DNA酶切及凝胶电泳

酶切DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。

DNA酶切及凝胶电泳一.DNA的限制性内切酶酶切分析限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。

它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。

Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。

Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。

Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC ↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。

大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA 的影响。

当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。

如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。

若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。

若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。

质粒DNA的酶切鉴定原理质粒DNA的酶切鉴定是一种常用的实验方法，用于确定质粒DNA的大小和纯度。

酶切鉴定是通过用特定的限制性内切酶切割质粒DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并通过染色或脱染观察分离结果。

限制性内切酶是一类特殊的酶，它们能够识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA分子，产生特定的DNA片段。

酶切鉴定的原理主要包括限制性内切酶的选择、质粒DNA酶切、琼脂糖凝胶电泳和染色观察。

首先，选择适当的限制性内切酶。

限制性内切酶是依据其能够识别的特定DNA 序列而命名的。

在酶切鉴定中，通常使用两个不同的限制性内切酶，因为单个限制性内切酶的选择性有限。

选择限制性内切酶时需考虑酶切位点的位置和数量，以及酶切位点的特异性和完整性。

其次，进行质粒酶切。

通常将质粒DNA与适当的缓冲液和限制性内切酶混合，反应一段时间。

反应结束后，通过热灭活限制性内切酶，停止酶切反应。

酶切反应完成后，会得到经限制性内切酶切割的DNA片段。

然后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。

琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分子量测定方法。

它通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，在电场作用下，DNA片段按照大小被分离。

较小的DNA片段在电场中移动更快，较大的DNA片段移动较慢。

通过检测琼脂糖凝胶上的DNA迁移距离，可以获得质粒DNA的分子量信息。

最后，通过染色观察和图像分析来确定质粒DNA的大小和纯度。

琼脂糖凝胶电泳结束后，通常需要染色来显示DNA片段。

常见的染色剂有溴化乙锭和SYBR Green等。

经过染色的琼脂糖凝胶可以进行观察和记录，并通过分析软件对分离的DNA片段进行测量和分析，得到质粒DNA的大小和纯度信息。

总之，质粒DNA酶切鉴定是通过限制性内切酶切割质粒DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离和染色观察来确定质粒DNA的大小和纯度。

这种方法简便易行，可用于快速鉴定质粒DNA的酶切效果和测定其分子量。

DNA酶切及电泳陈瑞州 201110424108一、实验目的1.掌握DNA酶切的基本原理和方法；2.学习和掌握琼脂糖点样的基本方法；3.学习判断DNA大小的方法。

二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。

通过将酶切后的DNA片段和标准的已知酶切后片段长度的Maker一起跑电泳后，即可得到条带清晰的电泳图谱，从而推测出各DNA片段的大小。

三、实验材料λDNA；EcoR I酶；HindIII酶；BamHI酶；酶切缓冲液；琼脂糖凝胶；ddH2O；buffer四、实验步骤1.DNA酶切反应HindIII酶 2ul EcoR I酶 2ul BamHI酶 2ul ○1 10Xbuffer 2ul（M）○2 10Xbuffer 2ul（H）○310Xbuffer 2ul（H）λDNA 6ul λDNA 6ul λDNA 6ulddH2O 10ul ddH2O 10ul ddH2O 10ulEcoR I酶 1.5ulBamHI酶 1.5ul○4 10Xbuffer 2ul（H）λDNA 6ulddH2O 9ul将灭菌好的离心管编号，用微量移液枪分别加入上述四种反应体系中的试剂，用微量离心机甩一下，使液体集中在管底。

混匀反应体系后，将离心管置于试管架中，于37℃下酶切2-3小时。

2、琼脂糖凝胶电泳用微量移液枪向酶切完全后的上述四个体系的管中各加入2ul loading buffer ，吸取15ul的上述四样液点样，另外两边各用λDNA Marker点样。

于100V下跑电泳30-60分钟，使DNA片段大概跑过凝胶一半左右即可。

于紫外灯下拍照记录。

五、结果分析。

质粒DNA酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定组员：孙慜、孙苏、谢拓燕、郑倩倩、王佳玲【实验目的】1、了解DNA的限制性内切酶酶切的基本原理2、学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术【实验原理】①DNA的限制性内切酶酶切原理（1）限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA，但不能切单链DNA。

它可分为三类:I类和III类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。

III类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。

Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5‘- G↓AATTC-3‘), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。

Ⅱ类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3‘); 有的切割位点在对称轴一侧, 产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5‘…G↓AATTC…3‘→5‘… G AATTC…3‘3‘…CTTAA↑G …5‘→3‘… CTTAA G…5‘DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。

在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。

②琼脂糖凝胶电泳条带的观察：（2）通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。

DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法一、电泳前准备准备内容作用 1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净防止不必要的重复污染，减少外来的污染。

梳子干净晾干有利于梳孔的形成。

2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。

3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。

4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶实验记录备查最终越薄越好。

二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。

瓶子。

因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。

保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。

3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手制胶的桌面相对水平。

倒胶时尽量减少气泡的产生。

可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓次性倒入。

梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔度为0.5ug/ml。

不宜过低，染色成像不明显；不宜过的体积能点的下所有的样。

用枪头赶掉气泡。

高，导致背景太深。

摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。

高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。

4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。

时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。

5.拔梳子，放入电泳槽。

缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。

暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。

电泳液要浸没胶1mm。

三、上样电泳步骤注意事项 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。

实验6 DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳目的要求（1）掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。

（2）学习利用琼脂糖凝胶电泳方法测定DNA片段大小。

（3）学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。

原理DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。

不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电脉时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（菲啶溴红）染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。

琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅为0.5—1μg，超薄型平板琼脂糖凝胶电泳所需DNA 可低于0.5μg。

溴乙锭检测DNA，灵敏度很高，10ng（10-9g）或更少的DNA即可检出。

DNA在凝胶中的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。

将未知DNA 的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA 片段的大小。

质粒DNA分子量一般在106—107范围内，如质粒pBR322的分子量为2.8×106。

质粒DNA在细胞内存在可以有3种形式；共价闭环(ccc DNA)、线形DNA和开环的双链环状（opDNA）。

电泳时，同一质粒超螺旋DNA的泳动速度比开环和线形DNA的泳动速度为快。

提取制备的质粒DNA中，常存在超螺旋和开环DNA，在凝胶板上即可显示出2条迁移位置不同的荧光条带（见图34.1）。

本实验采用限制性内切酶Hind Ⅲ或EcoR Ⅰ酶解λDNA的片段为标准物，建立其酶切图谱，同时以酶解各片段的分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上，连接各点绘帛出测定DNA分子量的标准曲线。

共价闭环质粒pBR322 DNA只有一个EcoR Ⅰ酶切位点，酶解后成为一条完整线状DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，测量酶解后线型DNA的迁移距离，可以直接在分子量标准曲线上得出其分子大小。

同时通过与标准pBR322 EcoR Ⅰ酶切图谱的比较分析，可以对提取质粒DNA进行鉴定。

dna酶切实验报告DNA 酶切实验报告一、实验目的本次 DNA 酶切实验的目的在于掌握 DNA 酶切的基本原理和操作方法，了解限制性内切酶的特性和作用，通过对特定 DNA 片段的酶切，为后续的分子生物学实验如 DNA 连接、克隆和基因分析等提供基础。

二、实验原理DNA 酶切是一种分子生物学技术，基于限制性内切酶对特定 DNA序列的识别和切割作用。

限制性内切酶能够识别双链 DNA 分子中特定的碱基序列（通常为 4 8 个碱基对），并在特定的位点进行切割，产生具有粘性末端或平末端的 DNA 片段。

不同的限制性内切酶具有不同的识别序列和切割方式。

在本实验中，我们使用了具体限制性内切酶名称，其识别序列为具体序列，切割后产生粘性末端/平末端。

三、实验材料与设备1、实验材料待酶切的 DNA 样品（如质粒 DNA 或基因组 DNA）限制性内切酶酶的名称及来源酶切缓冲液琼脂糖上样缓冲液DNA 分子量标准2、实验设备移液器恒温培养箱电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、准备酶切反应体系按照实验要求，在无菌的离心管中依次加入适量的 DNA 样品、限制性内切酶、酶切缓冲液和无菌去离子水，使总体积达到具体体积。

轻轻混匀反应体系，短暂离心使液体集中在管底。

2、酶切反应将离心管放入恒温培养箱中，在设定温度下孵育反应时间。

3、终止酶切反应取出离心管，加入适量的上样缓冲液终止反应。

4、琼脂糖凝胶电泳制备浓度的琼脂糖凝胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液。

将酶切产物与 DNA 分子量标准分别加入凝胶的加样孔中。

接通电源，以电压进行电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移到适当位置。

5、凝胶成像观察电泳结束后，将凝胶放入凝胶成像系统中观察并拍照，记录酶切结果。

五、实验结果与分析1、电泳结果通过凝胶成像系统观察到清晰的 DNA 条带。

DNA 分子量标准呈现出预期的条带分布，用于估计酶切产物的大小。

酶切后的 DNA 样品显示出与预期相符的片段大小，表明酶切反应成功。

《基因工程与细胞工程》质粒DNA的限制性酶切及琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱实验【实验目的】1、掌握实用的分子生物学基本操作技术；2、提高处理DNA样品的操作技能；3、学会使用限制性内切酶对DNA样品进行酶切；4、学会配制琼脂糖凝胶；5、学会使用电泳技术分析和鉴定DNA分子。

【实验原理】1、质粒DNA的限制性酶切DNA的酶法操作是DNA重组技术中一项最常用的工具。

特别是一系列限制性内切核酸酶的使用，能够在特异性位点切割DNA，对从分子水平上认识基因的结构与功能和进行重组DNA技术研究是非常有用的。

限制性内切酶来源于细菌，能够在特异性的目标序列中（即限制性酶切位点）切割双链DNA，从而产生特定的DNA片段（即限制性酶切片段）。

内切酶是细菌限制与修饰体系中的一员，能够使细菌细胞免受外源性DNA的侵害，即通过切割噬菌体DNA中的特异性位点来限制细菌噬菌体的繁殖，从而抑制噬菌体对细菌细胞内的入侵。

细菌通过修饰限制酶的识别位点来防止限制酶破坏其自身的DNA，通常是利用对识别位点中1个碱基的甲基化修饰来实现的。

历年来，从细菌细胞内分离纯化的限制性内切酶的种类在不断增加，并越来越多的被分子生物学家应用到DNA的体外操作中。

每种限制酶都能识别1段特异的DNA序列，其中最常见的是长度为4-6 bp的回文序列（反向重复序列）。

同时，不同种类的限制酶在识别的切割位点是不同的，有些可能是在识别位点的中间切开，产生平末端（钝末端）；而另一些限制酶可能是将识别位点错位切开，生成5’或3’突出末端（黏性末端）。

表2列举了本实验中所使用的2种限制酶的识别位点和切割位点。

表2 2种限制酶的识别位点和切割位点注：↓或↑：表示酶切位点。

2、DNA限制性内切酶酶切图谱（1）图谱简介DNA限制性内切酶酶切图谱，又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。

在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性片段长度多态性）技术更是建立在它的基础上。

质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分析摘要限制性内切酶发现于某些大肠杆菌体内，能够“限制”噬菌体对其感染并帮助将已殖入的噬菌体序列移除，可以识别双链DNA上特异序列（限制性位点）并酶切。

限制酶极大地促进了分子生物学、基因工程与遗传工程领域的进展。

[1]本实验通过对大肠杆菌质粒DNA的酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，与未酶切的质粒DNA比较，分析酶切结果。

同时，本次电泳还鉴定了提取纯化的大肠杆菌基因组DNA的纯度，以及大肠杆菌HSP70基因的PCR产物。

关键词限制性内切酶；琼脂糖凝胶电泳引言自从从嗜血杆菌(Haemophilus influenza)中分离到第一种限制性内切酶---HindⅢ,[2]人们开始意识到限制性内切酶的巨大应用前景。

Daniel Nathans,Werner Arber和Hamilton O. Smith在1978年即因限制性内切酶的发现和在分子遗传学的应用被授予诺贝尔生理与医学奖。

人们将限制性内切酶应用到DNA重组技术中，在用基因重组型大肠杆菌大规模生产人胰岛素获得巨大的成功。

现在限制性酶切与PCR一样成为分子生物学中最常用的实验手段之一。

限制性内切酶被分成四种：Types I,II,III和IV。

Types I酶切位点距离识别位点较远，是具有限制性内切和甲基化修饰的多功能酶，作用时需要ATP和硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine），如EcoB,EcoK。

Types II酶切位点位于识别位点之中会较近距离，只具有限制性内切的单功能酶，作用时需要Mg2+，如EcoRI,HindIII。

Types III酶切位点距离识别位点较近，具有限制性内切活性，也被发现是修饰性甲基化酶复合物的一部分。

作用时需要ATP（但不水解ATP）和硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine）刺激反应，如EcoPI, HinfIII。