寡核苷酸图谱分析

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[说明]核酸分子杂交及PCR技术

核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。

待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。

二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。

2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。

常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。

三、核酸分子杂交的基本原理1、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。

﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。

﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。

﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。

可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。

以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。

增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。

DNA热变性现象双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。

同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。

由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。

增色效应和减色效应当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。

变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。

A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。

【国家自然科学基金】_寡核苷酸引物_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140802

推荐指数 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2009年序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
科研热词麻风/遗传学角膜表达载体荧光定量pcr 肽指纹图谱等位基因真菌病原体汉族整合素悬浮芯片微丝蛋白质类巨噬细胞寡核苷酸序列分析基因芯片催化性 α mβ 2i-结构域 dnaworks dna
2011年序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
2011年科研热词微卫星 rapd 黑斑原(鱼兆) 高分辨基因分型非结构蛋白基因遗传多样性造血干细胞移植连接背角无齿蚌胃癌等位基因频率磁珠大娄山多态性多位点缺失突变的校正基孔肯雅病毒基因表达谱基因合成基因反义寡核苷酸原核表达人类白细胞抗原人端粒酶逆转录酶基因 tcr基因重排 pept2 lm-pcr fine-tiling 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2014年序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

2014年科研热词高分辨基因分型食管癌细胞随机十五肽适配子荧光原位杂交脐血肽库移植染色体臂和区段染色体畸变sybr greenⅰ pcr hla bac dna 推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

兽医生物制品学

生物技术诊断制剂
姓名导师学号专业
何俊黄毓茂 2004228044 预防兽医传染病
生物技术诊断制剂
随着分子生物学的飞速发展，随着分子生物学的飞速发展，新型诊断技术不断涌现，断涌现，与之相配套的生物技术诊断制剂也应运而生，尤其是基于分子水平的诊断制剂发展迅猛。而生，尤其是基于分子水平的诊断制剂发展迅猛。生物技术诊断制剂大致包括重组表达抗原（ antigen）、重组表达抗原（recombinant antigen）、核酸探针（ probe）、核酸探针（nucleic acid probe, gene probe）、聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR） PCR）基因芯片（ ch制剂不仅特异性强，生物技术诊断制剂不仅特异性强，而且可以获得常规方法无法制备的一些诊断制剂，得常规方法无法制备的一些诊断制剂，或能克服常规程序制备的诊断制剂的缺陷。同时，常规程序制备的诊断制剂的缺陷。同时，基于生物技术制备的诊断制剂易于标准化、产业化。物技术制备的诊断制剂易于标准化、产业化。
二：基因探针的标记方法
1.放射性探针的标记法 1.放射性探针的标记法缺口平移标记法：在适当浓度的DNaseⅠ作用下， DNaseⅠ作用下缺口平移标记法：在适当浓度的DNaseⅠ作用下，在双链DNA上随机造成3 OH端缺口 DNA上随机造成端缺口，在双链DNA上随机造成3’-OH端缺口，而大肠杆菌 DNA聚合酶有修补缺口的能力，其具有5 →3’ 聚合酶Ⅰ DNA聚合酶Ⅰ有修补缺口的能力，其具有5’→3’外切酶活性，在缺口处按5 →3’方向切除单核苷酸；切酶活性，在缺口处按5’→3’方向切除单核苷酸；同时有5 →3’的聚合酶活性，在缺口处3 同时有5’→3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，因而可从切口的5 物中的单核苷酸，因而可从切口的5’除去核苷酸并与3 端核苷酸的加入同时进行，以互补的DNA DNA单并与3’端核苷酸的加入同时进行，以互补的DNA单链为模板合成新的DNA DNA，链为模板合成新的DNA，这时在反应液中加入一种或多种标记的核苷酸（ 32,H或多种标记的核苷酸（P-32,H-3）,从而形成高放射性的DNA DNA探针射性的DNA探针

微生物鉴别方法

微生物鉴别方法一、微生物鉴别方法——传统方法在传统的分类鉴定中，微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。

在鉴定时，我们把这些依据作为鉴定项目，进行一系列的观察和鉴定工作。

1、形态学特征（1）细胞形态在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。

（2）群体形态群体形态通常是指以下情况的特征：在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。

如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。

2、生理生化反应特征（1）利用物质的能力包括对各种碳源利用的能力（能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等）、对各种氮源的利用能力（能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等）、能源的要求（光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等）、对生长因子的要求（是否需要生长因子以及需要什么生长因子等）。

（2）代谢产物的特殊性这方面的鉴定项目非常多，如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等。

（3）与温度和氧气的关系测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。

对氧气的关系，看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。

3、生态学特征生态学特征主要包括它与其他生物之间的关系（是寄生还是共生，寄主范围以及致病的情况）。

在自然界的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是否耐高渗、是否有嗜盐性等）。

中药指纹图谱的原理与应用

高效液相色谱(HPLC) 具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高、
方法重现性好、选择性高、适用的样品类型广泛等特点。已经普遍应用于中药材及制剂的分析检测，特别是三维高效液相色谱法，近年来发展很快，非常适合构建中药指纹图谱。与薄层色谱相比，它是封闭系统色谱，受外界影响小，色谱稳定性、重现性好，其分离、鉴别能力远远高于薄层色谱。在中药指纹图谱中首推高效液相色谱指纹图谱。HPLC所分析的中药中，有相当部分为次生代谢产物，而这些产物的组成和含量不仅和药材本身的种属有关，同时还与植物后天所处的地域环境、生长条件、采摘时间和炮制方法有很大的关系。对于中成药来说，与产品的加工过程也有很大的联系。不同的加工过程与方法都将对所得的指纹图谱有相当影响，表现在峰高、峰面积、保留时间以及峰数量上的变化等。因此，HPLC不仅可以用来对生药的真伪、优劣进行鉴定，同时还可以对中药的加工过程进行监测，可以有效地分析鉴定经过不同的炮制、加工的中成药。
中药紫外光谱 (UV) 特征的差异，在 — 定
程度上反映了中药化学成分的差异。某些情况下，伪品虽可在外观上以假乱真，但其化学成分的组成和含量与正品必有差异，这种差异在紫外光谱上必有所反映。如果中药亲缘相近而紫外光谱不易区别，可采用多阶导数光谱法提高分辨率。
红外光谱 (IR) 一直是药品鉴定的权威方法，但
X射线衍射法(XRD)是研究物质的物相和晶体
结构的主要方法。当对某一物质进行衍射分析时，该物质被射线照射而产生不同程度的衍射现象。物质的组成、晶型、分子内成键方式、分子的构型等决定该物质产生特有的衍射图谱。如果是混合物，则所得衍射图是各组成成分衍射效应的叠加。只要混合物的组成是恒定的，衍射图就可作为混合物的特征谱。衍射法所获得的信息量大，指纹性强，稳定可靠，是中药定性鉴别的可靠依据。另外，该方法所需样品量小，不破坏样品，操作简单。

中级卫生专业资格微生物检验技术主管技师中级模拟题2021年(6)_真题-无答案

中级卫生专业资格微生物检验技术主管技师（中级）模拟题2021年(6)(总分96.97,考试时间120分钟)A1/A2题型1. PCR反应的基本过程是A. 退火-DNA合成-变性B. DNA合成-退火-变性C. 变性-DNA合成-退火D. 变性-退火-DNA合成E. DNA合成-变性-退火2. 干热灭菌法杀死芽胞需要的温度和时间为A. 100～120℃，2hB. 110～150℃，2hC. 120～140℃，1.5hD. 160～180℃，1hE. 160～180℃，2h3. AFLP的含义是A. 扩增片段长度多态性B. 氨基酸序列分析C. 聚合酶链反应D. 核酸内切酶片段多态性E. 寡核苷酸指纹图谱4. 病毒科名的共同词尾是A. -coccusB. -viriesC. -virinaeD. -viridaeE. -virus5. 支原体与细菌L型的区别，说法正确的是A. 二者在自然条件下广泛存在B. 二者菌落大小一致C. 支原体在固体培养基上生长，形成明显油煎蛋样集落，细菌L型油煎蛋样菌落不典型D. 二者均需高渗培养基培养E. 在一定条件下均可恢复为原菌6. 粪大肠菌群检测复发酵试验的培养温度是A. （28±1）℃B. （36±1）℃C. （37±1）℃D. （40±1）℃E. （44.5±0.2）℃7. 动物试验常用于测定细菌的A. 型别B. 产毒性C. 基因变异D. 能量代谢E. 质粒8. B细胞第一个合成产物是A. IgMB. IgGC. μ链D. γ链E. α链9. 关于PCR的叙述，不正确的是A. 微量的DNA污染不可能造成假阳性结果B. PCR是以指数方式扩增的C. 除酶及不耐高温物质外，所有试剂或器材均应高压灭菌D. 配置液体的容器不能污染过DNAE. 移液的塑料吸头和反应的塑料管必须是一次性使用10. 军团菌引起病灶的主要部位是A. 扁桃体B. 咽部C. 气管D. 肺泡E. 细支气管11. 化妆品真菌和酵母菌培养观测的温度和时间一般是A. 37℃，24hB. 35℃，48hC. 28℃，72hD. 28℃，48hE. 37℃，72h12. 关于金黄色葡萄球菌的描述，正确的是A. 革兰染色阴性B. 能产生凝固酶C. 不耐高盐D. 营养要求高E. 肠道为主要带菌部位13. 95%的乙醇溶液比70%～75%的乙醇溶液消毒效果差，是因为A. 95%乙醇使菌体表面蛋白迅速变性凝固，妨碍乙醇再渗透B. 迅速抑制表面的酶活性，而内部酶没失活C. 缺少一定比例水分，抑制细胞壁合成能力差D. 乙醇浓度高，改变细菌细胞壁的通透性效果差E. 乙醇浓度高，干扰细菌代谢能力差14. 大肠埃希菌最早进入人体的时间是A. 出生时B. 出生后数小时C. 出生后数天D. 出生后数月E. 出生后1年15. 超声波清洗仪的使用原理是A. 超声波在空气中的液化作用B. 超声波的清洁作用C. 超声波的共振作用D. 超声波在液体中的空化作用E. 超声波的消毒作用16. 菌种（悬液）在冻干前中应加入的保护剂一般是A. 肉汤B. 肝汤C. 脱脂牛乳D. 生理盐水E. 磷酸缓冲液17. IgG和IgA的绞链区位于A. VH上B. CH1与CH2之间C. CH2与CH3之间D. CH3与CH4之间E. CHl上18. 在凝胶电泳中，DNA构象不同泳动率不同，通常是A. 切口环状>线性>超螺旋B. 线性>超螺旋>切口环状C. 超螺旋>线性>切口环状D. 线性>切口环状>双螺旋E. 切口环状>超螺旋>线性19. 旅店客房内需检测的空气微生物指标为A. 金黄色葡萄球菌B. 总大肠菌群C. 细菌总数D. 肺炎链球菌E. 粪大肠菌群20. 医疗机构污水样品的保存温度和时间为A. 0℃以下，4h内检测B. 4℃以下，2h内检测C. 4℃以下，4h内检测D. 8℃以下，2h内检测E. 0℃以下，6h内检测21. 志贺菌检验时，增菌时间缩短是因为A. 其他肠道致病菌过多而影响分离B. 非致病菌过多而影响分离C. 条件致病菌过多而影响分离D. 非肠道致病菌过多而影响分离E. 其他肠道非致病细菌过多而影响分离22. 对食品中志贺菌进行增菌培养的最佳温度和时间分别是A. 30℃，24～48hB. 35℃，6～8hC. 35℃，24～48hD. 36℃，6～8hE. 37℃，18～24h23. 能引起肾小球肾炎的是A. 链球菌B. 变形杆菌C. 李斯特菌D. 布鲁菌E. 铜绿假单胞菌24. 分光光度仪检测细菌所用的波长为A. 304nmB. 340nmC. 450nmD. 270nmE. 600nm25. 负责建立各种计量基准器具，作为统一全国量值最高依据的部门是A. 国务院计量行政部门B. 各级计量行政部门C. 市级计量行政部门D. 省级以上计量行政部门E. 县级以上计量行政部门26. 地方性斑疹伤寒的传播媒介是A. 螨B. 白蛉C. 鼠蚤D. 鼠虱E. 人虱27. 转化是指A. 细菌通过性菌毛将遗传物质从供体菌转给受体菌B. 内源性DNA释放到菌体外的过程C. 外源性质粒导入细菌的过程D. 以温和噬菌体为载体，将供体菌DNA转移到受体菌内E. 两种细菌失去细胞壁后彼此融合28. 化妆品样品包装量<20g时，采样量总量应A. >15gB. >5gC. >12gD. >16gE. >8g29. 医疗机构污水总余氯检测时，不正确的操作是A. 在污水最终排放口处采样B. 经过连续处理装置的污水，每日至少检测2次C. 采样后立即测定D. 避免强光、振摇及温热E. 水样温度应为10～15℃30. 大肠菌群是作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中A. 有否污染条件致病菌的可能B. 有否污染致病微生物的可能C. 有否污染人畜共患病原菌的可能D. 有否污染肠道致病菌的可能E. 有否污染肠道非致病菌的可能31. 用于蛋白质分离的试验方法是A. 聚合酶链反应B. 脉冲场凝胶电泳（PFGE）C. Northern印迹杂交D. 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）E. Southern杂交32. 可以用来加热的玻璃仪器是A. 量筒B. 平皿C. 试剂瓶D. 烧杯E. 容量瓶33. 培养细胞前生物安全柜或超净工作台要经紫外线消毒，照射时间最好为A. 15minB. 25minC. 30minD. 45minE. 60min34. 免疫球蛋白中相对分子质量最大的是A. IgAB. IgMC. IgDD. IgGE. IgE35. 在我国乙脑的主要传播媒介是A. 热带家蚊B. 三带喙库蚊C. 白纹伊蚊D. 中华按蚊36. 分离肠道致病菌常用的培养基是A. 普通琼脂培养基B. BCYE培养基C. 高盐甘露醇琼脂D. 麦康凯培养基E. 血琼脂培养基37. 化妆品中如检出粪大肠菌群或其他致病菌，自报告发出之日起该菌种及样品应保存A. 5dB. 10dC. 15dD. 30dE. 20d38. 医疗机构污水中总余氯检测结果偏低的因素不包括A. 水样经强光照射B. 水样经过振荡C. 水样温度过高D. 水样立即检测E. 水样放置一段时间后检测39. 致泻大肠埃希菌检验的样品后，应预冷藏的食品是A. 液体食品B. 加工食品C. 豆制品D. 未加工食品E. 易腐食品40. SDS-PAGE缓冲液中的重要成分为A. 赖氨酸B. 苯丙氨酸C. 色氨酸D. 鸟氨酸E. 甘氨酸41. 超低温冰箱的空气过滤网应A. 至少1个月清洗1次B. 每半年清洗1次C. 3个月清洗1次D. 5个月清洗1次E. 10个月清洗1次42. 普通显微镜的人工光源不可调节功能的是A. 强弱B. 位置C. 照射方向D. 与显微镜之间的距离E. 焦距43. 再次免疫应答与初次免疫应答相比，突出特点是B. 需抗原量大C. IgG类抗体剧增D. 抗体产生减少E. 抗体维持时间短44. 口蹄疫病毒主要感染的动物是A. 啮齿类动物B. 哺乳动物C. 野生动物D. 偶蹄动物E. 灵长类动物45. 神奈川现象是指A. 乙型溶血性链球菌引起的特征性溶血反应B. 金黄色葡萄球菌产生的特征性凝血反应C. 肠出血性大肠埃希菌产生的特征性溶血反应D. 甲型溶血性链球菌产生的特征性溶血反应E. 致病性副溶血性弧菌产生的特征性溶血反应46. 化妆品检测用的卵磷脂琼脂培养基中的卵磷脂、吐温80是A. 抑制剂B. 中和剂C. 溶解剂D. 显色剂E. 保护剂47. 检测医疗机构污泥蛔虫卵时，不正确的是A. 样品后应立即检验B. 若不能立即检验可加入5ml3%甲醛溶液C. 如不能立即检验应放入5～10ml5%甲醛溶液D. 若不能立即检验可加入5ml3%盐酸溶液E. 不能立即检验的样品应放入冰箱内保存48. 致泻大肠埃希菌的血清学试验分A. 假定试验或证实试验B. 假定试验和证实试验C. 多价血清检测和单价血清检测D. 凝集试验和抗凝试验E. 玻片凝集试验和试管凝集试验49. 衣原体网状体的特点包括A. 有感染性B. 有细胞壁结构C. 无感染性D. 无繁殖能力E. 又称原体50. 振荡器混合液体时，容器内液体不应超过容器体积的A. 1/2B. 1/3C. 2/3D. 1/4E. 3/451. 颗粒性抗原进行抗原抗体反应，所出现的反应是A. 沉淀反应B. 环状反应C. 凝集反应D. 琼脂扩散反应E. 无反应52. 血清学试验中出现最明显反应的抗原：抗体的比例是A. 2：1B. 1：2C. 1：3D. 2：3E. 3：253. 有包膜和无包膜病毒的鉴别是根据A. 对乙醇敏感性B. 对脂溶剂敏感性C. 对紫外线敏感性D. 对甘油的敏感性E. 对干扰素敏感性54. 根据志贺菌属O抗原结构的不同，可分为4群，其中C群为A. 鲍特志贺菌B. 痢疾志贺菌C. 宋内志贺菌D. 沙氏志贺菌E. 福氏志贺菌55. 自然沉降法采集空气中微生物样品时采样高度为A. 0.5～1.0mB. 0.8～1.5mC. 1.0～1.2mD. 1.2～1.5mE. 0.8～1.2m56. 不可报告化妆品中检出金黄色葡萄球菌的是A. 血琼脂平板有典型或可疑菌落生长B. 染色镜检为革兰阳性葡萄球菌C. 发酵甘露醇产酸D. 分离菌株血浆凝固酶试验阳性E. 分离菌株血浆凝固酶试验阴性57. 荚膜肿胀试验可以快速鉴定的细菌是A. 军团菌B. 脑膜炎奈瑟菌C. 肺炎链球菌D. 淋病奈瑟菌E. 甲型溶血性链球菌58. 单克隆抗体制备过程中，选择BALB/C小鼠，其要求一般为A. 6～8周龄雌性B. 6～8周龄雄性C. 4～5周龄雌性D. 4～5周龄雄性E. 8～10周龄雄性59. 隔水式普通培养箱是实验室的首选培养箱，是因为A. 价格低廉B. 箱内各部温度恒定C. 使用电热管加温D. 具有良好的隔热性能E. 培养箱上下温差比较大60. 暗视野显微镜最高可分辨A. 0.01μmB. 0.02μmC. 0.03μmD. 0.04μmE. 0.05μm61. 撞击式空气微生物采样器是通过抽气动力作用，使悬浮在空气中的带菌粒子撞击到A. 培养基平板上B. 液体培养基上C. 溶液液面上D. 滤网上E. 滤膜上62. 限制性核酸内切酶在切割DNA分子时A. 能识别DNA分子中特异核苷酸序列B. 随机切割DNA分子C. 切割自身DNA分子D. 识别DNA的冈崎片段E. 把DNA分子水解为单核苷酸63. 显微镜镜下观察时，菌体末端是尖的，形态细小，呈弧形、螺旋形或"海鸥展翅"状的细菌是A. 霍乱弧菌B. 产单核李斯特菌C. 弯曲菌D. 假结核耶尔森菌E. 变形杆菌64. 冻干前在菌种悬液中加入的保护剂是A. 二甲亚砜B. 甘油C. 脱脂乳粉D. EDTAE. 磷酸缓冲液65. 抗结核药物中，RFP代表A. 异烟肼B. 利福平C. 乙胺丁醇D. 对氨基水杨酸E. 雷米封66. 培养基的无菌试验，在37℃温箱中培养A. 16hB. 18hC. 24hD. 48hE. 72h67. 可以准确测量病毒体大小的方法是A. 电镜观测法B. 光镜观测法C. X线衍射法D. 超速离心法E. 超过滤法B1题型1. 过氧乙酸用于A. 新生儿预防淋菌性眼结膜炎B. 皮肤黏膜消毒C. 冲洗尿道进行消毒D. 自来水消毒E. 针对SARS冠状病毒进行空气消毒2. 抗-HBsA. 检测为阳性说明机体感染了HBVB. 检测为阳性时说明体内产生免疫力C. 检测为阳性时说明病毒在复制D. 乙肝检测"两对半"指标中不包括E. 表明机体处于感染恢复期3. 半固体传代保存方法用于A. 保存短期使用的工作菌种（3～6个月）B. 长期保存菌种（>10年）C. 长期保存菌种（<10年）D. 短期保存菌种（1个月）E. 保存脑膜炎奈瑟菌4. 氯气用于A. 新生儿预防淋菌性眼结膜炎B. 皮肤黏膜消毒C. 冲洗尿道进行消毒D. 自来水消毒E. 针对SARS冠状病毒进行空气消毒5. HbcAgA. 检测为阳性说明机体感染了HBVB. 检测为阳性时说明体内产生免疫力C. 检测为阳性时说明病毒在复制D. 乙肝检测"两对半"指标中不包括E. 表明机体处于感染恢复期6. 火箭电泳用于A. 分离小片段核酸B. 分离大片段核酸C. 分离血清蛋白D. 测定抗体含量E. 测定抗原含量7. 称取2.145gKCl应使用A. 十分之一天平B. 百分之一天平C. 千分之一天平D. 万分之一天平E. 十万分之一天平8. 军团菌为A. 革兰阳性球菌B. 革兰阴性球菌C. 革兰阳性杆菌D. 革兰阴性杆菌E. 抗酸阳性杆菌9. 可在低温（4℃）生长的细菌是A. 链球菌B. 肉毒杆菌C. 蜡样芽孢杆菌D. 铜绿假单胞菌E. 李斯特菌10. 聚丙烯酰胺电泳用于A. 分离小片段核酸B. 分离大片段核酸C. 分离血清蛋白D. 测定抗体含量E. 测定抗原含量11. 称取3.1245gNaCl应使用A. 十分之一天平B. 百分之一天平C. 千分之一天平D. 万分之一天平E. 十万分之一天平12. 肺炎链球菌为A. 革兰阳性球菌B. 革兰阴性球菌C. 革兰阳性杆菌D. 革兰阴性杆菌E. 抗酸阳性杆菌13. 所产毒素表现为神经毒性的细菌是A. 链球菌B. 肉毒杆菌C. 蜡样芽孢杆菌D. 铜绿假单胞菌E. 李斯特菌14. 脉冲场电泳用于A. 分离小片段核酸B. 分离大片段核酸C. 分离血清蛋白D. 测定抗体含量E. 测定抗原含量15. 在碱裂解法提取质粒时，沉淀质粒DNA的试剂是A. SDSB. EDTAC. 异丙醇D. 75%乙醇E. 无水乙醇16. 肠道致病菌是A. 传染病医疗机构污水需增测的项目B. 结核病医疗机构污水需增测的项目C. 医疗机构污泥排放需增测的项目D. 医疗机构污水常规检测项目E. 采用含氯消毒剂进行消毒的医疗机构污水需增测的项目是17. HBcAg是A. HBV复制的标志B. 与HBV病毒中和作用有关的抗原成分C. HBV病毒核心的主要抗原成分D. 诊断甲型肝炎最常用和可靠的血清学指标E. 进行甲型肝炎流行病学调查18. 人宫颈癌细胞A. MDCKB. VeroC. MA104D. Hep-2E. HeLa与所列英文名称相对应的细胞是19. 裂解细菌的试剂是A. SDSB. EDTAC. 异丙醇D. 75%乙醇E. 无水乙醇20. 结核分枝杆菌是A. 传染病医疗机构污水需增测的项目B. 结核病医疗机构污水需增测的项目C. 医疗机构污泥排放需增测的项目D. 医疗机构污水常规检测项目E. 采用含氯消毒剂进行消毒的医疗机构污水需增测的项目是21. 抗-HAV IgM是A. HBV复制的标志B. 与HBV病毒中和作用有关的抗原成分C. HBV病毒核心的主要抗原成分D. 诊断甲型肝炎最常用和可靠的血清学指标E. 进行甲型肝炎流行病学调查22. 非洲绿猴肾细胞A. MDCKB. VeroC. MA104D. Hep-2E. HeLa与所列英文名称相对应的细胞是23. 1%硝酸银溶液用于A. 新生儿预防淋菌性眼结膜炎B. 皮肤黏膜消毒C. 冲洗尿道进行消毒D. 自来水消毒E. 针对SARS冠状病毒进行空气消毒24. 蛔虫卵死亡率是A. 传染病医疗机构污水需增测的项目B. 结核病医疗机构污水需增测的项目C. 医疗机构污泥排放需增测的项目D. 医疗机构污水常规检测项目E. 采用含氯消毒剂进行消毒的医疗机构污水需增测的项目是25. HBsAg是A. HBV复制的标志B. 与HBV病毒中和作用有关的抗原成分C. HBV病毒核心的主要抗原成分D. 诊断甲型肝炎最常用和可靠的血清学指标E. 进行甲型肝炎流行病学调查26. 人喉癌上皮细胞A. MDCKB. VeroC. MA104D. Hep-2E. HeLa与所列英文名称相对应的细胞是27. 0.1%高锰酸钾用于A. 新生儿预防淋菌性眼结膜炎B. 皮肤黏膜消毒C. 冲洗尿道进行消毒D. 自来水消毒E. 针对SARS冠状病毒进行空气消毒28. HBeAgA. 检测为阳性说明机体感染了HBVB. 检测为阳性时说明体内产生免疫力C. 检测为阳性时说明病毒在复制D. 乙肝检测"两对半"指标中不包括E. 表明机体处于感染恢复期29. 冻干保存方法用于A. 保存短期使用的工作菌种（3～6个月）B. 长期保存菌种（>10年）C. 长期保存菌种（小于10年）D. 短期保存菌种（1个月）E. 保存脑膜炎奈瑟菌。

分子生物学方法鉴定微生物

③ 核酸探针
广泛用于微生物鉴定、传染病诊断、流行病调查、食品卫生微生物检测以及分子生物学许多领域。所谓核酸探针(probe)是指能识别特异核苷酸序列的、带标记的一段单链DNA或RNA分子。因此，一种核苷酸片断能否作为探针用于微生物鉴定，最根本的条件是它的特异性，即它能与所检测的微生物的核酸杂交而不能与其他微生物的核酸杂交。根据特异性的不同，在微生物鉴定与检测中的作用也不同，有的探针只用于某一菌型的检测，有的可能用于某一种、属、科甚至更大类群范围的微生物的检测或鉴定。例如，从一株淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)隐蔽性质粒制备的DNA探针，它具有种的特异性，可用来检测和鉴定这种引起人类性行为传播疾病的细菌。
16S rDNA微生物鉴定流程
培养微生物提取基因组DNA rDNA序列测定
PCR扩增16S rDNA片段
分析比较
微生物之间的系统发育关系
从样品中分离提取总微生物DNA
从样品中提取微生物遗传物质DNA或RNA，这是进行PCR 扩增16S rRNA的前提。一种方法是直接提取总DNA，对易于培养的微生物可通过培养富集后再进行提取，另一种选择是提取微生物细胞中的 rRNA。RNA的提取技术相对于 DNA的提取较为复杂，一般多采用提取细胞总 DNA，但也可根据情况选择提取 rRNA。
微生物分子生物学鉴定
微生物分类学定义：按微生物的亲缘关系和进化规律把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群的科学。
微生物的鉴定

主要步骤：纯化、测定一系列必要的指标、查找权威性鉴定手册鉴定方法分四个水平：
1. 细胞的形态和习性水平：形态特征、运动、酶反应、营养要求及生长条件等 2. 细胞组分水平：细胞壁成分、氨基酸库、脂类、醌类、光合色素等的分析 3. 蛋白质水平：氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等 4. 基因或DNA水平：核酸分子杂交、（G+C）mol%、转化和转导、16SrRNA寡核苷酸族分分析、DNA或RNA 核苷酸序列分析等

第十六章分子流行病学

疾病诊断及分布，疾病易感性、环境危险因素研究，健康状态评价，人类学研究等
蛋白类
蛋白质结构、表达量及功能活性
疾病诊断及分布，疾病易感性、环境危险因素研究，健康状态评价等
酶类
酶的结构、表达量及功能活性
同上
抗原抗体类
疾病特异抗原、抗体
疾病诊断及分布，疾病易感性，环境危险因素研究等
其他类
糖类、脂类、激素类、多胺类、细胞因子类等
三、效应测量
传染病慢性非传染病健康状态
免疫效应病理性效应
基因表达和代谢异常基因突变或染色体畸变
四、易感性测量
遗传性疾病 Huntington病应用分子流行病学方法很快确定了HD基因紧密连锁遗传位点D4S10及其DNA标志慢性非传染病载脂蛋白E(apoE)不同基因型在动脉粥样硬化和冠心病发病中易感性不同传染病不同基因特征的人群对HIV的易感性差异很大
Molecular epidemiology is a branch of epidemiology that combines theories and methods in both epidemiology and molecular biology. What defines molecular epidemiology, as opposed to conventional epidemiology, is its use of biological and in particular genetic markers as a measure of the propensity of developing a disease or as an indicator of a disease or an exposure in the study of the distribution and cause of disease.

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。

人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。

对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。

多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。

其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。

下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。

PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。

其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。

由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。

用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。

应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。

Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。

兽医生物制品学ppt课件

二、核酸图谱分析

核酸图谱分析包括核酸电泳图谱、核酸酶切图谱、寡核苷酸指纹图谱等。适用于这些诊断技术的试剂，主要是核酸提取、酶切、电泳等生化和分子生物学试剂，商品化程度已很高。
（一）核酸电泳图谱分析

核酸电泳图谱是指分离纯化的核酸，由于分子量的差异而在电泳中迁移速率不同，形成不同的带型。通过带型异同度的分析可确定生物体间的遗传关系。质粒图谱分析和RNA图谱分析都是电泳图谱分析。 1．质粒图谱分析质粒是细菌细胞内能自主复制的染色体外的DNA，它是耐药性、毒力因子等特殊遗传特性的载体。多数细菌往往含有大小和数量不等的质粒，具有相对稳定性，因此质粒图谱分析是细菌分型和流行病学的重要工具，具有诊断价值。该法简便、特异、快速、可靠，缺点是对一些无质粒或质粒不稳定的菌株，以及质粒分子量相同而核苷酸序列不同的菌株无分辨能力。
一
二：基因探针的标记方法
1.放射性探针的标记法缺口平移标记法：在适当浓度的DNaseⅠ作用下，在双链DNA上随机造成3’-OH端缺口，而大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有修补缺口的能力，其具有 5’→3’外切酶活性，在缺口处按5’→3’方向切除单核苷酸；同时有5’→3’的聚合酶活性，在缺口处3’ 端加入底物中的单核苷酸，因而可从切口的5’除去核苷酸并与3’端核苷酸的加入同时进行，以互补的DNA单链为模板合成新的DNA，这时在反应液中加入一种或多种标记的核苷酸（P-32,H3）,从而形成高放射性的DNA探针
（一）核酸探针制备技术
基因探针的获取二 1. cDNA探针：通过提取纯度较高的相应的 mRNA,反转录成相应的cDNA，再利内切酶不完全水解，从而得到许多片段，选取长度在15-20kb的片段重组到噬菌体中，经过体外包装，再转录到大肠杆菌，在固体培养基上可得到许多噬菌斑，然后用菌斑原位杂交筛选含有目的的基因作为探针。 3. 寡核苷酸探针：人工合成低于50个核苷酸的任意序列的寡核苷酸片段作为探针

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寡核苷酸图谱分析
寡核苷酸图谱分析是指核酸或核酸片段经T1核酸酶切割后电泳，少数较大分子量的酶切核酸片段在聚丙烯酰胺凝胶上分布特点的比较。

因为它是通过少数核酸片段来了解整个核酸的特征，如同根据指纹特点判断案情一样，因此又称为指纹图分析(Analysis of fingerprint map)。

该法最大优点为比较简便，敏感性高，能显示出核酸间细小的差别，但缺点是无法对差别大的两条来源不同的核酸进行比较。

目前该种方法已在病毒学研究中得到了广泛的应用，特别是对RNA病毒分类、鉴定病毒遗传变异等，在流行病学调查中具有重要意义。

(一) 原理提纯后的病毒核酸，通过适当的酶切，可产生大小不同的片段，经放射性同位素标记(或在病毒培养时标记)后，进行垂直双相电泳，再经放射自显影，可得到特征性的图谱，即寡核苷酸指纹图谱。

所用的酶一般是T1核糖核酸酶，这种酶是一种RNA限制酶，特异性地作用于鸟嘌呤核苷酸的3’磷酸基团，切割与其邻近核苷酸相连的5’磷酯键，最终产物为带3’磷酸鸟嘌呤末端的寡核苷酸，即每断片的3’末端为鸟嘌呤并带有磷酸，而5’末端就暴露出羟基团。

然后在T4多核苷酸激酶的作用下，用32P－ATP标记寡核苷酸的5’末端，最后用饱和酚和酵母RNA混合液终止激酶的作用。

在pH3.5条件下，从上到下进行第一相电泳，依片段所带电荷的不同将其分开，其后在pH8.2条件下，从右到左进行第二相电泳，可根据片段长短的不同将其分开，通过自显影，便可在底片上看到片段的位置和数目，借此对不同的病毒株的核酸进行分析比较。

在电泳中一般采用两种指示剂：一种为溴酚蓝(BPB)，它的大小相当于8-10个核苷酸，在pH3.5时呈绿色，在pH8.2时呈蓝色；另一种为联苯胺(Xylene Cyanol，简称XC)，其大小相当于25个核苷酸，在pH3.5时为蓝色，pH8.2时为绿色，它周围的点为重点观察区。

由于 12-14个碱基以上的核苷酸片段特异性高，太短的片段特异性低，因此，图谱上部的斑点由于片段较小难以进行分析，多取图谱下端或整个图的下1/3处斑点进行比较，一般取50-70个斑点。

(二) 基本方法
1.病毒的增殖与核酸的提纯用适当的组织培养细胞繁殖病毒，有些病毒也可用鸡胚进行繁殖，以饱和酚法提纯病毒核酸。

2.核糖核酸酶切和同位素标记常用的酶是T1核糖核酸酶(故该技术又称为T1－寡核苷酸指纹图谱)，将该酶与病毒 RNA以一定比例混合，置37℃消化30-40分钟。

经消化后的核酸变为大小不等的片段，片段的大小与鸟苷酸的含量有关。

消化步骤为：于Eppendorf管中加入1?l去离子水，加1?g病毒RNA，加1?l 2倍浓缩的消化缓冲液( 40m mol/L pH7.5 Tris-HCl，2m mol/L EDTA )，置沸水中煮60-90秒，快速置冰浴中冷却，加入2?l T1酶(5IU/?l)，混合后置37℃水浴30-40分钟。

标记的方法有两种：一是内标记，即在病毒培养液中加入32P－正磷酸盐或32P－ATP，使增殖的病
毒中带有32P。

另一种方法是外标记(又称末端标记)，在经过消化后的核酸片段中加入32P-ATP和T4多核苷酸激酶，以标记片段5’端。

外标记方法为：于上述酶消化溶液中加入35?l激酶缓冲液(10m mol/ LTris－HCl，10m mol/ L Mg(OAC)2，1m mol/L DTT)，1?l T4多核苷酸激酶，10?l32P-ATP(比活性5000Ci/m mol)，混合后置37℃水浴30分钟。

3.反应终止及寡核苷酸的提取于上述反应物中加入100?l TSE饱和酚，混合，再加入中止混合物(用0.6mol/L醋酸氨配成2mg/ml的酵母RNA)终止激酶作用。

pH7.8的TSE缓冲液：
Tris 2.42g 最终浓度0.02mol/L
NaCl 8.77g 最终浓度0.15mol/L
EDTA(Na2) 0.74g 最终浓度0.002mol/L
用1N HCl(约12ml)调pH至7.8，补无离子水至1 000ml，高压消毒。

将上述终止后的溶液，轻摇混合后，11 000r/min离心3分钟，取上层水相，加入2.5倍冷无水乙醇，混合置-20℃过夜或-70℃30分钟，用12 000r/min离心15分钟，弃上清，干燥沉淀物(即核酸)。

4.电泳及自显影
指示染料的配制：以10ml为例
溴酚兰 10mg 终浓度：0.1％
联苯胺 10mg 0.1％
尿素 3.6g 6mol/L
蔗糖 1g 10％(W/V)
EDTA 2mg 50m mol/L
酵母RNA 100mg 10mg/ml
加无离子水至10ml
(1) 第Ⅰ相电泳将玻璃板(20×39cm)及梳子清洗干净，用10％丙烯酰胺，0.325％甲叉双丙烯酰胺注胶，电泳缓冲液为25mmol/L柠檬酸，6mol/L尿素，pH3.5。

待凝胶凝聚后，进行垂直式电泳，方向为从上到下，在4℃预电泳30-60分钟后，将制备好的干燥核酸片段加20?l指示染料溶解混匀点样，电泳至溴酚蓝泳动20cm时停止电泳。

此时可取下凝胶的一块玻璃板，用玻璃纸将胶包住、胶面朝上，于暗室中将X光底片放在胶面的玻璃纸上，在 X光底片上放一块比底片稍大的增强板，将另一块玻璃擦洗干净盖在增强板上，用黑纸包好以免透光，置4℃自显影1-2小时，然后于暗室取出底片冲洗，冲洗后底片上应见到从小到大的糖葫芦状黑点。

(2) 第Ⅱ相电泳将Ⅰ相的底片，根据所作记号与Ⅰ相凝胶对齐，沿着点的两边切出约 1cm宽的长条，长条长约20cm(从指示剂XC上端8cm，至下端12cm)，切下的胶条放在准备好的玻璃板上，摆直放平，用滤纸将胶条残余水吸干，摆好间条，放上另一准备好的玻璃板，固定两层玻板后即可灌胶。

凝胶浓度为21.8％丙烯酰胺，0.8％甲叉双丙烯酰胺，电泳缓冲液为0.1mol/L Tris－硼酸，
2.5mmol/L EDTA，pH8.3。

凝胶聚合后直接在室温下进行电泳，泳动方向为由Ⅰ相胶条端向另一端泳动，当溴酚蓝运行20cm时，停止电泳。

取下凝胶进行自显影，方法与第Ⅰ相显影相同，显影时间取决于同位素强度和实验目的。

最好使用分辨率较高的核子乳胶片。

(三) 结果分析在Ⅱ相胶自显影前先观察XC和BPB两个指示剂的距离(应与Ⅰ相胶条中一样)。

如距离太小，有的点可能重叠，增长了，有的点可能从胶两旁跑掉。

XC标记周围约50－70个点为重点比较区，而BPB周围点一般仅作参考。

为证实某一或某数点是否是某毒株核酸独有的，须进行混合电泳。

即将两个毒株的32P－ATP标记核酸等量混合，与非混合样品同时进行电泳，进行比较，如某一点为两毒株共有的，就在相应位置上出现一个点，否则出现两个点。

两个或两个以上毒株比较时，常以其中一株为标准株，其余的为比较株。

凡标准株寡核苷酸图中出现的点，而其他毒株没有，表示片段丢失；凡标准株没有的点，而其他毒株出现了，表示片段增加。

最后统计出共增加了多少点，丢失了多少点。

因此根据两个毒株的图谱中点的相似情况以及斑点消失和增加数目，可推测两毒株核酸的同源性。

从理论上讲，点丢失的最高数与增加数是对等的，即大片段点增加是由小片段点改变而来。

将丢失和增加点数相加除以2，乘以系数1.5(根据统计学假定，这种成对改变50％是由于单一点改变而来，50％可能是各自突变而来)，加上不成对的点数即成对后剩下的数，用以表示毒株的大致关系，如一个毒株与另一毒株相比时，丢失6个点，增加了4个点，那么它们之间鸟嘌呤碱基改变的最少数应为，4×1.5＋2＝8。

(四) 应用形态学和血清学的方法可用于鉴定病毒的血清型，在某些情况下可鉴定病毒亚型，但不能区别同一血清型或亚型的不同病毒株和分离物，而寡核苷酸指纹图谱技术可以进一步区别它们，这对在自然条件下容易变异的病毒是很有价值的。

Kusters，J.G.等对12株分离自荷兰的传染性支气管炎病毒进行寡核苷酸指纹图谱分析，结果将它们分为两组，并提出第一组中的3个分离株V1259 、V1385 、V1397是疫苗株H52和H120的突变株。

70年代后期分离的6株在血清型上和基因型上都与疫苗株(H52和H120 )无关，说明是自然突变株。

Clewley等对分离的13株传染性支气管炎病毒进行研究，泳出了11种不同的寡核苷酸指纹图谱。

不同血清型的毒株，图谱明显不同，而同一血清型的不同毒株，指纹图谱也有差异，并发现某些分离物是疫苗株的突变种。

Karaca等对3株分离自肠道的传染性支气管炎病毒进行研究后认为，尽管这3株毒株是从3个不同鸡群分离出的，但它们的寡核苷酸指纹图谱却几乎相同，且与Conn－46株的指纹图谱很相似，故此认为这3株病毒是由Connecticut毒株的基因突变而来的，并且推测是决定血清型的S1蛋白基因突变所致。

Hori等用该技术分析了1935－1984年从日本和泰国分离的12株日本脑炎病毒的核酸基因组。

结果表明，所有的日本毒株都有某些共同的斑点，并且在相近的年份分离的毒株相似率更高。

在同一年份、同一地区分离的毒株则极为相似。

并发现在这两个地理位置上相隔较远的国家，日本脑炎病毒经历了各自不同的基因突变和选择过程。

Rekik 等对8株分离的禽呼肠孤病毒和1株S1133疫苗株进行寡核苷酸指纹图谱分析，结果表明，分离株之间基因组同源性较强，其中5株与疫苗株的图谱非常相似，但可以明显地区别开。

从而可检查出。