植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根)培训资料

生命科学学院专业生物技术 2016级生技班666组姓名余梓棋同实验者黄剑宇黄少凯 2018年 5 月 8日题目：植物基因组DNA的提取与检测一．实验目的:1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理；2.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。

二．实验原理1.液氮研磨：液氮能迅速将植物组织温度降到零度以下，使组织细胞变得脆而易碎，此时对植物组织进行研磨，能大大提高研磨的效率，植物组织迅速变为粉末状，增大表面积，提高提取植物DNA的效率。

2.SDS等离子型表面活性剂处理：SDS等离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来，且使DNA保持溶解溶液状态，易于分离3.苯酚和氯仿处理：苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质；4.异丙醇处理：上清液中加入异丙醇使DNA沉淀，离心后DNA沉淀于离心管底部，便于移去提取液。

而后将沉淀DNA溶于TE缓冲液中，即得植物基因组DNA溶液；5.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。

DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。

DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。

因此，要有效地分离不同大小的DNA片生命科学学院专业生物技术 2016级生技班666组姓名余梓棋同实验者黄剑宇黄少凯 2018年 5 月 8日段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。

三．实验材料及设备1.实验材料：新鲜的植物幼嫩叶片2.实验仪器：（1）研磨皿，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，漩涡器；（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。

3.实验试剂：（1）植物DNA提取a.细胞提取液：100mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 5mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl, 1.25% SDS，1%β-巯基乙醇（去除酚类）；b.氯仿:异戊醇（24:1）；c.其它试剂：液氮、无水乙醇、 TE缓冲液、异丙醇、洗涤缓冲液；作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。

植物基因组DNA提取试剂盒使用说明货号：D1500规格：50T/100T保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。

试剂盒内容：50T100TRNase A1ml1ml×2β-巯基乙醇250ul500ul溶液A20ml40ml溶液B7ml14ml溶液C30ml60ml漂洗液15ml15ml×2洗脱液10ml20ml吸附柱50个100个收集管50个100个说明书1份1份产品简介：本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取植物的基因组DNA。

离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，能够高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。

提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。

使用本试剂盒提取的植物基因组DNA可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

操作步骤：使用前先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。

所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1、植物组织预处理：取新鲜植物组织（不超过100mg）或干重组织（不超过20mg），于液氮中充分研磨至细粉状，让液氮自然挥发。

2、将研磨好的植物组织粉末迅速转移到预先装有400ul溶液A、20ul RNase A（10mg/ml）和5ulβ-巯基乙醇的离心管中，充分颠倒混匀，室温放置10min。

3、加入140ul溶液B，充分颠倒混匀，12000rpm离心10min，将上清转移至新离心管(约400-500ul)，注意不要吸入沉淀。

4、加入和上清相同体积的溶液C，充分颠倒混匀，再加入和溶液C相同体积的无水乙醇，此时若出现絮状物，将絮状物吹散后一起加入吸附柱中，12000rpm离心5min，弃废液，一次加不完可分两次加入。

注意：如果吸附柱膜呈绿色或离心时有堵塞现象，可向吸附柱中加入600ul无水乙醇，并适当延长离心时间。

（TSP101）植物DNA提取试剂盒Trelief T M Plant Genomic DNA Kit 植物基因组DNA提取试剂盒（通用型）TSP101本试剂盒采用独特的缓冲液系统配合特异性吸附 DNA的离心柱，可以从植物的根、茎、叶、花、果实、种子等样本中简单、快速、高效地提取基因组 DNA。

获得的基因组DNA完整性好、纯度高、质量稳定，是AFLP、RAPD、SSR 等分子标记，Southern 杂交，常规PCR，文库构建以及基因组测序等分子生物学实验的最佳选择。

试剂盒组成：TSP101-50 (50次) TSP101-200 (200次)RNase A Buffer BL Buffer gP1 Buffer gP2 Buffer PW20 ~ 25℃ 20 ~ 25℃ 20 ~ 25℃ 20 ~ 25℃ 20 ~ 25℃250μ l 13 ml 21 ml 8 ml 12 ml1 ml 55 ml 85 ml 31 ml 46 ml6个月 1年 1年 1年 1年 3个月 1年 3个月 1年 1年 1年第一次使用前加指定量乙醇13 ml 25 ml × 2Wash Buffer TE Buffer Spin Columns20 ~ 25℃ 20 ~ 25℃ 20 ~ 25℃第一次使用前加指定量乙醇 5 ml 50 个 50 个 1份 20 ml 200 个200 个 1份Collection Tubes(2.0ml) 20 ~ 25℃实验操作手册产品特点:简单快速：1 h内即可获得超纯的基因组DNA。

应用广泛：适用于各种植物组织，包括富含多糖、多酚等提取困难样本。

超纯：获得的DNA纯度高、完整性好，可直接用于各种分子生物学实验。

注意事项：1. 检查Buffer gP1 及Buffer Pw是否有固体析出，如有析出，请置于37℃水浴中溶解并摇匀。

2. Buffer PW及Wash Buffer首次使用前加入指定量的无水乙醇，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

植物基因组D NA 提取2ml 离心管提取取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下：1. 2.0 ml 离心管加入离心管盖大小新鲜叶片2片；2. 液氮充分研磨成粉末，加入900 µL CTAB 缓冲液；3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次；4. 置于4℃冰箱冷却至15 ℃以下；5. 加入900 µL25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5 分钟，保证样品与氯仿充分混合；6. 12,000 rpm 离心20-30 分钟；7. 取上清液约800 µL，加入预先加好的700 µL 异丙醇的1.5 ml 离心管中，轻轻上下颠倒混匀；8. -20℃冰箱静止30 分钟以上；9. 12,000 rpm 离心15-20 分钟，弃上清夜；10. 75%酒精洗涤沉淀，弃上清液，12,000 rpm 离心15-20 分钟；11. 风干D NA，让酒精挥发干净（4 小时以上或过夜）；12. 加入100 µL 的纯水（含终浓度为1%RNase）溶解D NA；13. 放入37 ℃环境中，约60 分钟消化R NA；14. 取2 µL DNA 进行检测。

50ml 离心管提取取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下：1. 取新鲜叶片在研钵用液氮研磨成粉末；2. 向50ml 离心管里加入叶片粉末，至刚好覆盖住管圆底部，加入20mlCTAB 缓冲液充分混匀；3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次；4. 取出，冷却至15 ℃以下；5. 加入20ml 的25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5min，保证样品与氯仿充分混合；6. 4500rpm 离心40 分钟；（如不需要抽提第2次，可直接到9步骤）7. 小心吸取上清液至新的50ml 离心管中，加入20ml 的氯仿溶液，混匀2-5min左右8. 4500rpm 离心40 分钟；9. 取上清液于50ml 离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，此时会看到絮状沉淀；10. -20℃冰箱静止30min 以上；11. 4500rpm 离心40min，弃上清夜；12. 加入5ml 的75%酒精洗涤沉淀，4500 rpm 离心30min，弃上清液；13. 风干D NA，让酒精挥发干净（4 小时以上或过夜）；14. 加入约300 µL 的纯水（含终浓度为1%RNase）溶解D NA；15. 放入37 ℃环境中，约60min 消化R NA；16. 取2 µL DNA 进行检测。

实验一植物基因组DNA提取一、目的与原理DNA是绝大多数生物(除少数RNA病毒外)储存、传递信息的生物大分子。

为了进行DNA 分子的体外重组，必须提取具有天然结构并具有一定长度的DNA大分子。

提取分离DNA大分子，有酚法，氯仿一异丙醇法、酶法、SDS法、CTAB法等方法。

主要操作都是围绕如何尽可能除尽结合蛋白质和多糖等杂质，本实验的目的是介绍CTAB法。

CTAB 法提取基因组DNA 原理：CTAB 是一种非离子去污剂。

CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（＞0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1－0.5 mM NaCl）下CTAB－核酸复合物就因浓度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。

经离心弃上清后，CTAB－核酸复合物再用75％酒精浸泡可洗脱掉CTAB。

二、实验材料、仪器和试剂(一) 实验材料：新鲜的植物叶片（水稻叶子），适量液氮(二) 试剂：(1)EDTA溶液(0.5M、pH=8.0、500 mL)(2)Tris·HCl溶液(1.0 M、pH=8.0、500 mL)(3)2％CTAB抽提液(pH=8.0、500 mL)①称取CTAB粉末10.000 g，NaCl粉末40.908 g，PVP 405.000 g；②0.5M EDTA溶液20 mL；1.0M Tris·Cl溶液50 mL；③定溶至500 mL，121℃高压灭菌后，常温放置，待用。

(4)1×TE缓冲液(pH=8.0、200 mL)(5)RNase(10 mg/mL)1.5 mL离心管(121℃高压灭菌)，加入0.015 g RNase，15μL 1M Tris·Cl溶0.001305 gNaCl(几小粒)，无菌ddH2O(重蒸水)定容至1.5 mL，100℃煮15min；低温放置，待用。

(RNaseA，Sigma，M=487.5)。

（三）仪器通风橱、天平、离心机、摇床、微量移液器、水浴锅、研钵三、植物组DNA提取步骤1.准备工作。

产品简介本试剂盒可从植物组织，特别是富含多糖多酚或淀粉的植物组织（如棉花叶片，成熟水稻叶片，拟南芥种子，白松松针，香蕉，枇杷叶片，马铃薯块茎，苹果，梨，西瓜果肉，猕猴桃，月季，烟草，沙棘，百合等）中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。

提取的总RNA纯度高，没有基因组、蛋白和其它杂质的污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。

预防RNase污染，应注意以下几方面：1. 经常更换新手套。

因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2. 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3. RNA在裂解液SL中时不会被RNase降解。

但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

4. 配制溶液应使用RNase-Free ddH2O。

（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，混匀后放置过夜，高压灭菌。

）RNA得率：使用前注意事项：1 操作前在SL中加入β-巯基乙醇至终浓度5%，如475 μl SL中加入25 μl β-巯基乙醇。

此裂解液最好现用现配。

配好的SL 4 ℃可放置一个月，裂解液SL在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请加热溶解后使用。

2 植物组织裂解是否充分直接影响到RNA提取的质量和产量，本试剂盒中提供的裂解液SL，适用于大多数植物组织的裂解，但有些植物组织（例如玉米的乳白色胚乳，红豆种子或小麦种子）或丝状真菌，由于次级代谢产物较特殊，异硫氰酸胍使样品产生沉淀，导致RNA提取效果不佳的现象，此时可以向TIANGEN 公司免费索取另一种裂解液HL，将解决该问题。

3 第一次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。

DNase I储存液的配制将DNase I干粉（1500 U）溶解在550 μl RNase-Free ddH2O中，轻柔混匀，分装后-20℃贮存（可保存9个月）。

新型植物基因组DNA快速提取试剂盒目录号：DN15目录编号包装单位DN1501 50次DN1502 100次DN1503 200次适用范围：适用于快速提取植物组织、细胞、真菌基因组DNA试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存50次100次200次RNase A(10mg/ml) -20℃250 μl500 μl 1 ml 缓冲液AP1 室温25 ml 50 ml 100 ml 缓冲液AP2 室温10 ml 20 ml 40 ml缓冲液AP3/E 室温15 ml 25 ml 50 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇漂洗液WB 室温15 ml 25ml 50ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液EB 室温15 ml 20 ml 40 ml 吸附柱AC 室温50个100个200个收集管（2ml）室温50个100个200个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项:1.裂解液AP1、AP3/E低温时可能出现析出和沉淀，可以在65℃水浴几分钟帮助重新溶解（AP3加入乙醇前可加热，加入乙醇后不可加热），恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

2.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：该试剂盒采用DNA吸附柱和新型独特的溶液系统，适合于从含酚类、多糖类和酶抑制物的植物样品中快速简单地提取基因组DNA。

可在30分钟内完成一个或多个100mg新鲜或20mg干燥的植物样品DNA的纯化工作。

提取过程不需要用到有毒的酚氯仿等有机物抽提，也不需要用到耗时的异丙醇或乙醇沉淀，并能快速高效地去除多糖类、酚类和酶抑制物等杂质，纯化的DNA可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。

新鲜或干燥的植物组织（细胞）磨碎后经裂解液裂解；蛋白质、多糖、细胞残片被沉淀去除；然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 进一步将多糖，多酚和细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒目录号：DN14目录编号包装单位DN1401 50次DN1402 100次DN1403 200次❖适用范围：适用于快速提取植物基因组DNA❖试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存50次100次200次裂解液PL 室温40 ml80 ml 75m l×2结合液PQ 室温15 ml 30 ml 30ml×2第一次使用前按说明加指定量乙醇抑制物去除液IR 室温25 ml 50 ml 100ml漂洗液WB 室温15 ml 25ml 25ml×2第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液EB 室温15 ml 15 ml 40 ml 吸附柱AC 室温50个100个200个收集管（2ml）室温50个100个200个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项:1.裂解液PL、或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在55℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

结合液PQ盐酸胍浓度高，加入乙醇后可能出现一些沉淀不影响使用，直接取上清用。

2.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

❖产品介绍：改进的经典CTAB植物DNA抽提液内（添加多种针对植物特点的多糖、多酚去除成份）迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，氯仿抽提后通过离心清除多糖、多酚和蛋白质（根据需要，上清中还加入异丙醇离心沉淀基因组DNA，进一步去除其它各种杂质），然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，进一步将多糖、多酚和细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

❖产品特点：1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。