分离主要受控于相对分子质量的大小。

GFC特别适用于分离相对分子质量大于2000的高分子化合物和相对分子质量差异大的混合物及低聚物。

GFC的分离不依赖于流动相和固定相的相互作用,所以不必使用梯度洗脱。

但是由于电荷屏蔽的因素,为了降低填料与生物分子之间的相互作用,往往会适当提高盐浓度,至少高于0.05 mol/LNaCl。

由于试样在柱中的保留时间不会超出柱中溶剂的总体积(Vt) ,所以不会出现在其他液相色谱中经常出现的由于色谱峰的弥散而引起的检测极限。

GFC的容量通常由流动相效应来控制。

由于GFC的分离靠大小组分流程途径长短之差达到分离,柱要有足够的长度(75～100 cm ,)但由于微小的粒子在GFC也有扩散的效应,柱子又不可过长,上样量不可过多(< 20 % Vt)。

因为GFC 洗脱时间可粗略估计,所以再隔一定时间连续进样,提高柱的使用效率,缩短纯化周期。

除了以上特点外,GFC还有回收率较高,洗脱条件温和,不易发生副反应,使用寿命较长,同时可用作换盐等特点。