酶切及电泳

实验仪器
恒温水浴锅
实验步骤
EP管编号 加样 DNA 1g 管编号, 管编号 反应 10×缓冲液 ×缓冲液2L 重蒸水 19L + 1L酶液 酶液
用手指轻弹管壁使溶液混匀， 用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底
混匀反应体系后， ℃水浴保温2-3h 混匀反应体系后，37℃水浴保温
每管加入2L 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，电泳检测 每管加入 ，
1. 限制性内切酶用量可按标准体系 限制性内切酶用量可按标准体系1g DNA加1单位酶， 消 单位酶， 加 单位酶 化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加 。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3 甚至更多，反应时间也要适当延长。 倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。 2. 酶切时所加的 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则 溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其 溶液体积不能太大 溶液中其 他成分会干扰酶反应。 他成分会干扰酶反应。 3. 许多实验制备的DNA不易于降解，需适当增加酶的使用量。 许多实验制备的 不易于降解，需适当增加酶的使用量。 不易于降解 反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外， 反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液 中的微量杂质可能干扰随后的反应。 中的微量杂质可能干扰随后的反应。 4. 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见， 用酶反应缓冲液（ × 进行稀释。 另外， 用酶反应缓冲液 （ 1× ） 进行稀释 。 另外 ， 酶通常保存在 50%的甘油中 ， 实验中 ， 应将反应液中甘油浓度控制在 的甘油中， 的甘油中 实验中， 1/10之下，否则酶活性将受影响。 之下， 之下 否则酶活性将受影响。

反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了,如果酶减少，可延长反应时 间（16h)；反应体系不应太小,常规的酶切一般要维持在10-50ul。
1.粘性末端形成的氢键在低温下更稳定； 2. 连接反应时间长，低温下酶不容易失活
材料、试剂及器具
1、材料与试剂 连接反应： λDNA/EcoT14 I :由11条DNA片段组成：
19329、7743、6223bp、4254、3472、 2690、1882、1489、925、421、74 bp T4 DNA连接酶及其配套的 10×连接缓冲液 检测： 0.5×TBE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液 、Goldview、琼脂糖
材料、试剂及器具
1、材料与试剂 酶切反应： 标准pUC19(2686bp) EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液
检测：
0.5×TBE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液 、Goldview、琼脂糖
2 、器具： 水平式电泳装置 电泳仪,台式高速离心机 恒温水浴锅（用PCR仪代理） 微量移液枪 微波炉或电炉 紫外透射仪 照相机及其附件
(1)
实 验 原 理 – 连接
DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的 。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或 NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一 DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必 须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶 除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA 连接酶催化成磷酸二酯键。
实验结果分析
关于OD值分析
一40个ugO/mDl2单60n链m单DN位A相或当R于NA于50ug/ml 双链DNA 或 OD260/280: 1.8-2.0 DNA: 1.8 (RNA: 2.0) 比值<1.8：蛋白质污染 比值>2.0: RNA污染

DNA酶切及电泳陈瑞州 201110424108一、实验目的1.掌握DNA酶切的基本原理和方法；2.学习和掌握琼脂糖点样的基本方法；3.学习判断DNA大小的方法。

二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。

通过将酶切后的DNA片段和标准的已知酶切后片段长度的Maker一起跑电泳后，即可得到条带清晰的电泳图谱，从而推测出各DNA片段的大小。

三、实验材料λDNA；EcoR I酶；HindIII酶；BamHI酶；酶切缓冲液；琼脂糖凝胶；ddH2O；buffer四、实验步骤1.DNA酶切反应HindIII酶 2ul EcoR I酶 2ul BamHI酶 2ul ○1 10Xbuffer 2ul（M）○2 10Xbuffer 2ul（H）○310Xbuffer 2ul（H）λDNA 6ul λDNA 6ul λDNA 6ulddH2O 10ul ddH2O 10ul ddH2O 10ulEcoR I酶 1.5ulBamHI酶 1.5ul○4 10Xbuffer 2ul（H）λDNA 6ulddH2O 9ul将灭菌好的离心管编号，用微量移液枪分别加入上述四种反应体系中的试剂，用微量离心机甩一下，使液体集中在管底。

混匀反应体系后，将离心管置于试管架中，于37℃下酶切2-3小时。

2、琼脂糖凝胶电泳用微量移液枪向酶切完全后的上述四个体系的管中各加入2ul loading buffer ，吸取15ul的上述四样液点样，另外两边各用λDNA Marker点样。

于100V下跑电泳30-60分钟，使DNA片段大概跑过凝胶一半左右即可。

于紫外灯下拍照记录。

五、结果分析。

生物化学与分子生物学教研室
生物化学与分子生物学教研室一、实验目的
生物化学与分子生物学教研室二、实验原理
），并在这个顺序
GAATTC
CTTAAG
EcoRⅠ
NNNNNN5’
pTA2载体后获得的重组载体pTA2-p53进行酶切分析，外源p53基因
( p53基因是人体抑癌基因,失活对肿瘤形成起重要作用。

)
带电质点在电场中向与其相反的电极进行泳动的现象。

的磷酸根残基，在
：在电泳前向凝胶预加核酸染料，电泳过程中染料同DNA结合，电泳后在紫外光照射下，可观察到荧光，从
Eppendorf管封上封口膜于３７℃水浴（金属浴）中酶切(酶切时间需小于2小时，以免产生星号活性）。

DNAmarker；泳道2：
电泳检测示例
反应时间：一般酶切鉴定30分钟就可以了,如果酶减少，
一般要求在最后加酶，且。